Multienzimático de detección sistemática mediante un sistema de cribado genético de la enzima de alto rendimiento

El objetivo general de esta metodología es evaluar múltiples enzimas utilizando un único sistema de cribado de alto rendimiento. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de los microorganismos y la bioingeniería sobre el cribado metagenómico y la ingeniería enzimática. Hemos desarrollado un sistema de cribado genético de enzimas que consiste en el compuesto de fenileno que responde al mutante MPL y su reportero GFP posterior.

Una vez que cualquier gen metagenómico muestra la actividad enzimática de nuestro interés al reaccionar con el sustrato proporcionado, un compuesto de fenileno del producto de reacción activa el mutante Dmp y desencadena la expresión del reportero GFP que puede ser fácilmente capturado por un medidor de fluorescencia. La principal ventaja de esta técnica es que, a diferencia de las técnicas de cribado convencionales, este método único es aplicable para el cribado de múltiples tipos de enzimas diferentes mediante el uso del sustrato adecuado. La demostración de este procedimiento estará a cargo de Kil Koang Kwon, un estudiante graduado en nuestro laboratorio.

Después de construir una biblioteca metagenómica en E. Coli con un vector fosmid utilizando un kit de producción de bibliotecas fosmid, transporte el ADN pGESS (E135K) a las células de la biblioteca metagenómica. A continuación, almacene las celdas de la biblioteca transformadas a menos 70 grados centígrados y alícuotas de 20 microlitros. Para eliminar los falsos positivos, primero descongele una alícuota de célula de biblioteca metagenómica en hielo.

A continuación, inocular diez microlitros de las células descongeladas en dos mililitros de caldo de lisogenato que contiene ampicilina y cloranfenicol en un tubo de fondo redondo de 14 mililitros a 37 grados centígrados y 200 rpm durante cuatro horas. Mientras tanto, establezca los parámetros apropiados en la máquina FACS para leer las celdas de la biblioteca metagenómica en el software FACS predeterminado. Al final de la incubación, transfiera cinco microlitros de células a un mililitro de PBS en un tubo de fondo redondo de cinco mililitros.

A continuación, cargue la muestra de biblioteca diluida y ajuste la tasa de eventos a 1000 a 1500 eventos por segundo. Para generar un diagrama de dispersión de área de dispersión directa a escala logarítmica frente a un diagrama de dispersión de área dispersa lateral a escala logarítmica en una hoja de cálculo global, cree un diagrama de puntos y dibuje una puerta de polígono alrededor de los eventos singlete que contienen la población bacteriana. Para trazar un recuento de células frente a un histograma de área FITC a escala logarítmica, abra un histograma y ajuste el voltaje FITC de modo que el pico de la distribución en forma de campana sea inferior a diez a los dos del área FITC.

A continuación, abra otro diagrama de puntos para crear un área de dispersión hacia adelante a escala logarítmica frente a un gráfico de área FITC logarítmica y establezca una puerta de clasificación R2 entre más cinco y menos cinco por ciento de las celdas desde el centro de la distribución. Cuando se hayan colocado todas las compuertas, coloque un tubo de recolección que contenga 1,2 mililitros de caldo de lisogenato suplementado con antibióticos en la salida del instrumento FACS y clasifique una vez diez a la sexta de las celdas compuertas en el caldo. Al final de la clasificación, tape el tubo de recolección y haga un vórtice suave de las células.

Para seleccionar las enzimas metagenómicas de interés, incube las células clasificadas a 37 grados Celsius y 200 RPM hasta que el OD600 alcance 0.5, luego agregue un microlitro de solución de inducción de copias para amplificar el número de copias de fósmidos intracelulares. Después de tres horas a 37 grados centígrados y 250 RPM, combine 0,5 mililitros de las celdas con el sustrato apropiado en un tubo de fondo redondo de 14 mililitros hasta una concentración final de 100 micromolares. Luego incubar las muestras de control y experimentales a 37 grados Celsius y 200 RPM durante otras tres horas.

Mientras las muestras están temblando, configure los parámetros de la máquina FACS como se acaba de demostrar. Luego, agregue cinco microlitros de células de cada muestra en tubos individuales de fondo redondo de cinco mililitros que contienen un mililitro de PBS. A continuación, cargue las celdas de muestra y establezca la tasa de eventos en 1000 a 3000 eventos por segundo.

Cree un diagrama de dispersión de área de dispersión directa a escala logarítmica frente a un diagrama de dispersión de área de dispersión lateral a escala logarítmica y ajuste la puerta de dispersión R1 para abarcar las células bacterianas de evento singlete. A continuación, cree un diagrama de dispersión directa a escala logarítmica frente a un diagrama de dispersión de área FITC a escala logarítmica y establezca una puerta de clasificación R2 para que se detecte menos del 0,1 % de las celdas negativas. Ahora, cargue el tubo de muestra y reajuste la tasa de eventos a 1000 a 3000 eventos por segundo, según sea necesario.

A continuación, coloque un tubo de recogida que contenga 0,5 mililitros de caldo de lisogenato en la salida del instrumento FACS y recoja una vez diez hasta la cuarta de las celdas dentro de las compuertas R1 y R2. Cuando se hayan aislado todas las células, tape el tubo de recolección y haga un vórtice suave de las células. A continuación, esparcir 0,5 mililitros de las muestras recogidas en dos placas de agar de 90 milímetros que contenían caldo de lisogenato suplementado con antibióticos, y luego incubar las placas durante la noche a 37 grados centígrados.

En esta figura, se ilustra el protocolo de cribado demostrado, incluida la eliminación de los falsos positivos mediante la clasificación de negativos y la selección de aciertos positivos mediante las puertas de clasificación R1 y R2. Los resultados se pueden evaluar comparando la florescencia de la muestra con y sin el sustrato. En este cribado representativo mediado por acetato de p-nitroflio, la fluorescencia de las células tratadas con sustrato fue mayor que la de las células de control, lo que confirma cinco candidatos a lipasa en este experimento.

A pesar de las amplias distribuciones de estos tres candidatos a celulosa, se observan claras diferencias en la intensidad media de FITC de las poblaciones. Estos cuatro candidatos a fosfatasa también muestran altos niveles de florescencia en comparación con las células de control. Además, la actividad de la fosfatasa alcalina de los vectores insertados en orf puede confirmarse mediante citometría de flujo, observándose una señal de fluorescencia más fuerte para la enzima golpeada que para las células que llevan el plásmido vacío.

Es importante recordar que esta técnica se puede aplicar al cribado de una amplia gama de enzimas eligiendo un sustrato adecuado y una concentración de ración. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la secuenciación de próxima generación, para responder preguntas adicionales sobre la identificación y caracterización de la enzima candidata de una manera de alto rendimiento. Después de su desarrollo, esta técnica de cribado enzimático de alto rendimiento allanó el camino para que los investigadores en el campo de la ingeniería enzimática exploraran varias enzimas metagenómicas sin necesidad de una especificidad enzimática.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar el sistema de detección de alto rendimiento basado en circuitos metogénicos con una amplia gama de objetivos enzimáticos.