Estudios estructurales de escala atómica de asambleas macromoleculares por espectroscopia de estado sólido de resonancia magnética Nuclear

El objetivo general de este protocolo es estudiar las estructuras de ensamblajes de proteínas supermoleculares insolubles y no cristalinas a resolución atómica mediante espectroscopia de RMN de estado sólido de giro en ángulo mágico. Presentaremos los pasos metodológicos esenciales para el estudio de las estructuras atómicas de los ensamblajes de proteínas biomoleculares mediante RMN en estado sólido. El estudio de las estructuras atómicas de estos ensamblajes es extremadamente desafiante porque son inherentemente insolubles y no cristalinos.

La RMN de estado sólido es una técnica emergente capaz de estudiar la estructura y la dinámica molecular a resolución atómica sin estar limitada por el tamaño del objeto ensamblado o por su solubilidad. Ilustramos aquí los pasos clave para visualizar las estructuras atómicas de los ensamblajes de proteínas biomoleculares mediante RMN de estado vendido, incluida la preparación de muestras marcadas isotópicamente, la recopilación y el análisis de datos estructurales de RMN de estado sólido. El primer paso en un flujo de trabajo de RMN de estado sólido es la producción de subunidades de proteínas marcadas con C13 N15 y su ensamblaje in vitro.

Inocular un precultivo de 15 milésimas de pulgada de medio LB precalentado con una colonia de células de E. coli transformadas. Incubar a 37 grados centígrados con agitación de 200 RPM durante la noche. Para inocular el cultivo principal, transfiera todo el precultivo a un litro de medio N9 precalentado que contenga las fuentes necesarias de carbono y nitrógeno marcadas isotópicamente.

Estos pueden incluir, cloruro de amonio marcado con N15, glucosa marcada uniformemente con C13, glucosa marcada selectivamente con C13 o glicerol marcado selectivamente con C13 incubar a 37 grados, y medir la densidad óptica a 600 nanómetros tan pronto como el cultivo se vuelva turbio. Cuando la OD haya alcanzado un valor de 0,8, inducir la expresión de la proteína con un IPTG mini molar de 0,75 durante cuatro horas. Tenga en cuenta que las condiciones óptimas de inducción pueden variar de una proteína a otra.

Recuperar las células por centrifugación durante 30 minutos a 6.000 g y cuatro grados. Después de la purificación de las subunidades proteicas, se ensamblan in vitro. Concentre la proteína en alrededor de un mini molar en una unidad de filtro centrífugo.

Para ello, introduzca la muestra en la unidad de filtrado y centrifuga a 4.000 G durante 30 minutos. Entre los pasos de centrifugación, mezcle suavemente la solución en la unidad de filtro con una pipeta para evitar la deposición de proteínas en la membrana del filtro. Repita el procedimiento hasta alcanzar la concentración deseada.

Transfiera la muestra a un tubo de halcón e incube agitada durante una semana a temperatura ambiente. Por lo general, la polimerización de las subunidades en filamentos va acompañada de la turbiedad de la solución. Agregue 0.02% de peso por volumen de azida de sodio para evitar la contaminación bacteriana.

Para recolectar el ensamblaje de proteínas, centrifugar la muestra durante una hora a 20.000 g y cuatro grados. Aspire la mayor parte del sobrenadante dejando solo suficiente líquido para cubrir la superficie para evitar el secado de la muestra, y almacene la muestra a cuatro grados hasta la medición. Presentaremos los experimentos esenciales para un análisis estructural por RMN de estado sólido.

La polarización cruzada unidimensional, o CP, y los experimentos ineptos detectados en los núcleos C13 se utilizan para detectar segmentos de proteínas rígidos y flexibles en el ensamblaje, respectivamente. Y estimar el grado de homogeneidad estructural y polimorfismo local. Aquí, usamos valores experimentales estándar.

Los rangos de parámetros típicos se indican en el protocolo. Inserte el rota en el imán de RMN y comience a girar el ángulo mágico como se describe en el protocolo. Establezca la frecuencia de giro deseada y asegure la estabilización dentro de más o menos 10 hercios.

Registre un solo espectro de protones unidimensional pulsado utilizando 16 escaneos. Configura un CP de carbono de protones 1D. Los experimentos de CP muestran las señales que surgen de los residuos en una conformación rígida. Los parámetros iniciales del experimento se toman de un procedimiento de optimización estándar en un compuesto de referencia.

Los parámetros de calibración y desacoplamiento de pulsos se pueden optimizar en la muestra cuando la sensibilidad es lo suficientemente alta. Aquí, registramos una CP con 16 escaneos. El tiempo de contacto CP y los niveles de potencia se eligen en función de la intensidad máxima de la señal, como se demuestra aquí para la optimización del tiempo de contacto CP.

La intensidad máxima en este ejemplo se alcanza a los 800 milisegundos. Los parámetros de desacoplamiento también deben reajustarse a partir de los establecidos originalmente en la calibración del compuesto de referencia. Por último, observe cuidadosamente la localización de las bandas laterales de giro a la frecuencia de giro del ángulo mágico dado, que se muestra aquí a 18 kilohercios, para evitar la superposición con la señal.

Registre un espectro CP de carbono protón 1D de referencia que sirva como huella digital espectral unidimensional. Aquí, acumulamos 128 escaneos con un tiempo de contacto CP de 800 milisegundos, una fuerza de desacoplamiento de 100 kilohercios, un retraso de reciclaje de tres segundos y un tiempo de adquisición de 20 milisegundos. Procese el experimento CP sin apatía.

Elegir un pico aislado para estimar el C39 dentro de la muestra, indicativo de orden estructural y homogeneidad. Aquí, el ancho de la línea, medido como el ancho total a media altura, es de alrededor de 60 a 70 hercios, lo que indica una estructura de proteína bien ordenada en el ensamblaje. Establezca un experimento unidimensional de protones ineptos para sondear partes altamente móviles del ensamblaje de proteínas.

Registre un experimento inepto de referencia para que sirva como huella digital para los segmentos de proteínas móviles. Los parámetros típicos son 128 escaneos y un tiempo de adquisición de 25 milisegundos. Procesa el experimento del protón carbono inepto.

El número de señales, y sus posiciones, son indicativos del grado de movilidad de los residuos y de la composición de los aminoácidos, respectivamente. Aquí, solo se observa la señal del tampón de torsión CH2 merit-y, ya que toda la proteína se encuentra en un régimen rígido en la estructura de ensamblaje. El análisis conformacional de la estructura de la proteína se basa en las asignaciones de resonancia de RMN de estado sólido para todos los residuos rígidos del ensamblaje.

Esto es posible porque los cambios químicos son sondas altamente sensibles para el entorno químico local y se pueden usar para predecir la estructura secundaria de la proteína. A continuación, se basa en la recopilación de datos estructurales, como las restricciones de distancia, que codifican las proximidades de los átomos intramoleculares e intermoleculares de hasta nueve angstrom. Aquí, mostraremos cómo se registran los experimentos bidimensionales básicos y daremos un ejemplo de una asignación secuencial.

A continuación, daremos una breve demostración de cómo recoger las restricciones de distancia de los experimentos registrados en muestras marcadas selectivamente con C13. Configure el experimento PDSD bidimensional de carbono carbono de tiempo de mezcla corto para detectar la correlación carbono-carbono intrarresiduo. Copie los valores para el paso inicial de polarización cruzada de protón-carbono del experimento CP unidimensional.

La mezcla se puede ajustar a 50 milisegundos para muestras marcadas uniformemente con C13. Aquí, hemos elegido un tiempo de adquisición de 15 y 20 milisegundos en las dimensiones indirecta y directa respectivamente. Para procesar el espectro PDSD, utilizamos una función de ventana QSINE con un desplazamiento de campana sinusoidal de 3,5.

Para permitir la asignación específica de residuos, utilice la configuración del tiempo de mezcla corto PDSD para registrar un tiempo de mezcla intermedio PDSD con un tiempo de mezcla de 100 a 200 milisegundos. Tenga en cuenta que a menudo se requieren espectros adicionales, incluidos los experimentos detectados con nitrógeno, para una asignación de resonancia completa, y se detallan en el protocolo. Elija un programa de análisis de RMN, como el análisis CCPNMR.

Cargue los espectros 2D en el software y cree un objeto molecular con la secuencia de proteínas primarias. Comience con la identificación de los tipos de aminoácidos que son visibles en el espectro PDSD de tiempo de mezcla corto. La conexión de los átomos de carbono de los sistemas de espín permite la asignación específica del tipo de residuo.

Aquí, asignamos el sistema de espín de un residuo de tenio. Las transferencias de polarización entre los núcleos C-alfa, C-beta y C-gamma conducen a picos cruzados físicos en el espectro PDSD. Trate de identificar tantos residuos como sea posible con este procedimiento.

Superponga el espectro PDSD de tiempo de mezcla corto e intermedio. Los picos suplementarios visibles en el tiempo de mezcla intermedio PDSD suelen surgir del contacto entre residuos secuenciales. Marque los picos de resonancia de un sistema de espín y encuentre correlaciones en el tiempo de mezcla intermedio PDSD con las frecuencias de resonancia de otros sistemas de espín.

Mostramos la asignación secuencial con el tenio 33 al isolutano 32 en nuestro ensamblaje de proteínas filamentosas. Las frecuencias de resonancia del sistema de espín del tenio son visibles en una frecuencia de carbono de los solutos en 32, y viceversa. En el protocolo se describen los procedimientos para la asignación con espectros detectados de nitrógeno y para la obtención de la estructura secundaria de las proteínas a partir de las asignaciones.

Después de una asignación de resonancia minuciosa, podemos proceder con la identificación de las restricciones de largo alcance. Las restricciones de largo alcance son proximidades intra o intermoleculares de carbono entre residuos distantes que definen tanto el pliegue terciario de las subunidades monoméricas como la disposición de las subunidades dentro del conjunto. En este caso, las muestras marcadas selectivamente con C13 son de especial importancia.

Superposición de un PDSD de tiempo de mezcla intermedio con un PDSD de carbono de carbono de tiempo de mezcla prolongado registrado con un tiempo de mezcla de entre 400 milisegundos y un segundo en una muestra marcada selectivamente con C13. Si es posible, ambos PDSD deben haberse registrado en la misma muestra etiquetada selectivamente. Los picos suplementarios surgen de las correlaciones entre átomos de C13 más distantes.

Durante la asignación de resonancia, tenga en cuenta el esquema de etiquetado selectivo. En este caso, 1-3-glicerol. Aquí, hemos resaltado un ejemplo de un pico de contacto de largo alcance con una asignación inequívoca en ambas dimensiones.

Tenio 33 C-beta con proteína 45 C-alfa. Después de completar la identificación a larga distancia, las restricciones se clasifican como inequívocas o ambiguas, así como intra o intermoleculares. Las listas de restricción que se deben preparar para el modelado estructural se enumeran en el protocolo.

Los tutoriales sobre modelado estructural utilizando diferentes programas se pueden encontrar en línea. Los datos de RMN de estado sólido, ya sea por sí solos o junto con datos complementarios, pueden permitir la determinación de la estructura a nivel atómico de ensamblajes supermoleculares. Las ventajas de la RMN de estado sólido son, por un lado, la capacidad de proporcionar tanto información de la estructura secundaria como restricciones de distancia atómica de las interfaces intramoleculares, que pueden integrarse en el proceso de modelado.

Sin embargo, por otro lado, la característica única de la espectroscopia de RMN de estado sólido radica en su capacidad para recopilar restricciones de distancia atómica en interfaces intermoleculares de ensamblaje supermolecular intacto. Sin embargo, la detección y distinción entre las asignaciones de restricción intra e intermoleculares puede ser un proceso tedioso y, por lo general, requiere una preparación de muestras marcadas selectivamente con C13. Sin embargo, con los nuevos desarrollos en estrategias de etiquetado selectivo, diseño de hardware de espectrómetro y metodologías de RMN de estado sólido, la técnica está cumpliendo cada vez más su potencial teórico de proporcionar información molecular a nivel atómico sin limitaciones de tamaño de objeto, orden de largo alcance o cristalinidad.

Este método nos permite estudiar la estructura atómica de los ensamblajes biomoleculares. Es muy importante preparar cuidadosamente la muestra para optimizar la condición de RMN, para obtener datos de alta resolución. Con este protocolo, podemos obtener resoluciones atómicas que son información de los ensamblajes de proteínas.

Y esta técnica se puede combinar con otras técnicas de biología estructural para obtener modelos tridimensionales.