Name: Determinación de la estructura y coordinación de complejos péptido-metal mediante RMN 1D y 2D 1h (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 44 s
Description: Aprenda a determinar la estructura de péptidos modelo de metaloaperonas unidos a cobre mediante espectroscopía de RMN 1D y 2D. Este protocolo detalla la preparación de muestras sin oxígeno, la adquisición de datos y el análisis estructural.

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Agradecemos al Programa de Ciencia de la Frontera Humana (beca para jóvenes investigadores (RGY)0068-2006) por su apoyo financiero.

1. Preparación de la muestra
<ol>
	<li>Apo-muestra: Disolver aproximadamente 1-2 mg del péptido en 450-500 μl de disolvente de grado RMN deuterado (las soluciones preferibles para muestras biológicas son D2O al 10% en agua o d6-DMSO 11-12 si la muestra no se disuelve en agua o reacciona con ella).</li>
	<li>Muestra reaccionada con cobre: Disuelva aproximadamente 1-2 mg del péptido con una cantidad equimolar de sal metálica en 450-500 μl del disolvente de RMN.</li>
	<li>Filtre la solución utilizando un vidrio sinterizado, papel de filtración o cualquier otra técnica que se adapte a los compuestos bajo investigación y no los adsorba. Esto es esencial para eliminar cualquier partícula metálica, que afectará a la homogeneidad.</li>
	<li>Transfiera la solución a un tubo de RMN y ciérrelo. Asegúrese de que la calidad del tubo se ajuste a la fuerza del imán utilizada (para obtener más detalles, consulte la tabla de equipos).</li>
	<li>Si la muestra es sensible al oxígeno, estos pasos deben realizarse en un entorno inerte y el tubo debe sellarse para evitar la oxidación.</li>
</ol>
2. Recopilación y procesamiento de datos de RMN13
<ol>
	<li>Registre los espectros 1D 1H de las muestras reaccionadas con apo y cobre y compárelos. El espectro de péptidos que contienen cobre debería mostrar un cambio significativo de cambio químico en la región de amida y los picos se resolvieron ya que el apopéptido es flexible y muestra un promedio de conformaciones, pero al reaccionar con el cobre, las amidas de péptido unido tienen una sola estructura (Figura 2).
	<ol>
		<li>Si el espectro no cambia, se supone que la reacción ha fallado.</li>
		<li>Si la muestra se vuelve verde, el cobre se habrá oxidado en la atmósfera, lo que puede cambiar sus propiedades de unión.</li>
		<li>En ambos casos, será necesario rehacer la muestra.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Encuentre las condiciones óptimas de temperatura para las mediciones de RMN que proporcionen una superposición mínima de los residuos de amida con anchos de línea estrechos.</li>
	<li>Configure los experimentos de RMN COSY14, TOCSY15 y NOESY16 o ROESY17 en condiciones idénticas (temperatura, pH, etc.) y ejecútelos en secuencia.
	<ol>
		<li>Los experimentos COSY (Figura 3) y TOCSY (Figura 4) detectarán interacciones a través del enlace de interacciones protón-protón adyacentes y vecinas de mayor alcance, respectivamente. El espectro COSY proporciona información sobre las correlaciones HN-Hα, mientras que el espectro TOCSY proporciona, además, información sobre HN y otros protones alifáticos H de residuos correlacionados.</li>
		<li>Los experimentos NOESY y ROESY (Figura 5) detectan la proximidad a través del espacio sin depender de los enlaces para proporcionar información estructural. La elección entre los dos se realiza de acuerdo con el tamaño efectivo del compuesto y la intensidad de campo. Algunas de estas combinaciones dan señales teóricas de cero (Figura 6) y será necesario realizar un experimento ROESY para detectar las interacciones NOE10,18.</li>
		<li>Si la muestra está en agua, los experimentos deben tener un componente de supresión de agua. Esto se logra de manera más eficiente utilizando gradientes19. En este caso, es ventajoso volver a ejecutar la muestra, una vez asignada, en D2O puro para obtener interacciones hacia y entre los hidrógenos Hα.</li>
		<li>Optimice la duración de los tiempos de mezcla TOCSY y NOESY o ROESY mediante la ejecución de una serie de experimentos cortos para encontrar la máxima acumulación de señal con una pérdida mínima en la difusión del espín. Asegúrese de que esta sea la región lineal de la curva de acumulación. Los valores comunes para los péptidos en campos de 600 MHz incluyen tiempos de mezcla de alrededor de 100 mseg para TOCSY y 150 mseg para los experimentos NOESY o ROESY.</li>
		<li>Ejecute experimentos 1D entre cada experimento para asegurarse de que la composición de la muestra permanezca constante durante la adquisición de datos (Figura 7).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Procese los espectros utilizando las funciones de apodización apropiadas para obtener la máxima resolución con una pérdida mínima de intensidad de la señal, agregando relleno cero en la dimensión t1.
	<ol>
		<li>Corrija aún más la línea de base en la dimensión F2 y luego F1 con una función polinómica cuadrática.</li>
		<li>Calibrar cuidadosamente el desplazamiento químico de los espectros de acuerdo con los picos de agua residual o DMSO en los disolventes respectivos de acuerdo con su cambio de los estándares conocidos (TMSP o TMS, respectivamente).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Asignación de picos e integración con SPARKY20
<ol>
	<li>Prepare un conjunto de espectros COSY y TOCSY superpuestos en el espectro NOESY o ROESY (Figura 8).</li>
	<li>Asigne todos los picos NOE en el espectro de acuerdo con la metodología de asignación secuencial desarrollada por Wüthrich21.
	<ol>
		<li>Comience con la asignación de picos que se superpongan a las señales TOCSY en la región de huellas dactilares, ya que esto facilitará las entradas posteriores de asignación de picos con el programa SPARKY (Figura 9). Registre el desplazamiento químico de la asignación (Figura 10) y los valores de 3JHNHα (Figura 11).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Traslade los picos en restricciones de distancia y los valores de 3JHNHα en ángulos diedros.
	<ol>
		<li>Esto se puede hacer integrando los picos desde dentro del programa y traduciéndolos en restricciones de distancia utilizando una interacción de distancia conocida (como la distancia entre dos protones del grupo metileno o átomos de hidrógeno aromáticos de un aminoácido aromático).</li>
		<li>Si los picos se superponen y no se pueden utilizar métodos de integración, se pueden etiquetar como fuerte-medio-débil-muy débil mediante estimación visual, y estas designaciones se pueden traducir en distancias de hasta 2,5, 3,5, 4,5 y 5,5 Å, respectivamente. Esto es más efectivo en el trabajo con péptidos.</li>
		<li>3JLos valores de HNHα son indicativos de ángulos diedros según la ecuación de Karplus, donde la mayoría de los valores de acoplamiento dados pueden resultar de más de un ángulo diedro. Estos pueden ser indicativos de estructura secundaria (hélices o láminas), bobina aleatoria o promedios conformacionales de la misma. Por lo tanto, es importante utilizar las restricciones con cuidado, o utilizarlas como confirmación de los resultados conformacionales.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Cálculos de Mecánica Molecular para Generar Conjuntos de Estructuras usando XPLOR22
<ol>
	<li>Importe las restricciones de distancia y los ángulos diedros con el formato correcto para XPLOR. (Figura 12, solo restricciones inter-residuales). XPLOR buscará en el espacio conformacional para encontrar estructuras que se adhieran a las restricciones químicas geométricas canónicas, como longitudes de enlace, ángulos, quiralidad, etc., además de las restricciones de distancia encontradas experimentalmente, para generar un conjunto en el que no se viole ninguno de los parámetros anteriores. Este constituirá el conjunto inicial.</li>
	<li>La primera ejecución de determinación de la estructura se realizará sin utilizar ninguna restricción para el metal. Esto mostrará qué residuos participan en la unión de metales sin ningún sesgo. Vaya al paso 4.4.</li>
	<li>Además de las restricciones de distancia derivadas de la RMN, agregue restricciones de unión de metales a los residuos determinados.
	<ol>
		<li>Agregue los parámetros apropiados para describir el ion metálico y su topología.</li>
		<li>La información física apropiada (masa, longitudes de enlace con otros átomos, ángulos y parámetros de repulsión no enlazantes) debe introducirse en el archivo de parámetros.</li>
		<li>Agregue la información de enlace al archivo de topología: qué enlaces se forman y se rompen y qué cargos formales se modifican como resultado del enlace.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Crea un pequeño conjunto de 10 miembros.
	<ol>
		<li>Introduzca las restricciones gradualmente, comenzando con las interacciones de red troncal a red troncal, luego de la red troncal a la cadena lateral, luego de la cadena lateral a la cadena lateral, y pasando de interacciones intra-residuales secuenciales a interacciones de mayor alcance. Esto facilita la identificación de errores en la asignación.</li>
		<li>Introducir la energía NOE como un potencial de pozo cuadrado con una constante de fuerza constante de 50 kcal/mol•Å2. El recocido simulado debe realizarse con 1.500 pasos de 3 fsec a 1.500 K y 3.000 pasos de 1 fsec durante el enfriamiento a 500 K. Por último, minimice las estructuras utilizando la minimización de energía de gradiente conjugado durante 4.000 iteraciones; estas son variables que se pueden cambiar dentro de XPLOR.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Crea un conjunto final de 50 miembros. Realice los pasos del paso 4.4 en todo el conjunto.
	<ol>
		<li>Indique el número de cada tipo de interacción NOE que se encontraron, como se muestra en la Figura 13.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cree un conjunto de estructuras que se adhieran a la geometría química canónica y a las restricciones empíricas derivadas de la RMN.
	<ol>
		<li>Notifique el número total de conformaciones, el número de estas que tienen violaciones de las restricciones derivadas de RMN y el RMSD de todo el conjunto, tanto la red troncal como todos los valores de RMSD de átomos pesados.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Análisis de la estructura
<ol>
	<li>El conjunto resuelto representa el espacio conformacional adoptado por el péptido durante la medición de la RMN. La flexibilidad local puede cambiar en diferentes regiones de la molécula y esto puede atribuirse a razones estructurales o funcionales (el propósito del análisis estructural es determinar la base estructural de la estabilidad y el mecanismo de acción).
	<ol>
		<li>Importar todas las conformaciones de la estructura al programa MolMol23 para crear un conjunto inicial (Figura 14).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Examine el conjunto para determinar la estabilidad local de la molécula.
	<ol>
		<li>Determine los valores de RMSD de la red troncal y de la cadena lateral seleccionando las regiones subsiguientes de cuatro residuos a lo largo de la secuencia y haciendo que el programa calcule el RMSD a la estructura de energía más baja o a la media.</li>
		<li>Determine qué regiones de la molécula muestran estabilidad local (Figura 15) trazando el RMSD local en función de la secuencia.</li>
		<li>Superponga el conjunto a lo largo de esta región de la molécula y utilice este conjunto para análisis posteriores (Figura 16).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Elija conformaciones de baja energía que se adhieran a las restricciones derivadas de RMN (no infringidas). Estos formarán el "conjunto de baja energía".
	<ol>
		<li>Indique el número de conformaciones en el conjunto, los criterios para elegirlas y los valores RMSD definidos en el paso 4.6.1.</li>
		<li>Si ya se ha determinado el modo de encuadernación de metales, continúe con el siguiente paso. De lo contrario: Analice el conjunto de baja energía y determine qué cadenas laterales de residuos están en la proximidad correcta entre sí para poder unirse al ion metálico. Una vez que se hayan determinado, regrese al paso 3.3 y vuelva a realizar el análisis incluyendo los datos de unión al cobre (Figura 17 para el conjunto y Figura 18 para el conformador de baja energía).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Examine el conjunto y determine la estructura secundaria local dentro de la molécula utilizando los parámetros de búsqueda predeterminados del programa MolMol. Las estructuras secundarias se mantienen mediante enlaces de hidrógeno e indican regiones estables de la molécula.
	<ol>
		<li>Determine la estructura secundaria de cada conformador (Figura 19).
		<ol>
			<li>Cree una tabla con el porcentaje de conformadores del conjunto que muestran cada estructura secundaria.</li>
			<li>Determine si las regiones de la estructura secundaria se superponen a las regiones que se determinaron como regiones estables mediante local-RMSD. Este suele ser el caso.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Determine las distancias y los enlaces de hidrógeno dentro de la molécula.
	<ol>
		<li>Importa el conjunto a Chimera24.</li>
		<li>Utilice Chimera para determinar las distancias intramoleculares entre los átomos sospechosos de unión de metales. Calcular las distancias medias en el conjunto.</li>
		<li>Utilice Chimera para determinar los enlaces de hidrógeno intramoleculares en cada conformador del conjunto (Figura 20), utilizando los parámetros de enlace de hidrógeno relajados predeterminados (en un 20%) del programa.</li>
		<li>Cree una tabla del porcentaje de conformadores del conjunto que muestran cada enlace de hidrógeno. Los enlaces de hidrógeno que se repiten en la mayoría de las conformaciones indican un enlace estable que se suma a la estabilidad de la estructura.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Determinar las interacciones electrostáticas dentro de la molécula.
	<ol>
		<li>Identifique las interacciones entre cadenas laterales cargadas.</li>
		<li>Cree una tabla del porcentaje de conformadores del conjunto que muestran cada interacción electrostática.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Calcule la distribución de potencial electrostático utilizando el campo de fuerza Amber25 dentro del programa Delphi26.
	<ol>
		<li>Elija una sola conformación representativa del conjunto en la que realizar los cálculos de potencial electrostático.</li>
		<li>Derivar el potencial electrostático utilizando la ecuación de Poisson-Boltzman y un cálculo de Coulombic completo. Los parámetros requeridos incluyen la fuerza iónica de la solución, los valores dieléctricos de la solución (80 para agua; 40 para DMSO); el péptido interno (generalmente alrededor de 5.0); el tamaño de la cuadrícula (normalmente 65'65'65 puntos); y la distancia mínima entre el péptido y el borde de la rejilla (10 Å). Los resultados suelen ser bastante robustos con respecto a estos valores, ya que el resultado principal está gobernado por el propio péptido (Figura 21).</li>
		<li>Examine el potencial electrostático mapeado en la superficie de Van der Waals del péptido (Figura 22).</li>
		<li>Examine las isosuperficies de potencial electrostático, que describen posiciones que tienen el mismo potencial. Encuentre isosuperficies que sugieran relevancia biológica, como superficies positivas o negativas extendidas que podrían atraer o repeler otras proteínas o ligandos, o distribuciones que indiquen importancia, como distribución anfipática o parches de diferentes propiedades (Figura 23).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Resume todos los hallazgos estructurales para ver cómo se refuerzan entre sí.</li>
	<li>Repita los pasos 4.3 a 5.7.4 cuando corresponda.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

La contribución de la información estructural para comprender los mecanismos de unión es bien aceptada. Los péptidos son útiles como modelos para la unión e interacciones de proteínas; sin embargo, no son susceptibles al método principal para la determinación de la estructura, la cristalografía de rayos X. La RMN es particularmente útil para estos sistemas, ya que las estructuras se pueden resolver fácilmente en solución. Esto es especialmente para el caso de los miméticos de metalochaperonas que además requieren la dete...

Los péptidos son ampliamente utilizados como modelos de proteínas, posibles pistas de fármacos y agentes terapéuticos por derecho propio. Sin embargo, su pequeño tamaño y alto grado de flexibilidad a menudo impiden la determinación de la estructura por rayos X debido a las dificultades en la cristalización.
La resonancia magnética nuclear (RMN) se puede utilizar para determinar las estructuras e interacciones de los péptidos. El método puede proporcionar información sobre la estructura local y general, la unión y las interacciones de menor afinidad, y es aplicable a muestras difíciles, ya que se puede hacer en el estado de solución.
El transporte de cobre en los sistemas biológicos se logra mediante proteínas metalochaperonas de cobre intracelulares que se unen específicamente a los iones Cu (I) y los entregan a sus proteínas objetivo a través de una serie de interacciones proteína-proteína, para proteger los iones de la oxidación y evitar la liberación de cobre tóxico2-5. El sitio de unión se caracteriza por la secuencia conservada, MXH/TCXanyXanyC, que se ha demostrado tanto por RMN como por cristalografía que se une al Cu (I) por los ligandos tiolato blandos de los dos residuos de cisteína, aunque también se ha propuesto un ligando externo adicional6-8. La relación estructura-función de estas proteínas ha sido objeto de una intensa investigación9.
En el estudio presentado aquí, se sintetizó un modelo peptídico que incluye la secuencia conservada de metalochaperonas de cobre y se reaccionó con Cu (I) en un entorno inerte. El protocolo presentado describe los pasos de la determinación de la estructura por RMN, incluida la preparación de la muestra, la recopilación de datos, el procesamiento de datos, la generación de estructuras y el análisis estructural. El análisis se realizó en dos etapas: Primero se generaron estructuras sin información sobre el modo de unión del péptido al ion cobre. Una vez que se estableció empíricamente el modo de enlace, se introdujeron estas restricciones para proporcionar una estructura de alta resolución. El modo de vinculación es el punto esencial en el modelo y, por lo tanto, se determinó de manera imparcial.
La determinación estructural de RMN de péptidos modelo es una técnica extremadamente valiosa que a menudo es utilizada por químicos y biólogos. Puede aplicarse con relativa facilidad a diferentes péptidos en diferentes condiciones y, por lo tanto, puede arrojar luz sobre los mecanismos relevantes10. La comprensión del proceso de elucidación de la estructura proporciona una mejor comprensión de las fortalezas y debilidades de las estructuras propuestas.

<table><tbody><tr><td>Espectrómetro Avance DMX 600 MHz Bruker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos de muestra de RMN&nbsp;</td><td>Wilmad</td><td>535-PP</td><td></td></tr><tr><td>Guantera</td><td>MBraun</td><td>LM05-019</td><td></td></tr><tr><td>Liofilizador&nbsp; &nbsp;</td><td>VirTis</td><td>de sobremesaK</td><td></td></tr><tr><td>Péptido</td><td>BioChemia</td><td>Hecho a medida</td><td>>95% de pureza</td></tr><tr><td>Cloruro de cobre (1)</td><td>Aldrich</td><td>224332</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico</td><td>BioLab</td><td>231-595-7</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>Gadot</td><td>1310-73-2</td><td></td></tr><tr><td>d6-Dimetilsulfóxido Aldrich</td><td>236926</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Óxido de deuterio</td><td>Aldrich</td><td>151882</td><td></td></tr></tbody></table>

determinación de la estructura y coordinación de complejos péptido-metal mediante rmn 1d y 2d 1h

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

La unión del cobre (I) por las proteínas transportadoras de metalochaperonas evita la oxidación del cobre y la liberación de los iones tóxicos que pueden participar en reacciones redox dañinas. El complejo Cu (I) del modelo peptídico de una proteína metalochaperona de unión a Cu (I), que incluye la secuencia MTCSGCSRPG (subrayado se conserva), se determinó en solución en condiciones inertes mediante espectroscopia de RMN.
RMN es una técnica ampliamente aceptada para la determinación de estructuras de solución de proteínas y péptidos. Debido a la dificultad en la cristalización para proporcionar cristales individuales adecuados para la cristalografía de rayos X, la técnica de RMN es extremadamente valiosa, especialmente porque proporciona información sobre el estado de la solución en lugar del estado sólido. En este trabajo describimos todos los pasos que se requieren para la determinación completa de la estructura tridimensional por RMN. El protocolo incluye la preparación de muestras en un tubo de RMN, la recopilación y el procesamiento de datos 1D y 2D, la asignación e integración de picos, los cálculos de mecánica molecular y el análisis de estructuras. Es importante destacar que el análisis se llevó a cabo primero sin ningún enlace metal-ligando preestablecido, para garantizar una determinación confiable de la estructura de manera imparcial.

Como parte de un estudio continuo sobre modelos de proteínas que se unen al cobre, se determinó mediante resonancia magnética nuclear en estado de solución la estructura de la secuencia conservada MT/HCXXC dentro del péptido lineal MTCSGCSRPG. El péptido fue hecho reaccionar con CuCl en un entorno inerte y el pH se midió en aproximadamente 3,0 mediante un indicador universal. La región de amida del péptido mostró una expansión tras la reacción con cobre, pasando de 6,7-8,5 a 6,6-9,0 ppm (Figura 2). El en...

Se determinó la estructura de la solución de RMN de un péptido modelo de metalochaperona con Cu (I), y se describe un protocolo detallado desde la preparación de la muestra y la recopilación de datos 1D y 2D hasta una estructura tridimensional.

Determinación de la estructura y coordinación de complejos péptido-metal mediante RMN 1D y 2D 1h

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox ...

El objetivo general de este procedimiento es determinar la estructura de un péptido mimético de proteína chaperona metálica complejado con cobre. Esto se logra primero preparando la muestra en un ambiente libre de oxígeno. El segundo paso consiste en adquirir los datos de resonancia magnética nuclear o espectroscopía de RMN que muestren las interacciones entre átomos de hidrógeno.A continuación, las interacciones espaciales se proyectan sobre una plantilla peptídica lineal. El paso final consiste en hallar una estructura representativa de baja energía que se ajuste a los datos. En última instancia, las estructuras obtenidas por RMN se utilizan para determinar el modo de unión y para realizar un análisis estructural del complejo unido al cobre.La principal ventaja de esta técnica frente a técnicas existentes como la cristalografía de rayos X es que puede utilizarse para examinar complejos de unión débil, así como moléculas y complejos que no cristalizan. Aunque este método puede proporcionar información sobre proteínas que se unen al cobre, también puede aplicarse a otros sistemas, como otras chaperonas metálicas, para estudiar cómo las proteínas permiten la entrega segura de iones metálicos esenciales, aunque potencialmente tóxicos, en el entorno de la línea celular.Para comenzar, prepare las muestras en un ambiente libre de oxígeno para evitar que el cobre se oxide. Para preparar la muestra APO, disuelva aproximadamente uno a dos miligramos del péptido en 450 a 500 microlitros de disolvente deuterado para RMN de grado analítico. Para la muestra con cobre reaccionado, disuelva la misma cantidad que el péptido APO con una cantidad molar EQU de sal metálica en 450 a 500 microlitros del disolvente para RMN. Filtre cada solución utilizando papel de filtración de vidrio central o cualquier otra técnica adecuada para los compuestos bajo estudio que no los absorba. Esto es esencial para eliminar cualquier partícula metálica, ya que afectaría la homogeneidad.Transfiera las soluciones a tubos de RMN y cierre las muestras en los tubos. Antes de salir de la caja de guantes, saque las muestras de la caja de guantes y séllelas. Registre los espectros de protones unidimensionales de las muestras APO y las reaccionadas con cobre en el equipo de RMN y compárelos.El péptido APO es flexible y muestra un promedio de conformaciones, pero al reaccionar con cobre, las amidas del péptido unido presentan una estructura más rígida. Por lo tanto, el espectro del péptido que contiene cobre debería mostrar un cambio significativo en el desplazamiento químico en la región de las amidas, y los picos pueden volverse más resueltos. Configure experimentos optimizados de NMR TOCSY, NOESY o ROESY bajo condiciones idénticas a las descritas en el protocolo del texto y ejecútelos en secuencia.Realice experimentos unidimensionales entre cada experimento para asegurarse de que la composición de la muestra permanezca constante durante toda la adquisición de datos. Después de procesar los datos según se describe en el protocolo escrito, prepare un conjunto de espectros cozy y to superpuestos sobre el espectro noea y rosy. Para asignar todos los picos NOE en el espectro.Comience asignando los picos que se solapan con señales de toxis en la región de huella digital. Dado que esto facilitará las entradas posteriores de asignación de picos, en el programa Sparky registre los picos asignados y tradúzcalos de los valores de acoplamiento H alfa a amida proteica en ángulos diedros. Asimismo, traduzca los picos en restricciones de distancia integrando los picos dentro del programa y traduciéndolos mediante una interacción de distancia conocida.Si los picos se superponen o no pueden utilizarse métodos automáticos de integración, los picos pueden etiquetarse visualmente como fuertes, medianos, débiles o muy débiles, y estas designaciones pueden traducirse en distancias de hasta 2,5; 3,5; 4,5 y 5,5 angstroms, respectivamente. Importe las restricciones de distancia y los ángulos diedros con el formato correcto para Explore. Explore buscará en el espacio conformacional para encontrar estructuras que cumplan con la geometría química canónica.Además de las restricciones de distancia encontradas experimentalmente, genere un conjunto en el que ninguno de estos parámetros se viole. Esto constituirá el conjunto inicial. Realice la primera corrida de determinación de estructura sin utilizar ninguna restricción sobre el metal para identificar qué residuos participan en la unión al metal sin ningún sesgo.Introduzca gradualmente las restricciones para facilitar la identificación de errores en la asignación, así como en la energía de NOE y los parámetros de simulación de flexión descritos en el protocolo del texto, antes de minimizar las estructuras mediante minimización de energía por gradiente conjugado durante 4.000 iteraciones. Cree un conjunto final, generalmente de 50 miembros, realizando la introducción de restricciones de forma iterativa sobre todo el conjunto y reporte el número de cada tipo de interacción de NOE encontrada. Finalmente, cree un conjunto de estructuras que cumplan con la geometría química canónica y las restricciones empíricas derivadas de RMN. Reporte el número total de conformaciones, el número de estas que presentan violaciones de las restricciones derivadas de RMN y el RMSD del conjunto completo, incluyendo tanto los valores de RMSD del esqueleto principal como de todos los átomos pesados.Analice el conjunto de baja energía y determine qué cadenas laterales de residuos están en proximidad correcta entre sí para poder unirse al ion metálico. Una vez determinados estos, repita el análisis, incluyendo los datos de unión del cobre. Además de las restricciones de distancia derivadas de la RMN, agregue ahora restricciones de unión al metal para los residuos determinados.Agregue parámetros adecuados para describir el ion metálico y su topología. Ingrese la información física apropiada, como masas, longitudes de enlace con otros átomos, ángulos y parámetros de repulsión no covalente, en el archivo de parámetros. Añada la información de enlace al archivo de topología.Esta información incluye qué enlaces se forman y se rompen, y qué cargas formales cambian como resultado de la unión. Finalmente, obtenga un conjunto de estructuras como antes, ya que el conjunto resuelto representa el espacio conformacional adoptado por el péptido. Durante la medición de RMN, importe todas las conformaciones de la estructura al programa Mal Mall para crear un conjunto inicial.Examine el conjunto para determinar la estabilidad local de la molécula. Determine los valores de RMSD del armazón y de las cadenas laterales seleccionando regiones subsiguientes de cuatro residuos a lo largo de la secuencia y haciendo que el programa calcule el RMSD respecto a la estructura de menor energía o al valor medio; determine qué regiones de la molécula muestran estabilidad local mediante la representación gráfica del RMSD local en función de la secuencia. Superponga el conjunto a lo largo de esta región de la molécula y utilice este conjunto para análisis posteriores. Elija las conformaciones de baja energía que cumplan con las restricciones derivadas de la RMN.Estos formarán el registro del conjunto de baja energía y reportarán el número de confirmaciones en el conjunto, los criterios para seleccionarlas y los valores de RMSD. Si el modo de unión al metal aún no ha sido determinado, analice el conjunto de baja energía y determine qué cadenas laterales de residuos son incorrectas. Proximidad entre sí para poder unirse al ion metálico.Utilice KYMERA para determinar las distancias intramoleculares entre átomos sospechosos de unión a metales. Calcule las distancias promedio en el conjunto una vez que se hayan determinado. Repita el análisis incluyendo los datos de unión de cobre.Examine el conjunto y determine la estructura secundaria local dentro de la molécula utilizando los parámetros de búsqueda predeterminados del programa MAL mall. A continuación, importe el conjunto en kymera. Las estructuras secundarias se mantienen mediante enlaces de hidrógeno e indican regiones estables de la molécula.Determine el enlace de hidrógeno utilizando la herramienta kymera. Continúe el análisis estructural según se describe en el protocolo de texto. Luego, sume todos los hallazgos estructurales para revelar cómo se refuerzan mutuamente. Para estudiar modelos de proteínas que se unen al cobre, se determinó por RMN en estado de solución la estructura de la secuencia de unión conservada de una proteína dentro del péptido lineal derivado, en la región de amida del péptido comprendida entre 6,7 y 8,5.PP M mostró una expansión al reaccionar con cobre, de 6,6 a 9,0 PP M. El ensanchamiento de las líneas debido a una ligera oxidación del cobre es evidente en la línea base. Aquí se muestra una superposición de las regiones huella digital de los espectros de Roy Toxi y cozy del péptido unido al cobre. La muestra fue estable en el tiempo y los espectros estuvieron bien resueltos, y proporcionaron 81 interacciones NOE que se obtuvieron mediante un experimento rosy.Dado que la molécula mostró interacciones NOE cercanas a cero en el experimento NO C, el conjunto del péptido derivado para la muestra reaccionada, pero sin utilizar restricciones para el metal, produjo 47 de 50 estructuras no válidas con un valor de RMSD de 1,44 y 2,07 angstroms en el esqueleto y los átomos pesados, respectivamente. De estas, se seleccionaron 13 conformeros de baja energía para un análisis posterior, con valores de RMSD de 0,25 y 0,61 angstroms en el esqueleto y los átomos pesados, respectivamente. El gráfico de RMSD local mostró una región de estabilidad entre los residuos tres y siete. Además de la región rígida del extremo C, que incluye un residuo de prolina, esta región se encuentra en una conformación de giro entre los residuos cuatro y siete en todas las conformaciones.La confirmación del giro se estabiliza mediante enlaces de hidrógeno entre los donadores y aceptores del armazón de la glicina cinco y la alanina tres, así como entre la cisteína seis y la cisteína tres. Este giro también es evidente en la cisteína tres y la serina siete por los valores de acoplamiento reducidos en esta región. Las confirmaciones se superpusieron en esta región y se analizaron para posibles residuos de unión, considerando la cisteína tres, la cisteína seis y la metionina uno como residuos de unión potenciales.La distancia más corta entre átomos de azufre fue la existente entre los grupos de folato de la cisteína tres y la cisteína seis; se introdujo la unión al cobre y el cálculo se repitió para obtener el conjunto utilizado en el análisis. El conjunto de baja energía del péptido unido al cobre muestra que la amina terminal está próxima al cobre unido. Aquí se muestra la isosuperficie de distribución del potencial electrostático, con el potencial positivo representado en azul y el potencial negativo en rojo.El residuo de arginina se extiende desde el esqueleto del péptido, formando un lóbulo positivo de potencial electrostático, mientras que los rendimientos de carbono del esqueleto se disponen en línea, formando un potencial electrostático negativo menos prominente. Una vez dominado, un análisis estructural puede realizarse en aproximadamente una semana de tiempo de RMN y otros pocos días de procesamiento para obtener un conjunto de conformaciones que pueda utilizarse para el análisis estructural. Siguiendo este procedimiento, pueden analizarse otros mutantes del péptido y diferentes condiciones con el fin de responder preguntas adicionales sobre las condiciones necesarias para distintos grados de unión y liberación del ion cobre.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Chemistry

Química

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