Determinación de la estructura y coordinación de complejos péptido-metal mediante RMN 1D y 2D ¹h

El objetivo general de este procedimiento es determinar la estructura de un péptido mimético de proteína chaperona Metallo complejado con cobre. Esto se logra preparando primero la muestra en un entorno libre de oxígeno. El segundo paso es adquirir los datos de la resonancia magnética nuclear o espectroscopia de RMN que muestran las interacciones entre los átomos de hidrógeno.

A continuación, las interacciones espaciales se asignan a una plantilla de péptidos lineal. El paso final es encontrar una estructura representativa de baja energía que se ajuste a los datos. En última instancia, las estructuras derivadas de RMN se utilizan para determinar el modo de unión y para realizar análisis estructurales en el complejo unido al cobre.

La principal ventaja de esta técnica sobre las técnicas existentes, como la cristalografía de rayos X, es que se puede utilizar para observar complejos de unión semanales y también moléculas y complejos que no cristalizan. Aunque este método puede proporcionar información sobre las proteínas de unión al cobre. También se puede aplicar a otros sistemas, como otros chaparrones metálicos, para estudiar cómo las proteínas permiten la entrega segura de iones metálicos esenciales, pero potencialmente tóxicos, en el entorno de la línea celular.

Para comenzar, prepare las muestras en un entorno libre de oxígeno para evitar que el cobre se oxide; para preparar la muestra de APO, disuelva aproximadamente de uno a dos miligramos del péptido en 450 a 500 microlitros de solvente de grado NMR deuterado para la muestra reaccionada con cobre, disuelva la misma cantidad que el péptido APO con una cantidad molar EQU de sal metálica en 450 a 500. Los microlitros del solvente de RMN filtran cada solución utilizando un papel de filtración de vidrio central o cualquier otra técnica que se adapte a los compuestos bajo investigación y no los absorba. Esto es esencial para eliminar cualquier partícula metálica, que afectará a la homogeneidad.

Transfiera las soluciones a los tubos de RMN y cierre las muestras en los tubos. Antes de salir de la guantera, saque las muestras de la guantera y séllelas. Registre los espectros de protones unidimensionales de las muestras de APO y cobre reaccionado en la máquina de RMN y compare.

El péptido APO es flexible y muestra un promedio de confirmaciones, pero al reaccionar con el cobre, las amidas peptídicas unidas tienen una estructura más rígida. Por lo tanto, el espectro peptídico que contiene cobre debería mostrar un cambio significativo en el cambio químico en la región amida, y los picos pueden resolverse. Configure experimentos de RMN optimizados, acogedores, tóxicos, entrometidos o rosados en condiciones idénticas a las descritas en el protocolo de texto y ejecútelos en secuencia.

Ejecute experimentos unidimensionales entre cada experimento para asegurarse de que la composición de la muestra permanezca constante durante la adquisición de datos. Después de procesar los datos como se discute en el protocolo de texto, prepare un conjunto de espectros acogedores y a superpuestos en el espectro de noea y rosado. Para asignar todos los picos NOE en el espectro.

Comience asignando picos que se superpongan a las señales de toxis en la región de las huellas dactilares. Como esto facilitará las entradas posteriores de asignación de picos con el registro del programa Sparky, los picos asignados traducen los valores de acoplamiento de H alfa a proteína amida en ángulos de Cedal. También traduzca los picos en restricciones de distancia integrando los picos desde dentro del programa y traduciéndolos utilizando una interacción de distancia conocida.

Si los picos se superponen o no se pueden utilizar métodos de integración automática, los picos se pueden etiquetar como fuertes, medios, débiles o muy débiles mediante estimación visual, y estas designaciones se pueden traducir a distancias de hasta 2,5, 3,5, 4,5 y 5,5 angstroms respectivamente. En la importación de las restricciones de distancia y los ángulos de dedal con el formato correcto para explorar. Explore buscará el espacio de confirmación para encontrar estructuras que se adhieran a la geometría química canónica.

Además de las restricciones de distancia encontradas experimentalmente para generar un conjunto en el que no se viole ninguno de estos parámetros. Este constituirá el conjunto inicial. Realice la primera ejecución de determinación de la estructura sin utilizar ninguna restricción al metal para encontrar qué residuos participan en la unión del metal sin ningún sesgo.

Introduzca las restricciones gradualmente para facilitar la identificación de errores en la asignación, así como la energía NOE y los parámetros de arrodillamiento simulados como se describe en el protocolo de texto antes de minimizar las estructuras utilizando la minimización de energía de gradiente conjugado para 4.000 iteraciones, crear un conjunto final de generalmente 50 miembros realizando la introducción de restricciones de manera iterativa en todo el conjunto, informe el número de cada tipo de interacción NOE encontrada. Por último, cree un conjunto de estructuras que se adhieran a la geometría química canónica y al informe de restricciones derivadas de RMN empírica. El número total de confirmaciones, el número de estas que tienen violaciones de las restricciones NM Rived y el RMSD de todo el conjunto, incluidos los valores de RMSD de la columna vertebral y todos los átomos pesados.

Analice el conjunto de baja energía y determine qué cadenas laterales de residuos están en la proximidad correcta entre sí para poder unirse al ion metálico. Una vez que se hayan determinado, repita el análisis, incluidos los datos de unión de cobre. Además de las restricciones de distancia derivadas de RMN, ahora agregue restricciones de unión de metales a los residuos determinados.

Agregue los parámetros apropiados para describir el ion metálico y su topología. Introduzca la información física adecuada, como las longitudes de enlace de masa con otros átomos, los ángulos y los parámetros de repulsión no enlazantes en el archivo de parámetros. Agregue la información de enlace al archivo de topología.

Esta información incluye qué bonos se forman y se rompen, y qué cargos formales se modifican como resultado de la vinculación. Finalmente, adquiera un conjunto de estructuras como antes, el conjunto resuelto representa el espacio de confirmación adoptado por el péptido. Durante la medición de RMN, importe todas las confirmaciones de la estructura al programa Mal Mall para crear un conjunto inicial.

Examine el conjunto para determinar la estabilidad local de la molécula. Determine los valores de RMSD de la columna vertebral y de la cadena lateral seleccionando las cuatro regiones de residuos subsiguientes a lo largo de la secuencia y haciendo que el programa calcule el RMSD a la estructura de energía más baja o la media, determine qué regiones de la molécula muestran estabilidad local trazando el RMSD local en función de la secuencia, superponga el conjunto a lo largo de esta región de la molécula y utilice este conjunto para un análisis más detallado. Elija confirmaciones de baja energía que se adhieran a las restricciones derivadas de la RMN.

Estos formarán el registro del conjunto de baja energía e informarán el número de confirmaciones en el conjunto, los criterios para elegirlas y los valores RMSD. Si aún no se ha determinado el modo de unión del metal, analice el conjunto de baja energía y determine qué cadenas laterales de residuos son incorrectas. Proximidad entre sí para poder unir el ion metálico.

Utilice KYMERA para determinar las distancias intramoleculares entre los átomos sospechosos de unión de metales. Calcule las distancias medias en el conjunto una vez que se hayan determinado. Repita el análisis, incluidos los datos de unión de cobre.

Examine el conjunto y determine la estructura secundaria local dentro de la molécula utilizando los parámetros de búsqueda predeterminados del programa del centro comercial MAL. A continuación, importe el conjunto a kymera. Las estructuras secundarias están sostenidas por enlaces de hidrógeno e indican regiones estables de la molécula.

Determine la unión de hidrógeno con la herramienta kymera. Continúe el análisis estructural como se detalla en el protocolo de texto. A continuación, sume todos los hallazgos estructurales para revelar cómo se refuerzan entre sí Para estudiar los modelos de proteínas de unión al cobre, la estructura de la secuencia de unión conservada de una proteína dentro del péptido lineal derivado se determinó mediante RMN en estado de solución, la región amida del péptido de 6,7 a 8,5.

El PP M mostró una expansión tras la reacción con el cobre a 6.6 a 9.0 PP M. El ensanchamiento de la línea debido a una ligera oxidación del cobre es evidente en la línea de base. Aquí se muestra una superposición de las regiones de las huellas dactilares de Roy Toxi y espectros acogedores del péptido unido al cobre. La muestra fue estable con el tiempo y los espectros estaban bien resueltos y dieron 81 interacciones NOE que fueron adquiridas por un experimento rosado.

Dado que la molécula dio interacciones NOE cercanas a cero en el experimento NOC, el conjunto del péptido derivado para la muestra reaccionada, pero sin usar restricciones para el metal, dio 47 de 50 no estructuras con un valor RMSD de 1,44 y 2,07 angstroms en la columna vertebral y los átomos pesados respectivamente. De estos, se eligieron 13 conformadores de baja energía para su posterior análisis, con valores RMSD de 0,25 y 0,61 angstroms en la columna vertebral y los átomos pesados, respectivamente. El gráfico RMSD local mostró una región de estabilidad entre los residuos tres y siete. Además de la región terminal C rígida, que incluye un residuo de proleno, esta región se encuentra en una confirmación de curvatura entre los residuos cuatro y siete en todas las confirmaciones.

La confirmación de la flexión se estabiliza mediante enlaces de hidrógeno entre los donantes y aceptores de la columna vertebral, la glicina cinco y tres, la anina dos, así como la cisteína seis y la cisteína tres. Esta curvatura también es evidente en la cistina tres y el seno siete por los valores de acoplamiento reducidos en esta región. Las confirmaciones se superpusieron sobre esta región y se analizaron para detectar posibles residuos de unión al considerar la cistina tres, la cistina seis y la metionina uno como posibles residuos de unión.

La distancia más corta entre el átomo de azufre y el átomo de azufre fue la que se produjo entre los grupos folato de la cisteína tres y la cisteína seis, se introdujo la unión al cobre y se repitió el cálculo para obtener el conjunto utilizado para el análisis. El conjunto de baja energía del péptido unido al cobre muestra que la amina terminal terminal terminal está próxima al cobre unido. Aquí se muestra la isosuperficie de distribución de potencial electrostático con potencial positivo en azul y potencial negativo en rojo.

El residuo de arginina se extiende desde la columna vertebral del péptido formando un lóbulo positivo de potencial electrostático, mientras que los rendimientos de carbono de la columna vertebral se disponen en una línea que forma un potencial electrostático negativo menos prominente Una vez dominado, se puede realizar una determinación estructural en aproximadamente una semana de RMN y otros días de trabajo para obtener un conjunto de confirmaciones que se pueden utilizar para el análisis estructural. Siguiendo este procedimiento, se pueden analizar otros péptidos mutans y diferentes condiciones para responder preguntas adicionales que aborden las condiciones requeridas para diferentes grados de unión y liberación del ion cobre.