Estudios estructurales de escala atómica de asambleas macromoleculares por espectroscopia de estado sólido de resonancia magnética Nuclear

El objetivo general de este protocolo es estudiar las estructuras de ensamblajes proteicos supramoleculares insolubles y no cristalinos a resolución atómica mediante espectroscopía de RMN en estado sólido con rotación mágica del ángulo. Presentaremos los pasos metodológicos esenciales para estudiar las estructuras atómicas de ensamblajes proteicos biomoleculares mediante RMN en estado sólido. El estudio de las estructuras atómicas de estos ensamblajes es extremadamente difícil porque son inherentemente insolubles y no cristalinos.

La RMN en estado sólido es una técnica emergente capaz de estudiar la estructura molecular y la dinámica a resolución atómica sin estar limitada por el tamaño del objeto ensamblado ni por su solubilidad. Aquí ilustramos los pasos clave para visualizar estructuras atómicas de ensamblajes proteicos biomoleculares mediante RMN en estado sólido, incluyendo la preparación de muestras con marcado isotópico, la recopilación y el análisis de datos estructurales obtenidos por RMN en estado sólido. El primer paso en un flujo de trabajo de RMN en estado sólido es la producción de subunidades proteicas marcadas con C13 y N15 y su ensamblaje *in vitro*.

Inocule un cultivo previo de 15 ml de medio LB precalentado con una colonia de células de E. coli transformadas. Incube a 37 grados Celsius con agitación de 200 RPM durante la noche. Para inocular el cultivo principal, transfiera todo el cultivo previo a un litro de medio N9 precalentado que contenga las fuentes necesarias de carbono y nitrógeno marcadas isotópicamente.

Estos pueden incluir cloruro de amonio marcado con N15, glucosa uniformemente marcada con C13, glucosa selectivamente marcada con C13 o glicerol selectivamente marcado con C13. Incubar a 37 grados y medir la densidad óptica a 600 nanómetros tan pronto como el cultivo se vuelva turbio. Cuando la DO alcance un valor de 0,8, inducir la expresión proteica con IPTG 0,75 milimolar durante cuatro horas. Tenga en cuenta que las condiciones óptimas de inducción pueden variar de una proteína a otra.

Recuperar las células mediante centrifugación durante 30 minutos a 6.000 G y cuatro grados. Después de la purificación de las subunidades proteicas, se ensamblan in vitro. Concentrar la proteína hasta aproximadamente un milimolar en una unidad de filtro centrífugo.

Para ello, introduzca la muestra en la unidad de filtración y centrifugue a 4.000 G durante 30 minutos. Entre cada paso de centrifugación, mezcle suavemente la solución en la unidad de filtración con una pipeta para evitar la deposición de proteínas en la membrana del filtro. Repita el procedimiento hasta alcanzar la concentración deseada.

Transfiera la muestra a un tubo falcon e incube bajo agitación durante una semana a temperatura ambiente. Por lo general, la polimerización de las subunidades en filamentos va acompañada por el enturbiamento de la solución. Añada azida sódica al 0,02% peso por volumen para evitar la contaminación bacteriana.

Para cosechar el ensamblaje proteico, centrifugue la muestra durante una hora a 20.000 G y cuatro grados. Aspire la mayor parte del sobrenadante dejando solo suficiente líquido para cubrir la superficie y evitar que la muestra se seque, y almacene la muestra a cuatro grados hasta su medición. Presentaremos los experimentos esenciales para un análisis estructural mediante RMN en estado sólido.

Experimentos unidimensionales de polarización cruzada, o CP, y de inept detectados en núcleos de C13 se utilizan para detectar segmentos proteicos rígidos y flexibles en el ensamblaje, respectivamente, y para estimar el grado de homogeneidad estructural y polimorfismo local. Aquí, utilizamos valores experimentales estándar.

Se indican los rangos típicos de parámetros en el protocolo. Inserte el rotor en el imán de RMN y comience el giro al ángulo mágico según se describe en el protocolo. Establezca la frecuencia de giro deseada y asegúrese de que se estabilice dentro de ±10 hercios.

Registre un espectro de protón unidimensional pulsado individual utilizando 16 escaneos. Configure un experimento de protón 1D con carbono CP. Los experimentos CP muestran las señales que surgen de los restos en una conformación rígida. Los parámetros iniciales del experimento se toman de un procedimiento estándar de optimización en un compuesto de referencia.

La calibración de los pulsos y los parámetros de desacoplamiento pueden optimizarse en la muestra cuando la sensibilidad es suficientemente alta. Aquí, registramos un CP con 16 escaneos. El tiempo de contacto CP y los niveles de potencia se eligen según la intensidad máxima de la señal, como se demuestra aquí para la optimización del tiempo de contacto CP.

La intensidad máxima en este ejemplo se alcanza a los 800 milisegundos. Los parámetros de desacoplamiento también deben reajustarse a partir de los establecidos inicialmente mediante la calibración del compuesto de referencia. Por último, observe cuidadosamente la localización de las bandas satélite de giro a la frecuencia de giro al ángulo mágico dada, mostrada aquí a 18 kilohercios, para evitar solapamiento con la señal.

Registre un espectro de referencia de carbono-protón en 1D con CP que sirve como huella espectral unidimensional. Aquí, acumulamos 128 escaneos con un tiempo de contacto CP de 800 milisegundos, una intensidad de desacoplamiento de 100 kilohercios, un retardo de reciclaje de tres segundos y un tiempo de adquisición de 20 milisegundos. Procese el experimento CP sin apodización.

Seleccione un pico aislado para estimar el C39 dentro de la muestra, lo que indica orden estructural y homogeneidad. Aquí, el ancho de línea, medido como el ancho completo a media altura, es de aproximadamente 60 a 70 hercios, lo que indica una estructura proteica bien ordenada en el ensamblaje. Configure un experimento unidimensional de inept de carbono-protones para analizar las partes altamente móviles del ensamblaje proteico.

Registre un experimento de ineptitud de referencia para servir como huella dactilar de los segmentos de proteína móviles. Los parámetros típicos son 128 escaneos y un tiempo de adquisición de 25 milisegundos. Procese el experimento de ineptitud de carbono protónico.

El número de señales y sus posiciones indican el grado de movilidad de los residuos y la composición de aminoácidos, respectivamente. Aquí, solo se observa la señal del tampón de giro CH2 merit-y, ya que toda la proteína se encuentra en un régimen rígido en la estructura del ensamblaje. El análisis conformacional de la estructura proteica se basa en las asignaciones de resonancia de RMN en estado sólido para todos los residuos rígidos del ensamblaje.

Esto es posible porque los desplazamientos químicos son sondas altamente sensibles del entorno químico local, y pueden utilizarse para predecir la estructura secundaria de la proteína. La determinación completa de la estructura tridimensional se basa entonces en la recopilación de datos estructurales, como restricciones de distancia que codifican las proximidades atómicas intra e intermoleculares hasta nueve angstrom. A continuación, mostraremos cómo se registran los experimentos básicos en dos dimensiones y presentaremos un ejemplo de asignación secuencial.

A continuación, daremos una breve demostración sobre cómo recopilar restricciones de distancia a partir de experimentos registrados en muestras selectivamente marcadas con C13. Configure el experimento bidimensional de PDSD de carbono-carbono con un tiempo corto de mezcla para detectar la correlación entre carbonos dentro del mismo residuo. Copie los valores del paso inicial de polarización cruzada protón-carbono del experimento unidimensional de CP.

La mezcla puede establecerse en 50 milisegundos para muestras uniformemente marcadas con C13. Aquí, hemos elegido un tiempo de adquisición de 15 y 20 milisegundos en las dimensiones indirecta y directa, respectivamente. Para procesar el espectro PDSD, utilizamos una función de ventana QSINE con un desplazamiento de campana sinusoidal de 3,5.

Para permitir la asignación específica de residuos, utilice los ajustes del PDSD de tiempo de mezcla corto para registrar un PDSD de tiempo de mezcla intermedio con un tiempo de mezcla de 100 a 200 milisegundos. Tenga en cuenta que a menudo se requieren espectros adicionales, incluidos experimentos detectados por nitrógeno, para una asignación completa de resonancias, y estos se detallan en el protocolo. Elija un programa de análisis de RMN, como CCPNMR Analysis.

Cargue los espectros 2D en el software y cree un objeto molecular con la secuencia proteica principal. Comience con la identificación de los tipos de aminoácidos que son visibles en el espectro PDSD de tiempo de mezcla corto. Conectar los átomos de carbono de los sistemas de espín permite la asignación específica según el tipo de residuo.

Aquí, asignamos el sistema de espín de un residuo de thenium. Las transferencias de polarización entre los núcleos C-alfa, C-beta y C-gamma generan picos cruzados físicos en el espectro PDSD. Intente identificar tantos residuos como sea posible mediante este procedimiento.

Superponga ambos espectros PDSD con tiempos de mezclado corto e intermedio. Los picos adicionales visibles en el espectro PDSD con tiempo de mezclado intermedio suelen originarse por contactos entre residuos secuenciales. Marque los picos de resonancia de un sistema de espines y busque correlaciones en el espectro PDSD con tiempo de mezclado intermedio con las frecuencias de resonancia de otros sistemas de espines.

Mostramos la asignación secuencial con thenium 33 a isolutano 32 en nuestro ensamblaje de proteína filamentosa. Las frecuencias de resonancia del sistema de espín de thenium son visibles en una frecuencia de carbono de los isolutanos en 32, y viceversa. En el protocolo se describen los procedimientos para la asignación mediante espectros detectados por nitrógeno y para obtener la estructura secundaria de la proteína a partir de las asignaciones.

Tras una asignación completa de resonancias, podemos proceder con la identificación de restricciones de largo alcance. Las restricciones de largo alcance son proximidades intra o intermoleculares entre átomos de carbono de residuos distantes, que definen tanto el plegamiento terciario de las subunidades monoméricas como la disposición de las subunidades dentro del ensamblaje. Aquí, las muestras marcadas selectivamente con C13 tienen una importancia particular.

Superponga un PDSD con tiempo de mezclado intermedio con un PDSD de carbono-carbono con tiempo de mezclado largo, registrado con un tiempo de mezclado entre 400 milisegundos y un segundo, en una muestra selectivamente marcada con C13. Si es posible, ambos PDSD deben haberse registrado en la misma muestra selectivamente marcada. Los picos suplementarios surgen de correlaciones entre átomos de C13 más distantes.

Durante la asignación de resonancias, tenga en cuenta el esquema de marcado selectivo. En este caso, glicerol 1-3. Aquí, hemos resaltado un ejemplo de un pico de contacto de largo alcance con una asignación inequívoca en ambas dimensiones.

Thenium 33 C-beta con proteína 45 C-alfa. Tras completar la identificación de distancias a largo alcance, las restricciones se clasifican como ambiguas o no ambiguas, así como intramoleculares o intermoleculares. Las listas de restricciones que deben prepararse para la modelización estructural se enumeran en el protocolo.

Se pueden encontrar tutoriales sobre modelado estructural utilizando diferentes programas en línea. Los datos de RMN en estado sólido, ya sea por sí solos o en conjunto con datos complementarios, pueden permitir la determinación de estructuras a nivel atómico de ensamblajes supramoleculares. Las ventajas de la RMN en estado sólido son, por un lado, la capacidad de proporcionar información sobre la estructura secundaria y restricciones de distancia atómica provenientes de interfaces intramoleculares, que pueden integrarse en el proceso de modelado.

Sin embargo, por otro lado, la característica única de la espectroscopía de RMN en estado sólido radica en su capacidad para obtener restricciones de distancias atómicas en las interfaces intermoleculares de un ensamblaje supramolecular intacto. La detección y distinción entre asignaciones de restricciones intra e intermoleculares puede ser, no obstante, un proceso tedioso y normalmente requiere la preparación de muestras selectivamente marcadas con C13. Sin embargo, con los nuevos avances en estrategias de marcado selectivo, diseño de hardware para espectrómetros y metodologías de RMN en estado sólido, la técnica está cumpliendo cada vez más su potencial teórico de proporcionar información molecular a nivel atómico sin limitaciones por el tamaño del objeto, el orden de largo alcance o la cristalinidad.

Este método nos permite estudiar la estructura atómica de ensamblajes biomoleculares. Es muy importante preparar cuidadosamente la muestra para optimizar las condiciones de RMN y obtener datos de alta resolución. Con este protocolo, podemos obtener resoluciones atómicas que proporcionan información sobre los ensamblajes de proteínas.

Y esta técnica puede combinarse con otras técnicas en biología estructural para obtener modelos tridimensionales.