Flujo de trabajo sin manchas V3 para un control de carga total de proteínas práctico, conveniente y confiable en Western Blotting

El flujo de trabajo BioRad V three proporciona a los investigadores una cuantificación más fiable y confianza en el proceso de Western blot. Esto se logra utilizando primero geles sin manchas TGX para separar y visualizar las muestras de proteínas. Después de la separación, las proteínas se transfieren a una membrana utilizando el sistema de transferencia rápida blot turbo, que permite verificar la calidad y la eficiencia de la transferencia.

Después de verificar la transferencia, la membrana se bloquea y se sondea con anticuerpos primarios y secundarios para las proteínas diana. Por último, los niveles de proteína objetivo se normalizan utilizando la medición de proteínas totales sin tinción como control de carga. El flujo de trabajo V three aporta comodidad y transparencia al proceso de transferencia occidental, proporcionando a los investigadores confianza en cada paso, desde la separación hasta la transferencia y la cuantificación.

La principal ventaja del flujo de trabajo V three Western sobre el Western blot tradicional es que la tecnología sin manchas ofrece un control de la carga total de proteínas práctico, cómodo y fiable para normalizar las señales de proteínas objetivo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave relacionadas con la fiabilidad de las metodologías de control de carga para la técnica de Western blot que implican la sobresaturación de las señales de proteínas de mantenimiento y los niveles de expresión diferencial de las proteínas de mantenimiento en diversas condiciones experimentales. Descubrimos que las proteínas activadas en geles sin tinción también se podían visualizar en blos sin más tinción, lo que les permitía usarse como alternativa a las tinciones convencionales de proteínas totales, así como controlar la carga de proteínas.

En los próximos minutos, demostraremos el flujo de trabajo completo de V tres utilizando fluorescencia multiplex. El mismo procedimiento también se puede utilizar para la quimioluminiscencia después de preparar muestras de proteínas de acuerdo con el protocolo de texto. Utilizando un criterio TGX para eliminar cualquier gel prefabricado KD, retire el peine y la cinta adhesiva de la parte inferior del casete.

Coloque el casete en el aparato de gel y llene ambos depósitos con tampones de funcionamiento. Cargue los patrones y muestras de proteínas. A continuación, haga funcionar el gel durante 20 minutos a 300 voltios.

Una vez completada la electroforesis, utilice la herramienta de apertura de casete de gel de la tapa de la celda Criterion para abrir el casete. A continuación, aplique unos mililitros de agua al transluminador UV del generador de imágenes Chemi Dock MP. Levante con cuidado el gel del casete y colóquelo en el software UV Trans Illuminator Launch Image Lab y configure un nuevo protocolo de canal único para geles sin manchas utilizando el tiempo de activación de gel predeterminado de un minuto, seleccione el tipo de gel apropiado y la optimización automática predeterminada para bandas intensas.

A continuación, haga clic en ejecutar protocolo. Una vez completada la captura de la imagen, visualice la separación y la calidad de la muestra. A continuación, proceda inmediatamente al paso de transferencia.

Para llevar a cabo la transferencia de proteínas, abra un paquete de transferencia trans block turbo MIDI PVDF. Coloque la pila inferior en el centro de la base del casete. Retire el gel del generador de imágenes.

Alinea el gel en la parte superior de la membrana. Utilice suavemente el rodillo secante para eliminar las burbujas de aire entre el gel y la membrana. A continuación, alinee la pila superior sobre el gel.

Después de eliminar las burbujas de aire, coloque la tapa del casete en la base. Presione la tapa hacia abajo firmemente, gire el dial en el sentido de las agujas del reloj para bloquear e insertar el casete en una de las dos bahías secantes. En la pantalla de inicio, seleccione el protocolo turbo.

Elija los dos mini o un mini gel y presione el botón de ejecución para la bahía adecuada. La transferencia se completará en siete minutos. Retire el casete de la bahía.

Desbloquee el casete y desmonte el sándwich secante. Coloque el gel de transferencia posterior en el transluminador UV del generador de imágenes Chemi dock MP e inmediatamente coloque la membrana en agua desionizada. Configure un nuevo protocolo de canal único para geles sin manchas sin tiempo de activación.

Seleccione el tipo de gel apropiado y ajuste manualmente el tiempo de exposición al del gel de pretransferencia y haga clic en ejecutar protocolo. Una vez completada la captura de la imagen. Verifique la eficiencia de la transferencia comparando las intensidades de las bandas de muestra entre los geles previos y posteriores a la transferencia.

Retire el gel de la bandeja de muestras, ya que ya no lo necesita y deséchelo. Para verificarlo, transfiéralo a la mancha. Coloque la membrana en la bandeja de muestras y configure un nuevo protocolo de canal único.

Para una mancha sin manchas. Seleccione el tipo de gel adecuado y la optimización automática predeterminada para bandas intensas. A continuación, haga clic en ejecutar protocolo.

Una vez completada la captura de la imagen, verifique la transferencia a la membrana. Retire la membrana de transferencia del iluminador trans UV y colóquela en un tampón de bloqueo para Western blot. Después de incubar la membrana a temperatura ambiente durante una hora, incubarla con anticuerpos primarios de ratón y conejo durante la noche a cuatro grados centígrados al día siguiente.

Vierta la solución de anticuerpos y use 50 mililitros de TBST para lavar la mancha durante cinco minutos. Incubar el blot con anticuerpos secundarios fluorescentes conjugados, anti musa y anti conejo durante una hora a temperatura ambiente. Luego use TBST para lavar la mancha cinco veces durante cinco minutos cada una.

Para obtener una imagen de la mancha, colóquela en el iluminador UV trans del generador de imágenes Chemi doc MP en el software de laboratorio de imágenes. Configure un nuevo protocolo multicanal. Configure el canal uno seleccionando dite six 50 en aplicaciones de transferencia y utilice la optimización automática predeterminada para bandas intensas.

Repita estos pasos para configurar los canales dos y tres para DITE 5 49 y mancha sin manchas respectivamente. Seleccione el tipo de gel adecuado y haga clic en ejecutar protocolo. Para definir carriles, seleccione el carril y las bandas de la imagen de mancha sin manchas.

A continuación, buscador automático de carriles para una cuantificación precisa. Asegúrese de que los perfiles de fondo de cada carril de muestreo sean similares ajustando el tamaño del disco rodante a 70. Confirme la uniformidad del fondo escaneando todos los perfiles de carril para definir bandas en los canales dite six 50 y 5 49.

Utilice la herramienta de búsqueda de bandas para detectar bandas utilizando la configuración de sensibilidad predeterminada. Para designar el canal de normalización, vaya a la caja de herramientas de análisis. Haga clic en normalización y elija mancha sin manchas, asegurándose de que se seleccione la proteína total del carril.

Para asignar los carriles estándar de peso molecular, regrese a la caja de herramientas de análisis, haga clic en Herramientas de análisis de MW y marque la casilla debajo del carril apropiado. Por último, para ver las intensidades de las bandas de proteínas normalizadas, haga clic en la tabla de análisis de la barra de herramientas. El software generará automáticamente una tabla que contiene intensidades de volumen, factores de normalización y volúmenes normalizados.

Los volúmenes normalizados se deben utilizar para el análisis de datos y la generación de informes. La tabla se puede exportar. Para un análisis más detallado, hemos demostrado el flujo de trabajo completo de V three Western blotting.

Ahora te mostraremos resultados representativos de un experimento real. Los lisados de los cultivos celulares de linfoblastos de control e irradiados se analizaron mediante el flujo de trabajo de Western blot V tres. La señal de proteína total sin tinción aparece en azul.

La proteína objetivo M CM siete se muestra en rojo, y el control de carga de proteínas de mantenimiento validado GA DH se muestra en verde. GA DH ha sido validado como un control de carga adecuado mediante la evaluación de su linealidad utilizando las condiciones experimentales descritas en este vídeo. Las señales de proteínas totales sin tinción para cada carril en el blot se midieron utilizando un software de laboratorio de imágenes.

Las intensidades de señal de MCM siete se normalizaron utilizando las señales de proteína total y GA DH. Los volúmenes de siete bandas de proteínas MCM normalizados por ambos métodos revelaron una disminución del 25% en los niveles de expresión en las muestras irradiadas en relación con las muestras de control antes de la normalización precisa. La proteína de mantenimiento requiere una validación que confirme su rango lineal y niveles de expresión consistentes entre muestras sin validación.

Los controles de carga de proteínas no garantizan una normalización precisa. Por el contrario, la normalización total de proteínas no requiere validación. Por lo tanto, la señal de proteína total sin tinción obtenida por el flujo de trabajo V three ofrece un control de carga práctico, conveniente y más confiable mientras se intenta este procedimiento.

Recuerde que la tecnología sin tinción permite la visualización fluorescente de muestras de proteínas a través de una modificación covalente inducida por UV de los residuos de triptófano disponibles. Solo en raras ocasiones, esta modificación tendrá un impacto significativo en las aplicaciones posteriores, como la inmunodetección o la espectrometría de masas. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar el flujo de trabajo V three Western y la normalización de proteínas totales sin manchas.

Aunque demostramos este flujo de trabajo para la transferencia Western fluorescente multiplex, la tecnología sin tinción también se puede utilizar para la normalización total de proteínas con Western blots luminiscentes.