Un nuevo enfoque para el análisis comparativo de Multiproteinas complejos basados ​​en ¹⁵ N metabólico Etiquetado y cuantitativa de Espectrometría de Masas

El enfoque descrito comparativa, cuantitativa proteómica tiene por objeto la obtención de conocimientos sobre la composición de los complejos multiproteicos bajo diferentes condiciones y se demuestra comparando genéticamente diferentes cepas. Para el análisis cuantitativo volúmenes iguales de diferentes fracciones de un gradiente de densidad de sacarosa se mezclan y se analizaron por espectrometría de masas.

El objetivo general de este procedimiento es analizar comparativamente la composición de los complejos MultiPro en las membranas del cordón thal en diferentes condiciones. Esto se logra aislando primero las membranas thal de las células de lamona expuestas a condiciones anaeróbicas. A continuación, las membranas del cordón th se solubilizan y fraccionan en un gradiente de densidad de sacarosa.

A continuación, se mezclan y separan volúmenes iguales de las fracciones deseadas en la página SDS. Finalmente, las bandas teñidas de kumasi se digieren con tripsina. En última instancia, las muestras se analizan mediante espectrometría de masas cuantitativa para observar los cambios en la abundancia de proteínas entre las fracciones investigadas.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como los estudios proteómicos cuantitativos, que comparan una cantidad definida de proteína, es que en nuestro enfoque se combinan y analizan volúmenes iguales de muestras fraccionadas. Esto permite estudiar el comportamiento de migración de las proteínas dentro del gradiente y, además, analizar la composición de diferentes complejos no proteicos en la membrana del tercer grupo. Con respecto a las cepas aplicadas, después de cultivar las cepas de chlamydomonas reinan resistentes, de acuerdo con el protocolo de texto, utilice soluciones madre de sacarosa bimolar, 10% beta MS en agua y pH de 0,5 trice molar 8,0.

Para preparar las siguientes soluciones para gradientes de densidad de sacarosa para configurar los gradientes utilizando tubos de centrífuga de 14 por 89 milímetros, comience vertiendo lentamente un mililitro de solución 1.3 molar, seguido de un mililitro de solución 1.0 molar. A continuación, vierta dos mililitros de cada una de las soluciones 0,85, 0,7, 0,65 y, por último, las 0,4 molares. Almacene los gradientes durante la noche en la cámara frigorífica para inducir condiciones anaeróbicas.

En los cultivos de Chlamydomonas, se inserta una pipeta de vidrio en los matraces de cultivo y se burbujea con Argonne durante cuatro horas con agitación e iluminación continuas para aislar las membranas del cordón tal. Después de la incubación, comience granulando las células durante cinco minutos a 2.500 veces la gravedad y cuatro grados centígrados. A continuación, resus suspender los pellets de la célula en 30 mililitros de H un tampón.

Repetir la centrifugación y de nuevo, resus. Suspenda las células en H un tampón para romper las células, páselas a través de un nebulizador con una presión de nitrógeno de 1, 500 pascales. Asegúrese de que la distancia entre la bola de cerámica y el metal sea lo suficientemente pequeña como para que las células se rompan.

A continuación, haz girar las células durante siete minutos a 2.500 veces la gravedad y cuatro grados centígrados. El sobrenadante debe ser de color verde claro. Si la rotura de la célula fue exitosa, suspenda las celdas en 50 mililitros de tampón H dos y péguelas durante 10 minutos a 32,800 veces la gravedad y cuatro grados centígrados.

Luego, después de suspender las células en 10 mililitros de tampón H tres, use un alfarero para homogeneizar el paladar resuspendido. A continuación, prepare los gradientes de densidad de sacarosa del cordón. Comience con 12 mililitros de células en tampón H tres.

A continuación, vierta lentamente una capa de 12 mililitros de tampón H cuatro y termine con 12 mililitros de tampón H cinco. Use H cinco para equilibrar el rotor y centrifugar los gradientes durante una hora a 70, 700 veces la gravedad. Retire las bandas TH de los gradientes y utilice un volumen adecuado de tampón H six para diluirlas.

Gira las células a 37.900 veces la gravedad durante 20 minutos a cuatro grados centígrados. Si el pellet no está apretado, agregue más tampón H six al paso de centrifugación. A continuación, resus.

Suspenda los cordones thal en un pequeño volumen de tampón H six para cargar un gradiente de densidad de sacarosa del sistema fotográfico. En primer lugar, calcule las cantidades de cordones thal, beta DM y tampón H six necesarias para cada gradiente. Siguiendo estas pautas, cada gradiente contendrá 0,8 miligramos por mililitro de clorofila en 0,9%beta MS y H six Buffer elevará el volumen final hasta 700 microlitros.

Para solubilizar el thys, prepare Eloqua por separado con Thylakoids beta DM y H six buffer para cada gradiente. Incubar las muestras en hielo durante 20 minutos e invertir cada pocos minutos para mezclar. Después de centrifugar las muestras a 14.000 veces la gravedad durante 10 minutos y cuatro grados centígrados.

La bolita debe ser pequeña y blanquecina, y el sobrenadante será de color verde oscuro. Cargue el sobrenadante en la balanza de gradientes con tampón H six y ultracentrífuga a 134, 470 veces la gravedad durante 14 horas y cuatro grados Celsius. Después del giro, tome fotografías de los gradientes y luego fraccione.

Use una aguja para perforar un agujero en la parte inferior del tubo y recoja fracciones en tubos de 500 microlitros. O un proceso de placa de 96 pocillos. Las muestras para la página de SDS en digestión en gel y espectrometría de masas de acuerdo con el protocolo de texto como se muestra aquí, utilizando los resultados del análisis de sangre inmunoinmune fracción seis de tipo salvaje y fracción 13 de delta PS uno.

En esta figura, se eligieron fracciones de pico de A y R uno para el análisis de los componentes supercomplejos del flujo cíclico de electrones. Se muestran las proporciones relativas de proteínas representadas como de tipo salvaje sobre delta PS uno, 14 N sobre 15 N para varias proteínas PS de un núcleo y de recolección ligera de PS uno, así como para proteínas asignadas con el supercomplejo de flujo de electrones cíclico, las diferencias en abundancia de un NR uno y CAS en las fracciones seis y 13 de tipo salvaje y delta PS uno sugieren que son componentes novedosos de este complejo mostrado aquí están los resultados para la comparación cuantitativa de este súper complejo de flujo de electrones cíclico entre el tipo salvaje y una cepa knockout PG L one. Curiosamente, el HCF 1 36, el citocromo B seis, el citocromo B seis, la subunidad f cuatro y el PET C parecen estar enriquecidos en el tipo salvaje, mientras que el FTSH dos, el citocromo F y el PET O parecen estar enriquecidos en PG L uno.

Después de ver este video, tendrá una buena comprensión de cómo comparar la composición de los complejos MultiPro en membranas líquidas di en diferentes condiciones. Tenga en cuenta que para la preparación exitosa de las membranas líquidas y el aislamiento del flujo cíclico de electrones, los pasos críticos son la disrupción celular súper compleja, la alfarería de las células y la ización de las membranas líquidas. Además, los gradientes de densidad de sacarosa deben centrifugarse durante al menos 12 horas para lograr la separación completa de los complejos fotosintéticos.