Determinación de la estructura y coordinación de complejos péptido-metal mediante RMN 1D y 2D ¹h

El objetivo general de este procedimiento es determinar la estructura de un péptido mimético de proteína chaperona metálica complejado con cobre. Esto se logra primero preparando la muestra en un ambiente libre de oxígeno. El segundo paso consiste en adquirir los datos de resonancia magnética nuclear o espectroscopía de RMN que muestren las interacciones entre átomos de hidrógeno.

A continuación, las interacciones espaciales se proyectan sobre una plantilla peptídica lineal. El paso final consiste en hallar una estructura representativa de baja energía que se ajuste a los datos. En última instancia, las estructuras obtenidas por RMN se utilizan para determinar el modo de unión y para realizar un análisis estructural del complejo unido al cobre.

La principal ventaja de esta técnica frente a técnicas existentes como la cristalografía de rayos X es que puede utilizarse para examinar complejos de unión débil, así como moléculas y complejos que no cristalizan. Aunque este método puede proporcionar información sobre proteínas que se unen al cobre, también puede aplicarse a otros sistemas, como otras chaperonas metálicas, para estudiar cómo las proteínas permiten la entrega segura de iones metálicos esenciales, aunque potencialmente tóxicos, en el entorno de la línea celular.

Para comenzar, prepare las muestras en un ambiente libre de oxígeno para evitar que el cobre se oxide. Para preparar la muestra APO, disuelva aproximadamente uno a dos miligramos del péptido en 450 a 500 microlitros de disolvente deuterado para RMN de grado analítico. Para la muestra con cobre reaccionado, disuelva la misma cantidad que el péptido APO con una cantidad molar EQU de sal metálica en 450 a 500 microlitros del disolvente para RMN. Filtre cada solución utilizando papel de filtración de vidrio central o cualquier otra técnica adecuada para los compuestos bajo estudio que no los absorba. Esto es esencial para eliminar cualquier partícula metálica, ya que afectaría la homogeneidad.

Transfiera las soluciones a tubos de RMN y cierre las muestras en los tubos. Antes de salir de la caja de guantes, saque las muestras de la caja de guantes y séllelas. Registre los espectros de protones unidimensionales de las muestras APO y las reaccionadas con cobre en el equipo de RMN y compárelos.

El péptido APO es flexible y muestra un promedio de conformaciones, pero al reaccionar con cobre, las amidas del péptido unido presentan una estructura más rígida. Por lo tanto, el espectro del péptido que contiene cobre debería mostrar un cambio significativo en el desplazamiento químico en la región de las amidas, y los picos pueden volverse más resueltos. Configure experimentos optimizados de NMR TOCSY, NOESY o ROESY bajo condiciones idénticas a las descritas en el protocolo del texto y ejecútelos en secuencia.

Realice experimentos unidimensionales entre cada experimento para asegurarse de que la composición de la muestra permanezca constante durante toda la adquisición de datos. Después de procesar los datos según se describe en el protocolo escrito, prepare un conjunto de espectros cozy y to superpuestos sobre el espectro noea y rosy. Para asignar todos los picos NOE en el espectro.

Comience asignando los picos que se solapan con señales de toxis en la región de huella digital. Dado que esto facilitará las entradas posteriores de asignación de picos, en el programa Sparky registre los picos asignados y tradúzcalos de los valores de acoplamiento H alfa a amida proteica en ángulos diedros. Asimismo, traduzca los picos en restricciones de distancia integrando los picos dentro del programa y traduciéndolos mediante una interacción de distancia conocida.

Si los picos se superponen o no pueden utilizarse métodos automáticos de integración, los picos pueden etiquetarse visualmente como fuertes, medianos, débiles o muy débiles, y estas designaciones pueden traducirse en distancias de hasta 2,5; 3,5; 4,5 y 5,5 angstroms, respectivamente. Importe las restricciones de distancia y los ángulos diedros con el formato correcto para Explore. Explore buscará en el espacio conformacional para encontrar estructuras que cumplan con la geometría química canónica.

Además de las restricciones de distancia encontradas experimentalmente, genere un conjunto en el que ninguno de estos parámetros se viole. Esto constituirá el conjunto inicial. Realice la primera corrida de determinación de estructura sin utilizar ninguna restricción sobre el metal para identificar qué residuos participan en la unión al metal sin ningún sesgo.

Introduzca gradualmente las restricciones para facilitar la identificación de errores en la asignación, así como en la energía de NOE y los parámetros de simulación de flexión descritos en el protocolo del texto, antes de minimizar las estructuras mediante minimización de energía por gradiente conjugado durante 4.000 iteraciones. Cree un conjunto final, generalmente de 50 miembros, realizando la introducción de restricciones de forma iterativa sobre todo el conjunto y reporte el número de cada tipo de interacción de NOE encontrada. Finalmente, cree un conjunto de estructuras que cumplan con la geometría química canónica y las restricciones empíricas derivadas de RMN. Reporte el número total de conformaciones, el número de estas que presentan violaciones de las restricciones derivadas de RMN y el RMSD del conjunto completo, incluyendo tanto los valores de RMSD del esqueleto principal como de todos los átomos pesados.

Analice el conjunto de baja energía y determine qué cadenas laterales de residuos están en proximidad correcta entre sí para poder unirse al ion metálico. Una vez determinados estos, repita el análisis, incluyendo los datos de unión del cobre. Además de las restricciones de distancia derivadas de la RMN, agregue ahora restricciones de unión al metal para los residuos determinados.

Agregue parámetros adecuados para describir el ion metálico y su topología. Ingrese la información física apropiada, como masas, longitudes de enlace con otros átomos, ángulos y parámetros de repulsión no covalente, en el archivo de parámetros. Añada la información de enlace al archivo de topología.

Esta información incluye qué enlaces se forman y se rompen, y qué cargas formales cambian como resultado de la unión. Finalmente, obtenga un conjunto de estructuras como antes, ya que el conjunto resuelto representa el espacio conformacional adoptado por el péptido. Durante la medición de RMN, importe todas las conformaciones de la estructura al programa Mal Mall para crear un conjunto inicial.

Examine el conjunto para determinar la estabilidad local de la molécula. Determine los valores de RMSD del armazón y de las cadenas laterales seleccionando regiones subsiguientes de cuatro residuos a lo largo de la secuencia y haciendo que el programa calcule el RMSD respecto a la estructura de menor energía o al valor medio; determine qué regiones de la molécula muestran estabilidad local mediante la representación gráfica del RMSD local en función de la secuencia. Superponga el conjunto a lo largo de esta región de la molécula y utilice este conjunto para análisis posteriores. Elija las conformaciones de baja energía que cumplan con las restricciones derivadas de la RMN.

Estos formarán el registro del conjunto de baja energía y reportarán el número de confirmaciones en el conjunto, los criterios para seleccionarlas y los valores de RMSD. Si el modo de unión al metal aún no ha sido determinado, analice el conjunto de baja energía y determine qué cadenas laterales de residuos son incorrectas. Proximidad entre sí para poder unirse al ion metálico.

Utilice KYMERA para determinar las distancias intramoleculares entre átomos sospechosos de unión a metales. Calcule las distancias promedio en el conjunto una vez que se hayan determinado. Repita el análisis incluyendo los datos de unión de cobre.

Examine el conjunto y determine la estructura secundaria local dentro de la molécula utilizando los parámetros de búsqueda predeterminados del programa MAL mall. A continuación, importe el conjunto en kymera. Las estructuras secundarias se mantienen mediante enlaces de hidrógeno e indican regiones estables de la molécula.

Determine el enlace de hidrógeno utilizando la herramienta kymera. Continúe el análisis estructural según se describe en el protocolo de texto. Luego, sume todos los hallazgos estructurales para revelar cómo se refuerzan mutuamente. Para estudiar modelos de proteínas que se unen al cobre, se determinó por RMN en estado de solución la estructura de la secuencia de unión conservada de una proteína dentro del péptido lineal derivado, en la región de amida del péptido comprendida entre 6,7 y 8,5.

PP M mostró una expansión al reaccionar con cobre, de 6,6 a 9,0 PP M. El ensanchamiento de las líneas debido a una ligera oxidación del cobre es evidente en la línea base. Aquí se muestra una superposición de las regiones huella digital de los espectros de Roy Toxi y cozy del péptido unido al cobre. La muestra fue estable en el tiempo y los espectros estuvieron bien resueltos, y proporcionaron 81 interacciones NOE que se obtuvieron mediante un experimento rosy.

Dado que la molécula mostró interacciones NOE cercanas a cero en el experimento NO C, el conjunto del péptido derivado para la muestra reaccionada, pero sin utilizar restricciones para el metal, produjo 47 de 50 estructuras no válidas con un valor de RMSD de 1,44 y 2,07 angstroms en el esqueleto y los átomos pesados, respectivamente. De estas, se seleccionaron 13 conformeros de baja energía para un análisis posterior, con valores de RMSD de 0,25 y 0,61 angstroms en el esqueleto y los átomos pesados, respectivamente. El gráfico de RMSD local mostró una región de estabilidad entre los residuos tres y siete. Además de la región rígida del extremo C, que incluye un residuo de prolina, esta región se encuentra en una conformación de giro entre los residuos cuatro y siete en todas las conformaciones.

La confirmación del giro se estabiliza mediante enlaces de hidrógeno entre los donadores y aceptores del armazón de la glicina cinco y la alanina tres, así como entre la cisteína seis y la cisteína tres. Este giro también es evidente en la cisteína tres y la serina siete por los valores de acoplamiento reducidos en esta región. Las confirmaciones se superpusieron en esta región y se analizaron para posibles residuos de unión, considerando la cisteína tres, la cisteína seis y la metionina uno como residuos de unión potenciales.

La distancia más corta entre átomos de azufre fue la existente entre los grupos de folato de la cisteína tres y la cisteína seis; se introdujo la unión al cobre y el cálculo se repitió para obtener el conjunto utilizado en el análisis. El conjunto de baja energía del péptido unido al cobre muestra que la amina terminal está próxima al cobre unido. Aquí se muestra la isosuperficie de distribución del potencial electrostático, con el potencial positivo representado en azul y el potencial negativo en rojo.

El residuo de arginina se extiende desde el esqueleto del péptido, formando un lóbulo positivo de potencial electrostático, mientras que los rendimientos de carbono del esqueleto se disponen en línea, formando un potencial electrostático negativo menos prominente. Una vez dominado, un análisis estructural puede realizarse en aproximadamente una semana de tiempo de RMN y otros pocos días de procesamiento para obtener un conjunto de conformaciones que pueda utilizarse para el análisis estructural. Siguiendo este procedimiento, pueden analizarse otros mutantes del péptido y diferentes condiciones con el fin de responder preguntas adicionales sobre las condiciones necesarias para distintos grados de unión y liberación del ion cobre.