Name: Flujo de trabajo sin manchas V3 para un control de carga total de proteínas práctico, conveniente y confiable en Western Blotting (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-30T20:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 33 s
Description: Aprende el flujo de trabajo V3 para Western blotting utilizando geles sin tinción TGX. Este método permite normalizar proteínas objetivo mediante medición de proteína total sin tinción, mejorando la cuantificación confiable.

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Los autores agradecen al Dr. Wolf-Dieter Stalz, al Dr. Arnaud Remy, al Dr. Anton Posch, a la Dra. Patricia Piatti, a Tom Davies, a Kris Simonyi y a Jeff Durban por su revisión crítica y edición de este manuscrito. Los autores también agradecen a Allison Schwartz por su apoyo técnico.

1. Preparación de muestras de proteínas
(Se describe un procedimiento típico para extraer proteínas del cultivo celular)
<ol><li>Coloque el plato de cultivo celular HeLa en hielo y lave las células con solución salina tamponada tris helada (TBS; 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl).</li>
	<li>Aspirar el TBS, luego añadir 1 ml por tampón RIPA helado de 100 mm (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% desoxicolato de sodio, 0.1% SDS) complementado con inhibidores de fosfatasa y proteasa.</li>
	<li>Raspe las células adherentes del plato usando un raspador de células de plástico frío; transfiera suavemente la suspensión celular a un tubo microcentrífuga preenfriado.</li>
	<li>Mantenga la agitación constante durante 30 minutos a 4 °C en un rotador.</li>
	<li>Girar a 16.000 x g durante 20 min en una centrífuga preenfriada de 4 °C.</li>
	<li>Retire suavemente el tubo de la centrífuga y colóquelo sobre hielo. Transfiera el sobrenadante a un tubo fresco mantenido en hielo y deseche el pellet.</li>
	<li>Retire un pequeño volumen (10-20 μl) de lisato para realizar un ensayo de proteínas. Determine la concentración de proteínas para cada muestra utilizando el kit de ensayo RC DC.</li>
	<li>Si es necesario, alícuota las muestras de proteína para su almacenamiento a largo plazo a -20 °C. Repetir los ciclos de congelación y descongelación causa degradación de proteínas y debe evitarse.</li>
	<li>Tome aproximadamente 20 μg de cada muestra, agregue un volumen igual de 2x Laemmli Sample Buffer (4% SDS, 10% 2-mercaptoetanol, 20% glicerol, 0.004% bromofenol azul, 125 mM Tris-HCl, pH 6.8).</li>
	<li>Calentar cada celda de lisiar en tampón de muestra a 95 °C durante 5 min.</li>
	<li>Centrífuga a 16.000 x g en una microcentrífuga durante 1 min.</li>
</ol>2. Electroforesis en gel con geles sin manchas (~ 30 min)
<ol><li>Tome un criterio TGX Cualquier gel prefabricado sin manchas KD (un gel de formato midi), retire el peine y la cinta de la parte inferior del cassette.</li>
	<li>Coloque el cassette en la celda Criterion y llene la cámara tampón superior integrada con un tampón de 60 ml (25 mM Tris, 190 mM de glicina, 0,1% de SDS, pH 8,3). Enjuague los pozos con un búfer en funcionamiento.</li>
	<li>Llene cada mitad del tanque de búfer inferior con un tampón de 400 ml en funcionamiento hasta la línea de llenado marcada.</li>
	<li>Cargue las muestras de proteína y los marcadores de proteína apropiados.</li>
	<li>Coloque la tapa en el tanque, alineando los tapones de plátano codificados por colores con los gatos correspondientes en la tapa.</li>
	<li>Ejecute el gel durante ~ 30 minutos a 200 V o 20 minutos a 300 V.</li>
</ol>3. Imágenes de gel sin manchas utilizando el sistema Chemidoc MP para verificar la calidad de separación de proteínas (~ 5 min)
<ol><li>Retire el cassette de gel de la célula. Utilice la herramienta de apertura de cassette de gel en la tapa de Criterion Cell para abrir el cassette y soltar el gel.</li>
	<li>Aplique un par de mililitros de agua en el centro de la bandeja de muestras UV del captador de imágenes ChemiDoc MP. Levante cuidadosamente el gel del cassette y colómelo en la bandeja.</li>
	<li>Inicie el software Image Lab y capture la imagen de gel sin manchas (Figura 1A) con los siguientes ajustes: Aplicación: gel sin manchas Tiempo de activación del gel: 1 min Área de imagen: gel criterio Tiempo de exposición de la imagen: optimizado automáticamente para las bandas más intensas</li>
	<li>Retire el gel de la bandeja de muestra y proceda inmediatamente a la transferencia paso.</li>
</ol>4. Transferencia de proteínas con el sistema Trans-Blot Turbo (~ 10 min)
<ol><li>Abra un paquete de transferencia Trans-Blot Turbo Midi PVDF; coloque la pila inferior (que incluye la membrana) en la base del cassette de transferencia.</li>
	<li>Coloque el gel en la parte superior de la membrana, coloque la pila superior en el gel y despliegue burbujas.</li>
	<li>Coloque la tapa sobre la base del cassette y gire el dial para bloquearlo.</li>
	<li>Inserte el cassette en la bahía de blotter.</li>
	<li>Inicie la transferencia seleccionando un programa Turbo preestablecido y eligiendo el tamaño del gel Criterion (midi) y, a continuación, presione EJECUTAR. Una carrera típica toma sólo 7 minutos.</li>
	<li>Cuando termine la transferencia, desmonte el sándwich secante y coloque tanto la mancha blanca /negra como el gel en un recipiente con agua desionizada.</li>
</ol>5. Gel sin manchas e imágenes de manchas usando el sistema Chemidoc MP para verificar la eficiencia y calidad de la transferencia de proteínas (~ 5 min)
<ol><li>Coloque el gel posterior a la transferencia en la bandeja de muestra del imager ChemiDoc MP.</li>
	<li>Inicie el software Image Lab y capture la imagen libre de manchas del gel posterior a la transferencia (Figura 1B) con los siguientes ajustes: Aplicación: gel sin manchas Tiempo de activación del gel: ninguno Área de imagen: gel criterio Tiempo de exposición de la imagen: igual al tiempo de exposición para la imagen de gel pretransferible</li>
	<li>Retire el gel de la bandeja de muestra y, a continuación, la imagen de la mancha blanca /negra (Figura 1C) con los siguientes ajustes. Mantenga la mancha blanca /negra mojada con unas gotas de agua o TBST al realizar la toma de imágenes. Aplicación: mancha libre de manchas Área de imagen: gel criterio Tiempo de exposición de la imagen: optimizado automáticamente para las bandas más intensas</li>
	<li>Retire la membrana secante de la bandeja de muestra y colóquela en un recipiente con TBST (0,1% Tween 20 en TBS).</li>
</ol>6. Incubación de anticuerpos
<ol><li>Bloquee colocando la mancha blanca /negra en una solución de la albúmina de suero bovino del 3% (BSA) en TBST en la temperatura ambiente por 1 hora.</li>
	<li>Incubar la mancha blanca /negra durante la noche a 4 °C en la solución que contiene anticuerpo primario de ratón levantado contra la primera proteína diana y anticuerpo primario de conejo levantado contra la segunda proteína diana.</li>
	<li>Vierta la solución que contiene el anticuerpo primario. A continuación, lave la mancha agitando en 20 ml de TBST durante 5 min. Repetir 4x para un total de 5 lavados.</li>
	<li>Incubar durante 1 hora a temperatura ambiente en la solución de anticuerpos secundarios que contiene un anticuerpo conjugado de cabra-anti-ratón Dylight 650 y un anticuerpo conjugado de cabra-anti-conejo Dylight 549.</li>
	<li>Vierta la solución que contiene el anticuerpo primario. A continuación, lave la mancha agitando en 20 ml de TBST durante 5 min. Repetir 4x para un total de 5 lavados.</li>
</ol>7. Imágenes y análisis de datos por software de laboratorio de imágenes- Normalización de proteínas totales (~ 5 min)
<ol><li>Adquirir una imagen fluorescente multiplexante de la mancha blanca /negra (Figura 1E) abriendo un nuevo protocolo multicanal, configurar tres canales fluorescentes y ejecutar el protocolo. Canal 1: Aplicación: blot Dylight 650 Área de imagen: gel criterio Tiempo de exposición de la imagen: optimizado automáticamente para las bandas más intensas Canal 2: Aplicación: blot Dylight 549 Área de imagen: gel criterio Tiempo de exposición de la imagen: optimizado automáticamente para las bandas más intensas Canal 3: Aplicación: mancha libre de manchas Área de imagen: gel criterio Tiempo de exposición de la imagen: optimizado automáticamente para las bandas más intensas</li>
	<li>Haga clic en el icono Normalización del Cuadro de herramientas Análisis y haga clic en Sí para detectar carriles y bandas.</li>
	<li>Seleccione y utilice "Herramientas de carriles y bandas" para realizar ajustes en los carriles y bandas si es necesario.</li>
	<li>Seleccione imagen libre de manchas como canal de normalización.</li>
	<li>Seleccione Herramientas de análisis de MW y asigne los carriles estándar de MW marcando las casillas debajo de ellos.</li>
	<li>Para ver los volúmenes normalizados, haga clic en la Tabla de análisis de la barra de herramientas. Todos los cálculos serán realizados automáticamente por el software, incluyendo el factor de normalización y volúmenes normalizados. Los valores de intensidad de la banda de la proteína objetivo ahora se ajustan para la variación en la carga de proteínas. Esto permitirá comparaciones precisas de proteínas diana entre las muestras.</li>
</ol>

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<li>Colella, A. D., Chegenii, N., Tea, M. N., Gibbins, I. L., Williams, K. A., Chataway, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Stain-Free+gels+with+traditional+immunoblot+loading+control+methodology%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Comparison of Stain-Free gels with traditional immunoblot loading control methodology.</a> Anal. Biochem. 430 (2), 108-110 (2012).</li>
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<li>Dutka, T. L., Lamboley, C. R., McKenna, M. J., Murphy, R. M., Lamb, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+carnosine+on+contractile+apparatus+Ca2%2B+sensitivity+and+sarcoplasmic+reticulum+Ca2%2B+release+in+human+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of carnosine on contractile apparatus Ca2+ sensitivity and sarcoplasmic reticulum Ca2+ release in human skeletal muscle fibers.</a> J. Appl. Physiol. 112 (5), 728-736 (2012).</li>
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<li>Gürtler, A., Kunz, A., Gomolka, M., Hornhardt, S., Friedl, A. A., McDonald, K., Kohn, J. E., Posch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stain-Free+Technology+as+Normalization+Tool+in+Western+Blot+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Stain-Free Technology as Normalization Tool in Western Blot Analysis.</a> Anal. Biochem. 433 (2), 105-111 (2013).</li>
<li>Hagiwara, M., Kobayashi, K., Tadokoro, T., Yamamoto, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+SYPRO+Ruby-+and+Flamingo-stained+polyacrylamide+gels+to+Western+blot+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Application of SYPRO Ruby- and Flamingo-stained polyacrylamide gels to Western blot analysis.</a> Anal. Biochem. 397 (2), 262-264 (2010).</li>
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<li>Lanoix, D., St-Pierre, J., Lacasse, A. A., Viau, M., Lafond, J., Vaillancourt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+of+reference+proteins+in+human+placenta%3A+general+protein+stains+are+the+benchmark%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Stability of reference proteins in human placenta: general protein stains are the benchmark.</a> Placenta. 33 (3), 151-156 (2012).</li>
<li>Larkins, N. T., Murphy, R. M., Lamb, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influences+of+temperature%2C+oxidative+stress%2C+and+phosphorylation+on+binding+of+heat+shock+proteins+in+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Influences of temperature, oxidative stress, and phosphorylation on binding of heat shock proteins in skeletal muscle fibers.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 3 (6), (2012).</li>
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</ol>

Los autores, Anton Posch, Jonathan Kohn, Kenneth Oh, Matt Hammond y Ning Liu son empleados de Bio-Rad Laboratories, Inc.

El protocolo mancha-libre V3 descrito arriba está para multiplexar borrar occidental fluorescente. También se puede aplicar en western blotting usando la detección quimioluminiscente. En el protocolo occidental fluorescente múltiplex de la mancha blanca /negra, las imágenes mancha-libres de la mancha blanca /negra se adquieren en dos puntos del tiempo: 1) derecho después de transferencia de la proteína; 2) en el paso fluorescente múltiplex de la proyección de imagen después de la incubación del anticuerpo. La primera imagen libre de manchas se utiliza para calcular la eficiencia de transferencia y la segunda imagen libre de manchas se utiliza como control de carga. Cuando se aplica el método quimioluminiscente, no es posible tomar una imagen múltiplex para las señales de proteína libre de manchas y diana, porque la señal quimioluminiscente también aparecerá en el canal libre de manchas. En este caso, recomendamos utilizar la imagen libre de manchas tomada justo después del paso de transferencia de proteínas para el control de carga y el análisis de normalización.
El flujo de trabajo occidental V3 proporciona los siguientes beneficios únicos en comparación con el flujo de trabajo tradicional de western blot que utiliza proteínas de limpieza como controles de carga:
En primer lugar, el flujo de trabajo V3 proporciona un control de carga práctico, conveniente y más fiable para validar los cambios en el nivel de la proteína de interés. El protocolo V3 utiliza un control de carga total de proteínas para normalizar el nivel de la proteína de interés medido en cada muestra. Evita dos escollos de usar las proteínas de limpieza como controles de carga: inmunodetección saturada y niveles inconsistentes de expresión de proteínas de limpieza entre las muestras bajo ciertas condiciones experimentales. Ya no es necesario despojar y sondear los pasos con anticuerpos dirigidos contra la limpieza. Utilizando la tecnología libre de manchas, no hay necesidad de manchar y des-manchar una mancha con manchas como Coomassie o Sypro Ruby para la medición de la proteína total. Se tarda solo unos segundos en adquirir una imagen de mancha y unos 5 minutos para hacer la normalización total de proteínas utilizando el software Image Lab.
En segundo lugar, el flujo de trabajo V3 permite a los científicos tomar un mejor control del procedimiento occidental porque hace que el procedimiento sea más transparente e introduce varios puntos de control para el control de calidad. Con la ayuda de la tecnología libre de manchas, los investigadores pueden visualizar sus muestras de proteínas tanto en el gel como en la mancha blanca /negra. Los científicos pueden evaluar la integridad de la muestra de proteínas (degradadas o no), la calidad de la separación (precipitada o no), la eficiencia de la transferencia y la calidad de la transferencia (incluso la transferencia o no). Estos puntos de control ayudan a las investigaciones a terminar el experimento cuando ven grandes fallas en el proceso y evitan perder el tiempo en muestras pobres y manchas. Esta tecnología también ayuda a los científicos a evaluar si hay una cantidad significativa de pérdida de proteínas después de la extracción de la membrana y si la mancha blanca /negra es adecuada para volver a sondear un objetivo diferente 4.
Aquí hay algunos consejos para garantizar una buena experiencia y datos de calidad utilizando el flujo de trabajo occidental V3.
<ol><li>Imagen del gel inmediatamente después de la ejecución del gel. No remoje el gel en ningún tampón antes de la primera toma de imágenes en el procedimiento, ya que puede lavar el compuesto de tinción.</li>
	<li>Utilice la misma área de imágenes para adquirir todas las imágenes del protocolo. Esto permitirá que el software superponga imágenes para el análisis de datos, como la normalización de proteínas totales.</li>
	<li>Mantenga el tiempo de exposición constante al toma de imágenes de los geles pretransferibles y post-transferencia. Esto permitirá que el software mida cuantitativamente la eficiencia de la transferencia.</li>
	<li>Mantenga la membrana húmeda con unas gotas de agua o TBST al adquirir la imagen de la mancha blanca /negra. Esto evitará posibles problemas de fondo sucio para la detección de proteínas objetivo.</li>
	<li>Utilice la membrana de PVDF de baja fluorescente para la multiplexación de western blotting fluorescente.</li>
</ol>Es importante tener en cuenta que la molécula libre de manchas después de la activación uv está irreversiblemente unida a los residuos de triptófano. Esta modificación irreversible puede afectar potencialmente al reconocimiento del antígeno al usar los anticuerpos monoclonales si el epítopo contiene el triptófano. Los anticuerpos policlonales son poco probables ser afectados porque reconocen epítopos múltiples en el antígeno. Las moléculas libres de manchas no unidas se lavan fácilmente del gel y la membrana y, por lo tanto, no interferirán con las interacciones anticuerpo-antígeno.
En conclusión, el flujo de trabajo occidental V3 hace que el proceso de western blot sea más rápido, más transparente, cuantitativo y más confiable. Los investigadores ahora pueden aplicar fácilmente el control de carga total de proteínas en un experimento de western blot para que sus datos sean más confiables. El flujo de trabajo libre de manchas V3 ha sido adoptado por varios laboratorios, y sus publicaciones han demostrado que las revistas aceptan datos libres de manchas como control de carga en western blot22,17,7,8,5,23,18,15.

Western blot es una técnica muy útil9,sin embargo, hay dos desafíos principales con western blotting: proceso largo y laborioso y calidad de los datos. Un protocolo tradicional requiere aproximadamente 2 días. Implica muchos pasos que incluyen la preparación de la muestra, el bastidor del gel, la electroforesis y la transferencia de la proteína, el bloqueo de la membrana seguido por la incubación del anticuerpo, la proyección de imagen, y muy a menudo pelando, reprobando, y finalmente el análisis de datos. A lo largo de este proceso, no existen herramientas fiables y flexibles para el control de procesos. Como tal, los errores se pueden introducir en cada paso, y estos errores tienen el potencial de generar artefactos de datos; por lo tanto, los controles de carga son esenciales en western blotting para identificar y corregir los errores. El control de carga se realiza generalmente comprobando el nivel de proteína de una proteína de referencia en cada muestra para ver si se presenta por igual. Las personas a menudo usan proteínas domésticas, como β-actina, β-tubulina, GAPDH, como control de carga. 
La calidad de los datos de western blot depende de un control de carga fiable. Pero hay dos preocupaciones legítimas cuando se utilizan proteínas de limpieza para los controles de carga: 1) la inmunodetección basada en anticuerpos de las bandas de proteínas de limpieza a menudo están saturadas y, por lo tanto, no se pueden distinguir las diferencias de carga entre las muestras30; 2) el nivel de expresión de la proteína de limpieza puede variar en las muestras bajo ciertas condiciones experimentales, por ejemplo, tratamiento con siRNA, muerte celular, diferenciación celular, etc.11,28,3,6,10,21. Debido a estas preocupaciones, las revistas científicas ahora están requiriendo que "para las comparaciones cuantitativas, se utilicen reactivos apropiados, controles y métodos de imagen con rangos de señales lineales" (guía de Nature). Del mismo modo, los editores del Journal of Clinical Investigation están pidiendo controles de carga más fiables24. Por estas razones, una proteína de limpieza necesita ser validada para ser utilizada como control de carga. En primer lugar, hay que asegurarse de que se mide en el rango dinámico lineal del método de inmunodetección14,29. En segundo lugar, uno tiene que asegurarse de que se expresa de manera consistente en todas las muestras26,31,25,19,20.
Una solución alternativa a un control de carga confiable es utilizar la medición de proteína total de la mancha blanca /negra. Algunos investigadores han teñido las manchas con manchas de proteína total, como Coomassie, Flamingo Pink, Sypro Ruby, Amido Black, Ponceau S, y tecnología libre de manchas, para medir la señal total de proteína en cada carril como control de carga16,20,13,27,1,4,12. El control de carga total de proteínas evita los escollos asociados con las proteínas de limpieza. En primer lugar, es un fiel reflejo de la cantidad de proteína cargada para cada muestra. En segundo lugar, la tinción proteica total exhibe un excelente rango dinámico lineal en el rango de carga común para el análisis de western blot (proteína de 10-50 μg de un lisato celular complejo) y diferencia con precisión la diferencia de carga entre las muestras12.
La tecnología libre de manchas es un nuevo método de tinción de proteínas totales donde un compuesto único se mezcla en una solución de gel de acrilamida y se distribuye uniformemente en el gel fundido. Después de que se completa la electroforesis, el gel se expone a la luz UV durante un mínimo de 1 minuto para que el compuesto de tinción reaccione con los residuos de triptófano en la proteína. Las proteínas se vuelven excitables bajo luz UV para dar una fuerte señal fluorescente que se puede visualizar y cuantificar en un generador de imágenes habilitado sin manchas, como el sistema ChemiDoc MP. El compuesto libre de manchas en sí, sin embargo, no absorbe la luz UV, lo que resulta en un fondo bajo de la imagen del gel. La modificación de los residuos de triptófano es irreversible y las proteínas se pueden visualizar no sólo en el gel, sino también en la mancha blanca /negra en cualquier momento después de la transferencia de proteínas.
La tecnología sin manchas se aplica en el flujo de trabajo occidental V3(Figura 1)para abordar las principales quejas sobre el flujo de trabajo tradicional, especialmente las preocupaciones con el uso de proteínas de limpieza como controles de carga. Usando este flujo de trabajo, uno podría: 1) ejecutar un gel en aproximadamente 20-30 min, 2) verificar la integridad de la muestra y la calidad de la separación de proteínas en 5 minutos después de la ejecución del gel; 3) proteínas de transferencia en 3-10 min; 4) comprobar cuantitativamente la eficiencia de la transferencia; y 5) lo más importante, validar los cambios en el nivel de la proteína de interés utilizando el control de carga total de proteínas.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><fuerte>REACTIVOS</fuerte></td></tr><tr><td>4-20% Criterio TGX Gel Prefabricado Sin Manchas</td><td>Bio-Rad</td><td>567-8093</td><td>Elija un tamaño y porcentaje de gel que satisfaga la necesidad específica en un experimento</td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo Midi PVDF Transfer Packs Bio-Rad</td><td></td><td>170-4157</td><td>Elija entre PVDF o nitrocelulosa y haga coincidir el tamaño de la membrana con el gel tamaño</td></tr><tr><td>Clarity Western ECL Sustrato, 500 ml </td><td>Bio-Rad</td><td>170-5061</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Criterion Cell </td><td>Bio-Rad</td><td>165-6100</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo Transfer Starter System </td><td>Bio-Rad</td><td>170-4155</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc MP System </td><td>Bio-Rad</td><td>170-8280</td><td></td></tr></tbody></table>

flujo de trabajo sin manchas v3 para un control de carga total de proteínas práctico, conveniente y confiable en western blotting

V3 Stain-free Workflow for a Practical, Convenient, and Reliable Total Protein Loading Control in Western Blotting

La mancha blanca /negra occidental es una técnica de laboratorio muy útil y ampliamente adoptada, pero su ejecución es un desafío. El flujo de trabajo a menudo se caracteriza como una "caja negra" porque un experimentalista no sabe si se ha realizado con éxito hasta el último de varios pasos. Además, la calidad de los datos de western blot a veces se ve cuestionada debido a la falta de herramientas de control de calidad eficaces en todo el proceso de western blotting. Aquí describimos el flujo de trabajo occidental V3, que aplica la tecnología libre de manchas para abordar las principales preocupaciones asociadas con el protocolo western blot tradicional. Este flujo de trabajo permite a los investigadores: 1) ejecutar un gel en aproximadamente 20-30 min; 2) para visualizar la calidad de separación de la muestra dentro de 5 minutos después de la ejecución del gel; 3) para transferir proteínas en 3-10 min; 4) verificar cuantitativamente la eficiencia de la transferencia; y lo más importante 5) para validar los cambios en el nivel de la proteína de interés utilizando el control de carga total de proteínas. Este nuevo enfoque elimina la necesidad de eliminar y reprobar la mancha blanca /negra para proteínas de limpieza como β-actina, β-tubulina, GAPDH, etc. El flujo de trabajo sin manchas V3 hace que el proceso de western blot sea más rápido, transparente, cuantitativo y confiable.

1. Evaluación de la integridad de la muestra, la calidad de la separación de proteínas y la eficiencia de transferencia con imágenes de gel sin manchas.
El extracto de la proteína de las células de HeLa fue separado en 300 V por el minuto 20 en un gel mancha-libre del criterio AnyKD TGX de 18 pozos. Las muestras de proteína se cargaron 3 veces en cuatro cantidades diferentes (carriles 1-3, 40 μg; Carriles 4-6, 30 μg; Carriles 7-9, 20 μg; Carriles 10-12, 10 μg). El gel se activó bajo luz UV durante 1 min. La Figura 2A muestra la imagen del gel adquirida justo después de la separación de la proteína. La integridad de la muestra de proteínas(por ejemplo, degradación) y la calidad de separación(por ejemplo, precipitación de proteínas) se pueden evaluar visualmente con esta imagen en gel. Las proteínas fueron transferidas por 7 minutos a una membrana de la nitrocelulosa usando Trans-Blot Turbo. La Figura 2B muestra la imagen libre de manchas del gel post-transferencia. Ambas imágenes fueron adquiridas con el mismo tiempo de exposición (6,8 seg). Se seleccionaron los carriles 3 y 12 para medir la eficiencia de la transferencia. Usando la herramienta de volumen en el software Image Lab, se dibujó una caja rectangular (azul) para cubrir el carril 3 y 12 en ambas imágenes de gel. El cálculo basado en los valores de volumen de estas cajas indicó que la eficiencia de transferencia de ambos carriles fue del 80% (Figura 2C). En este experimento, el gel AnyKD TGX fue seleccionado para estudiar proteínas diana de tamaño pequeño a mediano y no se optimizó para la transferencia de proteínas grandes. La optimización de la eficiencia de transferencia requeriría el uso de gel de menor porcentaje(por ejemplo, 4-20%) y/o un ajuste del tiempo de transferencia para facilitar la transferencia de proteínas grandes. 2. El control de carga total de proteínas sin manchas es una alternativa confiable al control de carga de limpieza en western blotting para cuantificar un pequeño cambio en el nivel de proteína de interés.
MCM-7 es un factor de replicación de licencias de ADN cuyo nivel disminuye en un 20-50% en las líneas celulares linfoblastoides (LCL) después del tratamiento de irradiación. En este experimento, los lysates (30 μg cada uno) de cuatro culturas de la línea celular linfoblastoide control-tratadas y de la irradiación (LCL) fueron separados en un gel mancha-libre de 12-well Criterion AnyKD TGX. El gel fue activado por 1 minuto bajo luz ULTRAVIOLETA y transferido por Trans-Blot Turbo a una membrana de PVDF para immunoblotting. La proteína de limpieza GAPDH (verde) fue sondeada con un anticuerpo de conejo (Cell Signaling Technology, USA, 1:2,500) y un anticuerpo conjugado Dylight 549 cabra-anti-conejo (Rockland, EE.UU., 1:20,000). La proteína de interés MCM-7 (rojo) fue sondeada utilizando un anticuerpo de ratón (Abcam, EE.UU., 1:1.000) y un anticuerpo conjugado cabra-anti-ratón Dylight 649 (Rockland, 1:10.000).
La Figura 3A muestra una imagen fluorescente múltiplex de proteínas totales (azul), MCM-7 (rojo) y GAPDH (verde) detectadas en cuatro muestras de LCL tratadas con control e irradiación. La Figura 3B es una imagen libre de manchas de la misma mancha que muestra los patrones de proteína total en cada muestra (30 μg). El software de laboratorio de imágenes seleccionó los carriles de muestra (cajas azules) para medir MCM-7, GAPDH y el volumen total de proteínas en cada carril. Los niveles MCM-7 fueron normalizados contra la medida total mancha-libre de la proteína o contra GAPDH. Se analizaron estadísticamente los niveles normalizados de proteína MCM-7 y se presentan en la tabla el volumenmedio de la banda de proteínas MCM-7 y la desviación estándar (n=4). Ambos métodos de normalización revelaron una pequeña disminución (alrededor del 25%) en los niveles de proteína MCM-7 después del tratamiento de irradiación. Los datos con la normalización total de la proteína exhibieron una desviación estándar más pequeña que ésa con GAPDH como el control del cargamento.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50948/50948fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50948/50948fig1.jpg"> Figura 1. V3 Flujo de trabajo occidental. El flujo de trabajo V3 se muestra en la columna izquierda en 4 pasos. Los principales instrumentos y reactivos utilizados en el flujo de trabajo se muestran en cada paso. También se incluye el tiempo estimado para cada paso. La columna de la derecha muestra que se puede generar un mínimo de 4 imágenes en el flujo de trabajo de V3. Se describe el uso de cada dato. Las imágenes libres de manchas del gel pretransferible, el gel post-transferencia y la mancha blanca /negra(A, B, C)no se pueden generar fácilmente con las técnicas tradicionales de western blotting; Estas imágenes y datos proporcionan información importante y puntos de control a lo largo del procedimiento para mejorar el control del científico y la reproducibilidad del flujo de trabajo de Western blot. Las señales de la proteína de la blanco se pueden capturar en una imagen quimioluminiscente de la mancha blanca /negra(D)si un anticuerpo secundario HRP-conjugado fue aplicado en la detección o en una imagen fluorescente de la mancha blanca /negra(E)si la borrasco occidental fluorescente múltiplexing fue realizada para detectar más de una proteína de la blanco simultáneamente en la misma mancha blanca /negra. 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50948/50948fig1highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50948/50948fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50948/50948fig2.jpg"> Figura 2. Imágenes sin manchas de geles pretransferibles y post-transferencia en el flujo de trabajo occidental V3 para evaluar la integridad de la muestra, la calidad de la separación y la eficiencia de la transferencia. (A)Imagen libre de manchas en gel pretransferible. (B)Imagen libre de manchas de gel post-transferencia. (C) Medición de la eficiencia de la transferencia de proteínas.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50948/50948fig2highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50948/50948fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50948/50948fig3.jpg"> Figura 3. Comparación de la medición de la proteína total libre de manchas con la inmunodetección de GAPDH como controles de carga para normalizar el nivel de proteína de interés. (A) Imagen fluorescente de western blot. (B) Imagen de mancha libre de manchas. (C)Niveles normalizados de la proteína MCM-7. 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50948/50948fig3highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a>

El flujo de trabajo V3 es un procedimiento de western blot que utiliza geles sin manchas. La tecnología libre de manchas permite a los investigadores visualizar la calidad de la separación de proteínas, verificar la eficiencia de la transferencia y, lo que es más importante, validar el cambio en la proteína de interés utilizando la cuantificación total de proteínas como un control de carga confiable.

Flujo de trabajo sin manchas V3 para un control de carga total de proteínas práctico, conveniente y confiable en Western Blotting

The western blot is a very useful and widely adopted lab technique, but its execution is challenging. The workflow is often characterized as a &#34;black ...

El flujo de trabajo BioRad V tres proporciona a los investigadores una cuantificación más confiable y mayor confianza en el proceso de inmunotransferencia. Esto se logra primero utilizando geles sin tinción TGX para separar y visualizar las muestras de proteínas. Después de la separación, las proteínas se transfieren a una membrana mediante el sistema de transferencia rápida Blot Turbo, que permite verificar la calidad y eficiencia de la transferencia.Después de verificar la transferencia, la membrana se bloquea e incuba con anticuerpos primarios y secundarios para las proteínas diana. Finalmente, los niveles de la proteína diana se normalizan utilizando la medición de proteína total sin tinción como control de carga. El flujo de trabajo V tres aporta comodidad y transparencia al proceso de inmunotransferencia, proporcionando a los investigadores confianza en cada paso, desde la separación hasta la transferencia y la cuantificación.La principal ventaja del protocolo V three Western frente al inmunotransferencia tradicional es que la tecnología sin tinción ofrece un control práctico, cómodo y fiable de la carga total de proteínas para normalizar las señales de la proteína diana. Este método puede ayudar a responder preguntas clave relacionadas con la fiabilidad de las metodologías de control de carga en la técnica de inmunotransferencia, particularmente aquellas que implican la sobresaturación de las señales de proteínas de mantenimiento y los diferentes niveles de expresión de estas proteínas bajo condiciones experimentales variables. Descubrimos que las proteínas activadas en geles sin tinción también pueden visualizarse en los blos sin necesidad de tinción adicional, lo que permite utilizarlas como alternativa a las tinciones convencionales totales de proteínas, así como a los controles de carga basados en proteínas de mantenimiento.En los próximos minutos, demostraremos el flujo de trabajo completo de V tres utilizando fluorescencia multiplex. El mismo procedimiento también puede utilizarse para quimioluminiscencia tras preparar las muestras de proteína según el protocolo descrito. Utilizando un gel precargado criterion TGX sin tinción cualquier KD, retire el peine y la cinta de la parte inferior de la cassette.Coloque la cassette en el aparato de electroforesis y llene ambos depósitos con tampón de corrida. Cargue los patrones de proteínas y las muestras. Luego, corra el gel durante 20 minutos a 300 voltios.Una vez finalizada la electroforesis, utilice la herramienta de apertura de cassetes en la tapa de la celda Criterion para abrir el cassette. A continuación, agregue unos mililitros de agua al transiluminador UV del equipo Chemi Dock MP. Levante con cuidado el gel del cassette y colóquelo sobre el transiluminador UV. Inicie el software Image Lab y configure un nuevo protocolo de un solo canal para geles sin tinción, utilizando el tiempo de activación del gel por defecto de un minuto; seleccione el tipo de gel adecuado y la optimización automática por defecto para bandas intensas.Luego haga clic en ejecutar protocolo. Una vez finalizada la captura de imágenes, visualice la separación y la calidad de la muestra. A continuación, proceda inmediatamente al paso de transferencia.Para realizar la transferencia de proteínas, abra un paquete de transferencia turbo MIDI PVDF con bloque de transferencia. Coloque la pila inferior en el centro de la base de la caja. Retire el gel del revelador.Coloque el gel encima de la membrana. Utilice suavemente el rodillo de transferencia para eliminar las burbujas de aire entre el gel y la membrana. A continuación, coloque la pila superior encima del gel.Después de eliminar cualquier burbuja de aire, coloque la tapa del casete sobre la base. Presione firmemente la tapa, gire el dial en sentido horario para bloquear y luego inserte el casete en uno de los dos compartimentos del aparato. Desde la pantalla de inicio, seleccione el protocolo turbo.Seleccione el gel doble mini o el gel simple mini, y presione el botón de ejecución para el compartimento correspondiente. La transferencia finalizará en siete minutos. Retire el casete del compartimento.Desbloquee el cassette y desarme el sándwich de transferencia. Coloque el gel posterior a la transferencia sobre el transiluminador UV del equipo Chemi dock MP, e inmediatamente coloque la membrana en agua desionizada. Configure un nuevo protocolo de canal único para geles sin tinción sin tiempo de activación.Seleccione el tipo de gel adecuado y ajuste manualmente el tiempo de exposición al del gel previo a la transferencia; luego haga clic en ejecutar protocolo. Una vez que la captura de la imagen esté completa, verifique la eficiencia de transferencia comparando las intensidades de las bandas de las muestras entre los geles previo y posterior a la transferencia.Retire el gel de la bandeja de muestra ya que ya no es necesario y deséchelo. Para verificar, transfiera a la membrana. Coloque la membrana en la bandeja de muestra y configure un nuevo protocolo de canal único.Para la transferencia sin tinción. Seleccione el tipo de gel adecuado y la optimización automática predeterminada para bandas intensas. Luego haga clic en ejecutar el protocolo.Una vez finalizada la captura de imágenes, verifique la transferencia a la membrana. Retire la membrana del revelado de la transiluminadora UV y colóquela en el tampón de bloqueo para inmunotransferencia. Después de incubar la membrana a temperatura ambiente durante una hora, incúbela con anticuerpos primarios de ratón y conejo durante la noche a cuatro grados Celsius al día siguiente.Vierta la solución de anticuerpos y lave la membrana con 50 mililitros de TBST durante cinco minutos. Incube la membrana con anticuerpos secundarios fluorescentes conjugados antimurinos y anticonejos durante una hora a temperatura ambiente. Luego, lave la membrana cinco veces con TBST, durante cinco minutos cada vez.Para obtener la imagen del revelado, coloque la membrana sobre el transiluminador UV del equipo Chemi doc MP en el software Image Lab. Configure un nuevo protocolo multicanal. Configure el canal uno seleccionando dite six 50 dentro de aplicaciones de revelado y utilice la optimización automática predeterminada para bandas intensas.Repita estos pasos para configurar los canales dos y tres para DITE 5 49 y la transferencia sin tinción, respectivamente. Seleccione el tipo de gel adecuado y haga clic en ejecutar el protocolo. Para definir las bandas, seleccione la imagen de la transferencia sin tinción y las bandas. Luego, buscador automático de bandas para una cuantificación precisa. Asegúrese de que los perfiles de fondo en cada carril de muestra sean similares ajustando el tamaño del disco rodante a 70. Confirme la uniformidad del fondo escaneando todos los perfiles de carril para definir las bandas en ambos canales dite seis 50 y 5 49.Utilice la herramienta de detección de bandas para identificar bandas usando la configuración predeterminada de sensibilidad. Para designar el canal de normalización, regrese a la caja de herramientas de análisis. Haga clic en normalización y seleccione la tinción sin tinción, asegurándose de que la proteína total de la banda esté seleccionada.Para asignar las bandas patrón de peso molecular, regrese a la caja de herramientas de análisis, haga clic en las herramientas de análisis de PM y marque la casilla debajo de la banda correspondiente. Por último, para ver las intensidades normalizadas de las bandas proteicas, haga clic en la tabla de análisis en la barra de herramientas. El software generará automáticamente una tabla que contiene las intensidades de volumen, los factores de normalización y los volúmenes normalizados.Los volúmenes normalizados deben utilizarse para el análisis y la presentación de datos. La tabla puede exportarse. Para análisis adicionales, hemos demostrado el flujo de trabajo completo de inmunotransferencia V tres.Ahora le mostraremos resultados representativos de un experimento real. Se analizaron lisados de cultivos celulares de linfoblastos control e irradiados utilizando el protocolo de inmunotransferencia V tres. La señal de proteína total con tinción libre aparece en azul.La proteína diana M CM siete se muestra en rojo, y la proteína de control de carga validada, control de carga GA DH, se muestra en verde. Se ha validado que GA DH es un control de carga adecuado mediante la evaluación de su linealidad utilizando las condiciones experimentales descritas en este video. Las señales de proteína total sin tinción para cada carril en el blot se midieron utilizando el software Image Lab.Las intensidades de señal de MCM siete se normalizaron utilizando tanto la señal de proteína total como la de GA DH. Los volúmenes de las bandas proteicas de MCM siete normalizados por ambos métodos revelaron una disminución del 25 % en los niveles de expresión en muestras irradiadas en comparación con muestras control antes de la normalización precisa. La proteína de mantenimiento requiere validación para confirmar su rango lineal y niveles de expresión consistentes entre muestras sin validación.Los controles de carga de proteínas de mantenimiento no garantizan una normalización precisa. Por el contrario, la normalización por proteína total no requiere validación. Por lo tanto, la señal de proteína total sin tinción obtenida mediante el flujo de trabajo V tres ofrece un control de carga práctico, conveniente y más confiable al intentar este procedimiento.Recuerde que la tecnología sin tinción permite la visualización fluorescente de muestras de proteínas mediante una modificación covalente inducida por UV de los residuos de triptófano disponibles. Solo en raras ocasiones esta modificación afectará significativamente aplicaciones posteriores como la detección inmunológica o la espectrometría de masas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar el protocolo V three Western y la normalización de proteína total sin tinción.Aunque demostramos este procedimiento para inmunotransferencias fluorescentes multiplex, la tecnología sin tinción también puede utilizarse para la normalización de proteínas totales con inmunotransferencias quimiluminiscentes.

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