Name: Estudios estructurales de escala atómica de asambleas macromoleculares por espectroscopia de estado sólido de resonancia magnética Nuclear (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 55 s
Description: Aprende a estudiar estructuras de ensamblajes proteicos insolubles a resolución atómica mediante espectroscopía de resonancia magnética nuclear de estado sólido con giro del ángulo mágico. Este protocolo detalla la preparación de muestras isotópicamente marcadas, la recolección y el análisis de datos estructurales.

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Este trabajo es financiado por la ANR (13-PDOC-0017-01 B.H. y ANR-14-CE09-0020-01 para A.L.), "Inversiones para el futuro" programa IdEx Bordeaux/CNRS (PEPS 2016 a B.H.) referencia ANR-10-IDEX-03-02 a B.H., la Fondation pour la Recherche Médicale ( FRM-AJE20140630090 a A.L.), el programa FP7 (FP7-PEOPLE-2013-CIG a A.L.) y el Consejo Europeo de investigación (CEI) bajo el programa de investigación e innovación a los horizonte 2020 de la Unión Europea (ERC Starting Grant para A.L., acuerdo No 639020) y proyecto " WEAKINTERACT."

Los autores no tienen nada que revelar.

NMR de estado sólido (SSNMR) es un método de elección para la caracterización de conjuntos de proteínas macromoleculares en un nivel atómico. Uno de los temas centrales en la determinación de la estructura basada en la SSNMR es la calidad espectral del sistema investigado, que permite crear modelos estructurales 3D de precisión diferentes, generalmente que van desde modelos de baja resolución (contiene el secundario estructura elementos y poca información 3D) a pseudo-atómicas estructuras 3D. La cantidad y calidad de información estructural extraída de experimentos SSNMR multidimensionales es la clave para calcular una estructura de NMR de alta resolución de la Asamblea.
El protocolo descrito se basa en la detección de 13C -13C y 15N -13C estructural las restricciones que requiere la grabación de varios espectros 2D (y a veces 3D) con alta señal a ruido. A frecuencias MAS moderadas (&#60; 25 kHz), se introduce la muestra en rotores con tamaños de 3.2-4 mm de diámetro permitiendo cantidades de proteína de hasta ~ 50 mg, depende de la hidratación de la muestra. La cantidad de muestra dentro del rotor es directamente proporcional a la relación de señal a ruido en espectros SSNMR, un factor decisivo para la detección de las limitaciones de distancia de largo alcance y la asignación inequívoca.
La resolución espectral es un parámetro crucial durante la asignación secuencial de la resonancia y la colección de restricciones. Para obtener resultados óptimos, los parámetros de preparación de la muestra necesitan ser optimizado, particularmente en la purificación de la subunidad y las condiciones de montaje (pH, buffer, agitación, temperatura, etc.). Para la optimización de la muestra, se recomienda para preparar muestras sin etiqueta para varias condiciones distintas para las que se ha observado la Asamblea y para grabar un 1D 1H -13C CP espectro (descrito en el paso 2.1) en cada muestra preparada. Los espectros sirven para comparar la dispersión entre las diferentes preparaciones, basado en que se pueden determinar las condiciones óptimas y resolución espectral.
La calidad de los datos SSNMR depende fuertemente de la elección de los parámetros de adquisición de NMR, especialmente para los pasos de transferencia de polarización. El uso de altas fuerzas del campo magnético (≥600 MHz 1H de frecuencia) es esencial para la alta sensibilidad y resolución espectral, necesaria frente a objetivos complejos tales como asambleas de proteína macromolecular.
Un factor limitante en muchos casos es la disponibilidad de espectrómetro. Por lo tanto, una elección juiciosa de las muestras a ser preparado debe preceder a la sesión del espectrómetro. En cualquier caso, uniformemente 13C, 15muestra marcada con el N es un requisito previo para realizar la asignación secuencial y la residual de resonancia. Asignado por estado sólidas técnicas de RMN de proteínas ver71. Determinación de la estructura de asambleas macromoleculares en frecuencias MAS moderadas requiere selectivamente las muestras marcada con C 13; para la detección de largo alcance 13C -13C y 13C -15N en contacto con las muestras basadas en 1, 3 -13C - y 2 -13C-gylcerol o 1 -13C - y 2 -13C-glucosa etiquetado son de uso general, como se describe anteriormente. La elección entre los dos sistemas de etiquetado se basa en la relación de señal a ruido espectral y resolución. Para distinguir entre el intra - e intermoleculares contactos a largo plazo, mixtas muestras etiquetadas y diluidas han revelado eficientes.
En Resumen, los pasos críticos para un estudio estructural atómico de SSNMR son: (i) la preparación de las subunidades y la necesidad de la Asamblea a ser optimizada para obtener la muestra excelente cantidad y calidad, (ii) Espectrómetro campo fuerza y adquisición de los parámetros deben ser escogido cuidadosamente; III selectivos Etiquetadoras estrategias se requieren para una determinación de la estructura 3D y la cantidad de datos requeridos depende de la calidad de los datos y la disponibilidad de datos complementarios.
A pesar de su aplicabilidad a una amplia gama de sistemas supramoleculares, que van desde proteínas de la membrana homomultimeric nano-objetos, SSNMR es a menudo limitada por la necesidad de cantidades de mg de material isotópicamente etiquetado. Los recientes desarrollos tecnológicos en ultra rápido SSNMR MAS (≥100 kHz) abrir la Avenida 1detectado H NMR y empujar el límite de la cantidad de muestra mínima para sub-mg 72,73,74. Sin embargo, para estudios estructurales detallados 13C-etiquetado muestras son indispensables, que limita la aplicación de SSNMR para las muestras montadas en vitro o sistemas expresados en los organismos que sobreviven en un medio mínimo, donde en las células SSNMR es un método emergente (para comentarios ver 75,76,77,78).
Un factor importante en el uso de SSNMR para obtener estructuras 3D de alta resolución es la resolución espectral: intrínseca heterogeneidad conformacional en una Asamblea puede limitar el análisis de espectros y resolución espectral. Residuo específico 13C etiquetado puede en algunos casos ofrecer una alternativa para obtener información de la distancia específica sobre residuos estratégicos con el fin de obtener modelos estructurales (para una reciente ejemplos véase 79,80).
SSNMR para la determinación de la estructura 3D todavía requiere la colección de varios conjuntos de datos con tiempos de recogida de datos a menudo mucho en instrumentos sofisticados, dependiendo el enfoque y el sistema varios días a semanas en un 600-1000 MHz (frecuencia de1H) Espectrómetro de. Por lo tanto, el acceso a tiempo de espectrómetro puede ser un factor limitante en un profundo estudio de la SSNMR.
En el caso de conjuntos de proteínas homomultimeric, llevando a datos SSNMR de calidad suficiente para identificar un gran número de limitaciones estructurales como en 3,57,64,70, SSNMR no da todavía tienen acceso a las dimensiones microscópicas. Por lo tanto, en una determinación de novo de SSNMR estructura de un conjunto de homomultimeric, EM o datos de masa por longitud (MPL) idealmente complementan datos SSNMR para derivar los parámetros de la simetría. SSNMR datos solo proporcionan la atómica intra - e intermoleculares interfaces
SSNMR es altamente complementario con técnicas estructurales como la EM o MPL medidas pero los datos también perfectamente se pueden combinar con las estructuras atómicas obtenidas por cristalografía de rayos x o solución NMR en subunidades truncados o mutados. Un número creciente de estudios puede encontrarse en la literatura donde la conjunción de diferentes datos estructurales ha permitido determinar modelos atómicos 3D de asambleas macromoleculares (ver figura 6 para ejemplos representativos).
En el campo de la biología estructural, SSNMR surge como una técnica prometedora para el estudio deinsolubles y no-cristalino asambleas en el atómico nivel, es decir, proporcionar datos estructurales a escala atómica. En este sentido, SSNMR es el colgante a solución NMR y Cristalografía de rayos x para conjuntos moleculares, incluyendo proteínas de membrana en sus asambleas de medio ambiente y de la proteína nativas como sobres virales, bacterianas filamentos o amiloides, así como RNA y Complejos RNA-proteína (véase por ejemplo81). Su gran versatilidad de aplicaciones en vitro y en el contexto celular, como el seguimiento de los cambios estructurales secundarios, terciarios y cuaternarios, identificar superficies de interacción con las moléculas del socio en la escala atómica (por ejemplo 82) y asignación dinámica molecular en el contexto de complejos montados, indican el importante potencial de SSNMR en futuros estudios estructurales sobre conjuntos de complejos biomoleculares.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Componente</td>
			<td>Medio M9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>0,5 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>3 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>6,7 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivencias2</td>
			<td>10 ΜM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FECLAS3</td>
			<td>1 ΜM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>100 ΜM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM vitamina mezcla 100 X</td>
			<td>10 mL/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13 C glucosa</td>
			<td>2 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 NH4Cl</td>
			<td>1 g/L</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 1: Composición del medio de la mínima expresión de proteínas recombinantes de producción de E. coli células BL21.

Avances en magic-angle spinning espectroscopia de estado sólido de resonancia magnética nuclear (SSNMR) ofrecen una herramienta eficaz para la caracterización estructural de asambleas macromoleculares de proteínas con una resolución atómica. Estas asambleas de proteína son sistemas ubicuos que desempeñan un papel esencial en muchos procesos biológicos. Sus estructuras moleculares, las interacciones y la dinámica es accesible por los estudios SSNMR, como se ha demostrado para viral (cápsida1) y mecanismos de infección bacteriana (secreción sistemas2,3, pili4), membrana proteína complejos5,6,7,8 y amiloides funcionales 9,10,11. Este tipo de montaje molecular también puede provocar patologías como enfermedades neurodegenerativas donde proteínas montan en Estados mal plegados, amiloides y comportamiento celular aberrante o célula muerte 12,13. Asambleas de proteína son construidos a menudo por la Oligomerización simétrico de copias múltiples de subunidades de la proteína en grandes objetos supramoleculares de varias formas incluyendo fibrillas, filamentos, poros, tubos o nanopartículas. La arquitectura cuaternaria está definida por las interacciones débiles entre las subunidades de la proteína para organizar el montaje espacial y temporal y para permitir funciones biológicas sofisticadas. Investigaciones estructurales a escala atómica en estas asambleas son un desafío para las técnicas de alta resolución desde su indisolubilidad intrínseca y muy a menudo su no-cristalinidad restringe el uso de solución NMR o Cristalografía de rayos x convencional se acerca. Magic-angle spinning SSNMR (MAS) es una técnica emergente para obtener datos de resolución atómica de asambleas macromoleculares insolubles y ha demostrado su eficacia para resolver modelos atómicos 3D para un creciente número de sistemas biomoleculares complejos, incluyendo filamentos bacterianos, las asambleas y partículas virales 14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Avances técnicos en campos magnéticos altos, desarrollos metodológicos y preparación de la muestra ha establecido MAS SSNMR en un método robusto para investigar proteínas insolubles en varios ambientes, en particular en su biológicamente relevantes macromoleculares armados estatales o en las membranas celulares, haciendo la técnica altamente complementarias a microscopia del cryo-electrón. En muchos casos, un alto grado de simetría caracteriza tales asambleas de proteína. MAS SSNMR explota esta característica, como todas subunidades de la proteína en una Asamblea de homomolecular tendría la misma estructura local y por lo tanto, prácticamente la misma SSNMR firma, reduciendo drásticamente la complejidad del análisis.
Un protocolo eficiente para estudios estructurales de los conjuntos de proteínas macromoleculares por MAS moderadas (&#60; 25 kHz) SSNMR se presenta en este video y se puede subdividir en diferentes pasos (figura 1). Le mostraremos las etapas críticas del flujo de trabajo de un estudio estructural de SSNMR ejemplificado en un conjunto de proteínas filamentosas (pasos ver resaltado en la figura 1), con la excepción de purificación de la subunidad de la proteína, diferentes para cada proteína Asamblea pero de vital importancia para los estudios estructurales y sin entrar en detalles técnicos/metodológicos del cálculo de la espectroscopia y estructura de la SSNMR para qué tutoriales especializados están disponible en línea. Mientras que el presente Protocolo se concentrará principalmente en estado sólidos experimentos NMR realizados en condiciones de MAS, el uso de alineado entornos biológicos 23,24,25,26 , 27, como bicelles alineadas, permiten la investigación de la conformación de la proteína y la interacción dinámica de proteínas en membrana-como medios sin tecnología MAS. Vamos a mostrar la expresión de la proteína y los pasos de ensamblaje así como la grabación de los espectros SSNMR cruciales y su análisis e interpretación. Nuestro objetivo es proporcionar penetraciones en la tubería de análisis estructural que permite al lector a realizar un estudio estructural de resolución atómica de una Asamblea macromolecular mediante técnicas SSNMR.
El protocolo comprende 3 secciones:
1. estado sólido producción NMR de la muestra
Como un requisito previo a un análisis de NMR de estado sólido, los componentes proteicos de la necesidad de ensamblaje macromolecular a expresarse, marcado con el isótopo, purificada y montado en vitro en el estado complejo nativo (para un ejemplo véase figura 2) . Para asegurar la alta sensibilidad de NMR, enriquecimiento del isótopo en 13C y 15N etiquetado es necesario mediante el uso de los medios de expresión bacteriana mínima complementados con 13C y 15N fuentes, tales como uniforme 13 Etiquetado C glucosa/glicerol y 15NH4Cl respectivamente. En la etapa posterior del Protocolo, selectivamente muestras marcada con C 13producción con selectivamente 13fuentes C-etiquetados como (1, 3 -13C)- y (2 -13C)-glicerol (o (1 -13C)- y (2 -13C)- glucosa) se utilizan para facilitar el análisis de NMR. Muestra etiquetada mixta correspondiente a una mezcla equimolar de 50% 13C-etiquetado o 50% y 50% 15N - (1, 3 -13C)- y el 50% (2 -13C)-glucosa se introducen para describir la detección de intermolecular interacciones. Un alto grado de pureza de proteína así como condiciones rigurosas durante el paso de montaje son factores clave para asegurar un orden estructural homogénea de la muestra final.
2. preliminar caracterización estructural basado en unidimensional NMR de estado sólido (1D)
Presentamos los experimentos esenciales para un análisis estructural de SSNMR. Unidimensional (1D) polarización transversal (CP) y INEPT / experimentos de28 RINEPT, detectados en núcleos de 13C se utilizan para detectar segmentos de proteína rígida y flexible en la Asamblea, respectivamente y para estimar el grado de estructural homogeneidad y polimorfismo local (para una ejemplo véase figura 3).
<st></st>Rong &gt; 3. Determinación de la estructura del análisis conformacional y 3D
Incisos 1 y 2 refieren al análisis conformacional, que se basan en la asignación de la resonancia SSNMR de todos los residuos rígidos de la Asamblea de la proteína, como los cambios químicos son sondas muy sensibles con el medio ambiente local y pueden utilizarse para predecir la phi/psi diedro de los ángulos y así determinar la estructura secundaria. Figura 4 ilustra un ejemplo de una asignación de resonancia secuencial en la base rígida de un conjunto de proteína. La determinación de la estructura 3D se basa en la recopilación de datos estructurales tales como las restricciones de distancia codificación cerca de cercanías (&#60; 7-9 Å), que contiene tanto intra - e intermolecular información. Incisos 3 y 4 describen interpretación y colección de moderación distante a largo plazo. Contactos de largo alcance se definen como intramolecular 13C -13C cercanías derivados residuos de i a j, con | i-j | ≥4, definiendo así el pliegue de terciaria de la proteína de la subunidad monomérica o como intermoleculares 13C -13C cercanías, definiendo las interfaces intermoleculares entre las subunidades de proteína en la Asamblea. Intra - e intermoleculares interfaces se ilustran en la figura 5. Restricciones SSNMR detectaron a través de 13C -13C y 15N -13C Asociación experimentos generalmente codifican para distancias internuclear &#60; 1 nm. Subsección 4 explica la detección de las limitaciones de la distancia intermolecular. En las Asambleas de proteína simétrica, el uso de muestras etiquetados homogéneo (es decir, 100% etiquetada uniformemente o selectivamente) para identificar las interacciones intermoleculares subunidad-subunidad es limitada, como tanto intra - y inter - molecular contactos conducen a señales detectables. La detección inequívoca de cercanías intermoleculares se logra utilizando muestras etiquetadas mixtas, que contiene una mezcla equimolar de dos muestras etiquetadas diferentemente, combinado antes de la agregación. Inciso 5 presenta brevemente modelado de la estructura.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55779/55779fig1.jpg"> 
Figura 1 : Flujo de trabajo de un estudio estructural de resolución atómica por NMR de estado sólido. 13 C, isótopo 15N marcada producción de proteínas, purificación de la subunidad, montaje de la subunidad, control de formación de la Asamblea, SSNMR experimentos, análisis de experimento SSNMR y extracción de las restricciones de distancia, y se muestran modelos de estructura. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55779/55779fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Instruments</td>RMN Espectrómetro (<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>> 11.7 Tesla)</td><td>Bruker-triple</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>resonancia MAS SSNMR probehead&nbsp;</td><td>Rotores Bruker-SSNMR</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>4mm</td><td>Centrífuga Bruker</td><td>K1910</td><td></td></tr><tr><td>5804 R&nbsp;</td><td>Espectrómetro Eppendorf</td><td>5805000629</td><td></td></tr><tr><td>GeneQuant 1300</td><td>Dutscher</td><td>28-9182-13</td><td></td></tr><tr><td>IGS60 INCUBATEUR HERATHERM 75 L</td><td>Dutscher</td><td>228001</td><td></td></tr><tr><td>MaxQ 4450 agitador orbital de sobremesa</td><td>Dutscher</td><td>78376</td><td></td></tr><tr><td>Agitador de tubo revólver</td><td>Dutscher</td><td>79547</td><td></td></tr><tr><td>sonopuls HD 3100</td><td>Bandelin</td><td>3680</td><td></td></tr><tr><td>Electroporador MicroPulser</td><td>Biorad</td><td>165-2100&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>mini-PROTEAN sistema de tetracélulas</td><td>Biorad</td><td>165-8000</td><td></td></tr><tr><td>AKTA sistema puro</td><td>GE Healthcare</td><td>29-0182-24</td><td></td></tr><tr><td>microman capilar pipeta M25</td><td>Gilson&nbsp;</td><td>F148502</td><td></td></tr><tr><td>Nombre</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>Materiales</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>amiconR ultra-15</td><td>sigma</td><td>Z740199-8EA</td><td></td></tr><tr><td>capilares y pistones</td><td>Gilson&nbsp;</td><td></td><td></td>F148112</tr><tr><td>espátula</td><td>Fisher</td><td>13263799</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</strong</td></tr><tr><td>>strong<>Reactivos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-glucosa 13C6</td><td>Sigma</td><td>389374</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de amonio-15N</td><td>Sigma</td><td>299251</td><td></td></tr><tr><td>1,3 13C2 glicerol</td><td>Sigma</td><td>492639</td><td></td></tr><tr><td>2 13C glicerol</td><td>Sigma</td><td>489484</td><td></td></tr><tr><td>Kanamicina</td><td>Sigma</td><td>K1876</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillina</td><td>Sigma</td><td>C3416</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio dibásico</td><td></td><td>Sigma S7907</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potasio monobásico</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma</td><td>71380</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio</td><td>Sigma</td><td>208094</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de hierro</td><td>Sigma</td><td>157740</td><td></td></tr><tr><td>Solución vitamínica de cloruro de zinc</td><td>Sigma</td><td>793523</td><td></td></tr><tr><td>MEM (100&times;)</td><td>Sigma</td><td>M68954</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Fisher</td><td>BP1755</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Tricina</td><td>Sigma</td><td>T0377</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>436143</td><td></td></tr><tr><td>azida sódica</td><td>sigma</td><td>71289</td><td></td></tr><tr><td>ácido 4,4-dimetil-4-silapentano-1-sulfónico&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>178837</td><td></td></tr><tr><td>Nombre</fuerte></td><td><fuerte>Empresa</fuerte></td><td><fuerte>Número de catálogo</fuerte></td><td><fuerte>Comentarios</fuerte></td></tr><tr><td><fuerte>Softwares</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Unicornio 6.3</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>Akta systems</td></tr><tr><td>ccpNMR</td><td>CCPN&nbsp;</td><td></td><td>Sistemas de espectrómetros</td></tr></tbody></table>

estudios estructurales de escala atómica de asambleas macromoleculares por espectroscopia de estado sólido de resonancia magnética nuclear

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Asambleas supramolecular proteínas desempeñan un papel fundamental en procesos biológicos que van desde la interacción huésped-patógeno, infección viral a la propagación de enfermedades neurodegenerativas. Estos conjuntos consisten en múltiples subunidades de la proteína organizados de forma no covalente para formar objetos macromoleculares grandes que puedan ejecutar una variedad de funciones celulares o producir consecuencias perjudiciales. Penetraciones atómicas en los mecanismos de montaje y el funcionamiento de las Asambleas macromoleculares siguen siendo a menudo escasas desde su inherente insolubilidad y cristalinidad no reduce a menudo drásticamente la calidad de los datos obtenidos de la mayoría de las técnicas utilizada en biología estructural, tales como Cristalografía de rayos x y resonancia magnética Nuclear (RMN) de solución. Aquí presentamos RMN Espectroscopia de estado sólida magic-angle spinning (SSNMR) como un potente método para investigar las estructuras de asambleas macromoleculares a resolución atómica. SSNMR puede revelar detalles atómicos del complejo montado sin limitaciones de tamaño y solubilidad. El protocolo que presentamos describe los pasos esenciales de la producción de 13C / asambleas de proteína macromolecular marcado con el isótopo15N a la adquisición de espectros SSNMR estándar y su análisis e interpretación. Como ejemplo, mostramos la tubería de un análisis estructural de SSNMR de un conjunto de proteínas filamentosas.

El flujo de trabajo típico de SSNMR incluye varios pasos ilustrados en la figura 1. Generalmente las subunidades de la proteína son producidas por en vitro expresión heteróloga en e. coli, purificadas y montadas bajo agitación, pero a veces también en condiciones estáticas. Expresión y purificación de la subunidad de la proteína se siguieron por cromatografía de gel de la SDS (figura 2A). La formación de asambleas macromoleculares puede entonces confirmarse por análisis de microscopia electrónica (EM) (ver figura 2B para un ejemplo de un conjunto de filamentos).
Después de la introducción de la Asamblea de la proteína en el rotor SSNMR, el rotor se inserta en el espectrómetro, la frecuencia del MAS y la temperatura están reguladas y se registran los espectros. Primeras penetraciones pueden obtenerse mediante técnicas SSNMR D 1. La figura 3 muestra un típico FID SSNMR detectado en el canal 13C en una muestra estructuralmente homogénea de proteínas, un 1H -13C CP espectro, revelar las resonancias de13C presentes en el núcleo rígido de la subunidad de la proteína en la Asamblea y un espectro C inepto 2D 1H -13, que representan los residuos móviles. Para penetraciones atómicas en el núcleo rígido de la estructura de la Asamblea, experimentos SSNMR multidimensionales necesitan grabarse en uniformemente y de forma selectiva con la etiqueta muestras para asignar primero las resonancias SSNMR y luego detectar proximidades a largo plazo (ver figura 4 del ).
Todos los espectros son procesados y analizados con el software adecuado para asignar las resonancias SSNMR y extraer intra - y las restricciones de la distancia intermolecular (figura 5). Las restricciones de distancia SSNMR se utilizan ya sea por separado o en conjunto con los datos de técnicas complementarias, que pueden ser integrados en el programa de modelado.
Para estructuras atómicas representativas de asambleas macromoleculares solucionados mediante técnicas SSNMR la figura 6 ilustra varias asambleas filamentosos de apéndices bacterianos y las fibrillas amiloideas.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55779/55779fig6v2.jpg"> 
Figura 6:filamentosas estructuras macromoleculares determinadas por un enfoque de NMR de estado sólido: filamentos bacterianos y las fibrillas de la proteína amiloide. A) pilus de tipo 1 de uropatógenos e.coli, PDB código 2N7H 4; Filamento B) ASC, PDB código 2N1F 63; C) agujas de sistema de secreción tipo III, PDB códigos 2MME, 2LPZ y 2MEX 2,3,64; D) fibrillas de amiloide-beta de Aβ42, PDB código 2NAO, 5KK3, 2MXU 65,66,67 y Osaka mutante PDB código 2MVX 57, Iowa mutante PDB código 2MPZ 58; E) fibrillas de alfa-sinucleína, PDB código 2N0A 68; F) dominio de HET-s del prión, PDB código 2RNM, 2KJ3 69,70. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55779/55779fig6v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Estructuras de conjuntos supramoleculares proteína a resolución atómica son de alta relevancia debido a su papel crucial en una variedad de fenómenos biológicos. Adjunto, presentamos un protocolo para llevar a cabo estudios estructurales de alta resolución en asambleas de proteína macromolecular insoluble y no-cristalino magic-angle spinning estado sólido de resonancia magnética nuclear espectroscopia (MAS SSNMR).

Estudios estructurales de escala atómica de asambleas macromoleculares por espectroscopia de estado sólido de resonancia magnética Nuclear

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

El objetivo general de este protocolo es estudiar las estructuras de ensamblajes proteicos supramoleculares insolubles y no cristalinos a resolución atómica mediante espectroscopía de RMN en estado sólido con rotación mágica del ángulo. Presentaremos los pasos metodológicos esenciales para estudiar las estructuras atómicas de ensamblajes proteicos biomoleculares mediante RMN en estado sólido. El estudio de las estructuras atómicas de estos ensamblajes es extremadamente difícil porque son inherentemente insolubles y no cristalinos.La RMN en estado sólido es una técnica emergente capaz de estudiar la estructura molecular y la dinámica a resolución atómica sin estar limitada por el tamaño del objeto ensamblado ni por su solubilidad. Aquí ilustramos los pasos clave para visualizar estructuras atómicas de ensamblajes proteicos biomoleculares mediante RMN en estado sólido, incluyendo la preparación de muestras con marcado isotópico, la recopilación y el análisis de datos estructurales obtenidos por RMN en estado sólido. El primer paso en un flujo de trabajo de RMN en estado sólido es la producción de subunidades proteicas marcadas con C13 y N15 y su ensamblaje *in vitro*.Inocule un cultivo previo de 15 ml de medio LB precalentado con una colonia de células de E. coli transformadas. Incube a 37 grados Celsius con agitación de 200 RPM durante la noche. Para inocular el cultivo principal, transfiera todo el cultivo previo a un litro de medio N9 precalentado que contenga las fuentes necesarias de carbono y nitrógeno marcadas isotópicamente.Estos pueden incluir cloruro de amonio marcado con N15, glucosa uniformemente marcada con C13, glucosa selectivamente marcada con C13 o glicerol selectivamente marcado con C13. Incubar a 37 grados y medir la densidad óptica a 600 nanómetros tan pronto como el cultivo se vuelva turbio. Cuando la DO alcance un valor de 0,8, inducir la expresión proteica con IPTG 0,75 milimolar durante cuatro horas. Tenga en cuenta que las condiciones óptimas de inducción pueden variar de una proteína a otra.Recuperar las células mediante centrifugación durante 30 minutos a 6.000 G y cuatro grados. Después de la purificación de las subunidades proteicas, se ensamblan in vitro. Concentrar la proteína hasta aproximadamente un milimolar en una unidad de filtro centrífugo.Para ello, introduzca la muestra en la unidad de filtración y centrifugue a 4.000 G durante 30 minutos. Entre cada paso de centrifugación, mezcle suavemente la solución en la unidad de filtración con una pipeta para evitar la deposición de proteínas en la membrana del filtro. Repita el procedimiento hasta alcanzar la concentración deseada.Transfiera la muestra a un tubo falcon e incube bajo agitación durante una semana a temperatura ambiente. Por lo general, la polimerización de las subunidades en filamentos va acompañada por el enturbiamento de la solución. Añada azida sódica al 0,02% peso por volumen para evitar la contaminación bacteriana.Para cosechar el ensamblaje proteico, centrifugue la muestra durante una hora a 20.000 G y cuatro grados. Aspire la mayor parte del sobrenadante dejando solo suficiente líquido para cubrir la superficie y evitar que la muestra se seque, y almacene la muestra a cuatro grados hasta su medición. Presentaremos los experimentos esenciales para un análisis estructural mediante RMN en estado sólido.Experimentos unidimensionales de polarización cruzada, o CP, y de inept detectados en núcleos de C13 se utilizan para detectar segmentos proteicos rígidos y flexibles en el ensamblaje, respectivamente, y para estimar el grado de homogeneidad estructural y polimorfismo local. Aquí, utilizamos valores experimentales estándar.Se indican los rangos típicos de parámetros en el protocolo. Inserte el rotor en el imán de RMN y comience el giro al ángulo mágico según se describe en el protocolo. Establezca la frecuencia de giro deseada y asegúrese de que se estabilice dentro de ±10 hercios.Registre un espectro de protón unidimensional pulsado individual utilizando 16 escaneos. Configure un experimento de protón 1D con carbono CP. Los experimentos CP muestran las señales que surgen de los restos en una conformación rígida. Los parámetros iniciales del experimento se toman de un procedimiento estándar de optimización en un compuesto de referencia.La calibración de los pulsos y los parámetros de desacoplamiento pueden optimizarse en la muestra cuando la sensibilidad es suficientemente alta. Aquí, registramos un CP con 16 escaneos. El tiempo de contacto CP y los niveles de potencia se eligen según la intensidad máxima de la señal, como se demuestra aquí para la optimización del tiempo de contacto CP.La intensidad máxima en este ejemplo se alcanza a los 800 milisegundos. Los parámetros de desacoplamiento también deben reajustarse a partir de los establecidos inicialmente mediante la calibración del compuesto de referencia. Por último, observe cuidadosamente la localización de las bandas satélite de giro a la frecuencia de giro al ángulo mágico dada, mostrada aquí a 18 kilohercios, para evitar solapamiento con la señal.Registre un espectro de referencia de carbono-protón en 1D con CP que sirve como huella espectral unidimensional. Aquí, acumulamos 128 escaneos con un tiempo de contacto CP de 800 milisegundos, una intensidad de desacoplamiento de 100 kilohercios, un retardo de reciclaje de tres segundos y un tiempo de adquisición de 20 milisegundos. Procese el experimento CP sin apodización.Seleccione un pico aislado para estimar el C39 dentro de la muestra, lo que indica orden estructural y homogeneidad. Aquí, el ancho de línea, medido como el ancho completo a media altura, es de aproximadamente 60 a 70 hercios, lo que indica una estructura proteica bien ordenada en el ensamblaje. Configure un experimento unidimensional de inept de carbono-protones para analizar las partes altamente móviles del ensamblaje proteico.Registre un experimento de ineptitud de referencia para servir como huella dactilar de los segmentos de proteína móviles. Los parámetros típicos son 128 escaneos y un tiempo de adquisición de 25 milisegundos. Procese el experimento de ineptitud de carbono protónico.El número de señales y sus posiciones indican el grado de movilidad de los residuos y la composición de aminoácidos, respectivamente. Aquí, solo se observa la señal del tampón de giro CH2 merit-y, ya que toda la proteína se encuentra en un régimen rígido en la estructura del ensamblaje. El análisis conformacional de la estructura proteica se basa en las asignaciones de resonancia de RMN en estado sólido para todos los residuos rígidos del ensamblaje.Esto es posible porque los desplazamientos químicos son sondas altamente sensibles del entorno químico local, y pueden utilizarse para predecir la estructura secundaria de la proteína. La determinación completa de la estructura tridimensional se basa entonces en la recopilación de datos estructurales, como restricciones de distancia que codifican las proximidades atómicas intra e intermoleculares hasta nueve angstrom. A continuación, mostraremos cómo se registran los experimentos básicos en dos dimensiones y presentaremos un ejemplo de asignación secuencial.A continuación, daremos una breve demostración sobre cómo recopilar restricciones de distancia a partir de experimentos registrados en muestras selectivamente marcadas con C13. Configure el experimento bidimensional de PDSD de carbono-carbono con un tiempo corto de mezcla para detectar la correlación entre carbonos dentro del mismo residuo. Copie los valores del paso inicial de polarización cruzada protón-carbono del experimento unidimensional de CP.La mezcla puede establecerse en 50 milisegundos para muestras uniformemente marcadas con C13. Aquí, hemos elegido un tiempo de adquisición de 15 y 20 milisegundos en las dimensiones indirecta y directa, respectivamente. Para procesar el espectro PDSD, utilizamos una función de ventana QSINE con un desplazamiento de campana sinusoidal de 3,5.Para permitir la asignación específica de residuos, utilice los ajustes del PDSD de tiempo de mezcla corto para registrar un PDSD de tiempo de mezcla intermedio con un tiempo de mezcla de 100 a 200 milisegundos. Tenga en cuenta que a menudo se requieren espectros adicionales, incluidos experimentos detectados por nitrógeno, para una asignación completa de resonancias, y estos se detallan en el protocolo. Elija un programa de análisis de RMN, como CCPNMR Analysis.Cargue los espectros 2D en el software y cree un objeto molecular con la secuencia proteica principal. Comience con la identificación de los tipos de aminoácidos que son visibles en el espectro PDSD de tiempo de mezcla corto. Conectar los átomos de carbono de los sistemas de espín permite la asignación específica según el tipo de residuo.Aquí, asignamos el sistema de espín de un residuo de thenium. Las transferencias de polarización entre los núcleos C-alfa, C-beta y C-gamma generan picos cruzados físicos en el espectro PDSD. Intente identificar tantos residuos como sea posible mediante este procedimiento.Superponga ambos espectros PDSD con tiempos de mezclado corto e intermedio. Los picos adicionales visibles en el espectro PDSD con tiempo de mezclado intermedio suelen originarse por contactos entre residuos secuenciales. Marque los picos de resonancia de un sistema de espines y busque correlaciones en el espectro PDSD con tiempo de mezclado intermedio con las frecuencias de resonancia de otros sistemas de espines.Mostramos la asignación secuencial con thenium 33 a isolutano 32 en nuestro ensamblaje de proteína filamentosa. Las frecuencias de resonancia del sistema de espín de thenium son visibles en una frecuencia de carbono de los isolutanos en 32, y viceversa. En el protocolo se describen los procedimientos para la asignación mediante espectros detectados por nitrógeno y para obtener la estructura secundaria de la proteína a partir de las asignaciones.Tras una asignación completa de resonancias, podemos proceder con la identificación de restricciones de largo alcance. Las restricciones de largo alcance son proximidades intra o intermoleculares entre átomos de carbono de residuos distantes, que definen tanto el plegamiento terciario de las subunidades monoméricas como la disposición de las subunidades dentro del ensamblaje. Aquí, las muestras marcadas selectivamente con C13 tienen una importancia particular.Superponga un PDSD con tiempo de mezclado intermedio con un PDSD de carbono-carbono con tiempo de mezclado largo, registrado con un tiempo de mezclado entre 400 milisegundos y un segundo, en una muestra selectivamente marcada con C13. Si es posible, ambos PDSD deben haberse registrado en la misma muestra selectivamente marcada. Los picos suplementarios surgen de correlaciones entre átomos de C13 más distantes.Durante la asignación de resonancias, tenga en cuenta el esquema de marcado selectivo. En este caso, glicerol 1-3. Aquí, hemos resaltado un ejemplo de un pico de contacto de largo alcance con una asignación inequívoca en ambas dimensiones.Thenium 33 C-beta con proteína 45 C-alfa. Tras completar la identificación de distancias a largo alcance, las restricciones se clasifican como ambiguas o no ambiguas, así como intramoleculares o intermoleculares. Las listas de restricciones que deben prepararse para la modelización estructural se enumeran en el protocolo.Se pueden encontrar tutoriales sobre modelado estructural utilizando diferentes programas en línea. Los datos de RMN en estado sólido, ya sea por sí solos o en conjunto con datos complementarios, pueden permitir la determinación de estructuras a nivel atómico de ensamblajes supramoleculares. Las ventajas de la RMN en estado sólido son, por un lado, la capacidad de proporcionar información sobre la estructura secundaria y restricciones de distancia atómica provenientes de interfaces intramoleculares, que pueden integrarse en el proceso de modelado.Sin embargo, por otro lado, la característica única de la espectroscopía de RMN en estado sólido radica en su capacidad para obtener restricciones de distancias atómicas en las interfaces intermoleculares de un ensamblaje supramolecular intacto. La detección y distinción entre asignaciones de restricciones intra e intermoleculares puede ser, no obstante, un proceso tedioso y normalmente requiere la preparación de muestras selectivamente marcadas con C13. Sin embargo, con los nuevos avances en estrategias de marcado selectivo, diseño de hardware para espectrómetros y metodologías de RMN en estado sólido, la técnica está cumpliendo cada vez más su potencial teórico de proporcionar información molecular a nivel atómico sin limitaciones por el tamaño del objeto, el orden de largo alcance o la cristalinidad.Este método nos permite estudiar la estructura atómica de ensamblajes biomoleculares. Es muy importante preparar cuidadosamente la muestra para optimizar las condiciones de RMN y obtener datos de alta resolución. Con este protocolo, podemos obtener resoluciones atómicas que proporcionan información sobre los ensamblajes de proteínas.Y esta técnica puede combinarse con otras técnicas en biología estructural para obtener modelos tridimensionales.

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Investigación

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