Name: Un nuevo enfoque para el análisis comparativo de Multiproteinas complejos basados en 15 N metabólico Etiquetado y cuantitativa de Espectrometría de Masas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Aprende a analizar complejos multiproteicos en membranas de tilacoides de Chlamydomonas mediante espectrometría de masas cuantitativa. Este método permite estudiar cambios en la abundancia de proteínas bajo condiciones anaeróbicas.

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MH reconoce el apoyo de la &quot;Deutsche Forschungsgemeinschaft&quot; (DFG). Autor contribuciones: MH diseñado investigación; KT, JS y MT realiza investigación y analizó los datos; KT y MH escribió el documento.

1. El cultivo de Chlamydomonas <ol><li> La siguiente C. reinhardtii cepas fueron utilizadas en el presente estudio: PESO cc124, WT cw15-Arg7 (pared celular deficiente y arginina auxotroph), una cepa mutante ΔPSI 29 y un pgrl1 cepa ronda 4. </li><li> Todas las cepas se cultivaron en Tris-Acetato-fosfato (TAP)-medio 30, a 25 ° C con una intensidad de luz continua de 20-50 E · / m 2 seg y agitación a 120 rpm. La cultura de ΔPSI debe ser envuelto con un poco de papel de seda para la exposición a la luz de &lt;5 E · / m 2 s. </li><li> Los cultivos de las cepas etiquetados (ΔPSI y WT cc124, respectivamente) contenían 7,5 mM 15 N NH 4 Cl, mientras que los cultivos de las cepas no marcado (WT-cw15 Arg7 y pgrl1, respectivamente) contenían 7,5 mM 14 N NH4Cl. Las células tienen que crecer por lo menos durante cuatro geiones para lograr el etiquetado completo y se deben mantener en la fase de crecimiento exponencial. </li><li> En el día antes de comenzar el experimento y recuento de células diluidas hasta una densidad de 1 x 10 6 células / ml en un volumen de al menos 750 ml / cepa. </li></ol> Tenga en cuenta que dos tipos de gradientes de densidad discontinuo de sacarosa se describen en el siguiente protocolo. Los gradientes de densidad de sacarosa de acuerdo con el fotosistema Takahashi et al. 9 se utilizan para separar los diferentes complejos de proteínas fotosintética de los tilacoides aisladas y solubilizados durante durante la noche centrifugación y tienen que ser preparado el día antes (véase el Protocolo 2) y los gradientes de densidad de sacarosa tilacoides 8 se aplican en el procedimiento de aislamiento tilacoide (ver Protocolo n º 3). 2. Preparación de los gradientes de densidad de sacarosa Fotosistema <ol><li> Para verter los gradientes son necesarios tres soluciones madre: <ol><li> 2 M de sacarosa </li><li> 10% β-DM en H 2 O </li><li> 0,5 M de Tricina, pH 8,0 (NaOH) </li></ol></li><li> El uso de estas poblaciones, se preparan las siguientes soluciones: <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="544"><tbody><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:94px;"> Concentración: </td><td style="width:75px;"> 1,3 M </td><td style="width:75px;"> 1,0 M </td><td style="width:75px;"> 0,85 M </td><td style="width:75px;"> 0,7 M </td><td style="width:75px;"> 0,65 M </td><td style="width:75px;"> 0,4 M </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:94px;"> 2 M de sacarosa </td><td style="width:75px;"> 13 ml </td><td style="width:75px;"> 10 ml </td><td style="width:75px;"> 8,5 ml </td><td style="width:75px;"> 7 ml </td><td style="width:75px;"> 6,5 ml </td><td style="width:75px;"> 4 ml </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:94px;"> 10%46;-DM </td><td style="width:75px;"> 100 l </td><td style="width:75px;"> 100 l </td><td style="width:75px;"> 100 l </td><td style="width:75px;"> 100 l </td><td style="width:75px;"> 100 l </td><td style="width:75px;"> 100 l </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:94px;"> 0,5 M de Tricina </td><td style="width:75px;"> 200 l </td><td style="width:75px;"> 200 l </td><td style="width:75px;"> 200 l </td><td style="width:75px;"> 200 l </td><td style="width:75px;"> 200 l </td><td style="width:75px;"> 200 l </td></tr><tr height="20"><td height="21" style="height:20px;width:94px;"> H 2 O </td><td style="width:75px;"> 6,7 ml </td><td style="width:75px;"> 9,7 ml </td><td style="width:75px;"> 11,2 ml </td><td style="width:75px;"> 12,7 ml </td><td style="width:75px;"> 13,2 ml </td><td style="width:75px;"> 15,7 ml </td></tr></tbody></table></li><li> Utilice tubos x 89 mm de centrífuga de 14 mm y verter los gradientes muy lentamente, comenzando con la solución más alta de densidad de sacarosa a la solución de menor densidad. </li><li> Vierta sólo 1 ml de cada uno de los 1,3 y 1,0 M y 2 ml de soluciones para el resto de las soluciones. </li><li> Deja gradientes de la noche en el cuarto frío. </li></ol> 3. Anaerobio Inducción y aislamiento de Thylakoid Membranas 8 <ol><li> Antes de comenzar con el aislamiento de membranas tilacoides, inducir condiciones anaeróbicas por burbujeo con argón durante 4 h. El burbujeo se puede realizar a través de una pipeta de vidrio en el cultivo de matraces con mezcla constante de la cultura con una barra de agitación magnética. </li><li> Comenzar con el aislamiento de las membranas tilacoides mediante sedimentación de las células durante 5 min a 2.500 xg, se resuspende en tampón H1 (0,3 M de sacarosa, 25 mM de HEPES (pH 7,5), 5 mM de MgCl 2). (Tenga en cuenta que cuando se empieza con el aislamiento de los tilacoides muestras membranas shOuld mantenerse en hielo para evitar la degradación de proteínas, todas las etapas de centrifugación se llevan a cabo a 4 º C y el trabajo con los guantes es muy recomendable para evitar la contaminación de la queratina.) </li><li> Precipitar las células durante 5 min a 2.500 xg, se resuspende en tampón H1. </li><li> Romper las células con dos pases a través de un nebulizador con una presión de nitrógeno de 1500 hPa (para las cepas sin pared celular hacer un solo paso). </li><li> Centrifugar las células durante 7 min a 2500 x g. (Después de este paso, el sobrenadante debe ser de color verde claro, si no, la rotura celular no tuvo éxito.) </li><li> Resuspender las células en tampón de H2 (0,3 M de sacarosa, 5 mM de HEPES (pH 7,5), EDTA 10 mM (pH 8,0)) y células de pellets durante 10 min a 32.800 x g. </li><li> Resuspender las células en tampón de H3 (1,8 M de sacarosa, 5 mM de HEPES (pH 7,5), EDTA 10 mM (pH 8,0)) y homogeneizar de pellets con un alfarero (no hay partículas verdes deben permanecer en el extremo de este paso de trabajo). </li><li> Preparar los gradientes de densidad de sacarosa tilacoides en la bañeraES (25 mm x 89 mm) comenzando en la parte inferior con una capa de 12 ml de tampón H3 con las células, se vierte una capa de medio de 12 ml de tampón de H4 (1,3 M de sacarosa, 5 mM de HEPES (pH 7,5), EDTA 10 mM ( pH 8,0)) y en la parte superior 12 ml de tampón H5 (0,5 M de sacarosa, 5 mM de HEPES (pH 7,5), EDTA 10 mM (pH 8,0)). Tenga cuidado al verter los gradientes y evitar la mezcla de las tres capas. </li><li> Equilibrio con tampón H5 y los gradientes de densidad de sacarosa tilacoides de centrifugación durante 1 hora a 70.700 x g. </li><li> Retire las bandas de tilacoides de los gradientes de densidad de sacarosa y los tilacoides diluir con un volumen de tampón apropiado H6 (5 mM de HEPES (pH 7,5) 10 mM EDTA (pH 8,0)). </li><li> Centrifugar las células a 37.900 xg durante 20 min. Si la pastilla no está apretado, se requiere más memoria intermedia H6 para este paso de centrifugación. </li><li> Resuspender tilacoides en un tampón H6 pequeño volumen y proceder con la determinación de la concentración de clorofila. </li></ol> 4. Determinación de la Concentración clorofila 31 </sup&gt; <ol><li> La determinación de la cantidad de clorofila se lleva a cabo con 80% de acetona. </li><li> Mezclar 995 l 80% de acetona y 5 l de tilacoides en tampón H6 (dilución 1:200). </li><li> Vortex durante varios segundos hasta que no haya partículas permanecen verdes y luego girar hacia abajo a 14,1 × g durante 5 min. </li><li> Tome el sobrenadante y medir la extinción a 663.6 y 646.6 nm y 750 nm, respectivamente. </li><li> Calcular la cantidad de clorofila usando las siguientes fórmulas: <ol><li> C Chl a [mg / ml] = (0,01225 * E 663,6-0,00255 * E 646,6) * factor de dilución </li><li> C Chl b [mg / ml] = (0,02031 * E 646,6-0,00491 * E 663.6) * factor de dilución </li><li> C Chl [mg / ml] = C Chl a + C Chl b </li></ol></li></ol> 5. La carga de los gradientes de densidad de sacarosa Fotosistema <ol><li> Calcular las cantidades de los tilacoides, β-DM y el tampón H6 que se necesitanpara cada gradiente: <ol><li> Cada gradiente debe ser cargado con un volumen total de 700 l con 0,8 mg / ml de clorofila en el 0,9% β-DM (disolver β-DM en H 2 O), llenar el volumen restante con tampón H6. </li></ol></li><li> Para la solubilización preparar diferentes alícuotas con tilacoides, β-DM y tampón H6 para cada gradiente. </li><li> Deja muestras durante 20 min en hielo con la mezcla regularmente (inversora) cada pocos minutos (etapa de solubilización). </li><li> Se centrifuga a la velocidad máxima (14.000 xg) durante 10 min a 4 ° C. (Después de la centrifugación, el pellet debe ser pequeña y de color blanquecino, mientras que el sobrenadante es de color verde oscuro.) </li><li> Cargar sobrenadante en los gradientes. </li><li> Equilibrio con tampón H6 y girar utilizando ultracentrífuga a 134.470 xg durante la noche (14 horas) a 4 ° C. (Tenga en cuenta que la separación exitosa de complejos fotosintéticos utilizando gradientes de densidad de sacarosa fotosistema tal como se presenta en este protocolo sólo se logra cuando using recién aisladas tilacoides, desde una predicción para la solubilización y separación compleja es difícil de realizar cuando se trabaja con las membranas tilacoides que han sido congelados antes.) </li></ol> 6. El fraccionamiento de los gradientes de densidad de sacarosa Fotosistema <ol><li> Tome fotos de los gradientes. </li><li> Perforar un agujero en la parte inferior del tubo utilizando una aguja y gradientes se fraccionan en tubos de 500 mL. Alternativamente, el fraccionamiento también se puede realizar mediante el uso de una placa de 96 pocillos (microplaca). </li><li> Cuando se utiliza una microplaca, determinar la absorbancia de las diferentes fracciones de gradiente a 675 nm. (En este paso las muestras pueden ser almacenadas a -80 ° C durante unas semanas.) </li></ol> 7. SDS-PAGE e inmunodetección (Tenga en cuenta que sólo para la comparación de PESO vs ΔPSI se ha realizado un análisis de Western blot para seleccionar las fracciones para su posterior MS-análisis. Para el experimento PESO vs pgrl1 fracciones fueron escogidos por medio de la absorbancia en las diferentes fracciones.) <ol><li> Separa 30 l de cada fracción de WT y ΔPSI gradiente en un gel de poliacrilamida SDS 13% 32. </li><li> Realizar análisis de Western blot 33 utilizando los siguientes anticuerpos: ANR1 (TEF7) 26, PGRL1 34, CAS 6, el PSAD subunidad PSI 32 y el PSII D1 subunidad central. Utilice todos los anticuerpos con una dilución de 1:1.000 (para mejorar la técnica de detección de quimioluminiscencia), excepto para el anticuerpo D1, que se debe utilizar con una dilución de 1:10.000. </li><li> Con base en los resultados de la inmunodetección, tome las fracciones de los picos de ANR1, PGRL1 y PSAD para WT y ΔPSI (aquí fracciones 6 y 13, respectivamente), mezclar 30 l de la fracción 6 de WT y ΔPSI y hacer lo mismo con la fracción 13 de ambas preparaciones y los separan de nuevo en un gel de poliacrilamida SDS al 13%. </li><li> Para la comparación cuantitativa de PESO vs pgrl1 tomar la C-EF Supercomplejo fracciones como se determina mediante la medición de la absorbancia en las diferentes fracciones del gradiente y mezclar 30 l de ambas muestras seguido de la separación en un gel de poliacrilamida SDS al 13%. </li><li> Tinción de las bandas de proteína con solución de Coomassie (ácido fosforoso 85%, sulfato de amonio 757 mM, 1,2% azul brillante de Coomassie, 20% de metanol) durante 2 horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C. </li><li> Para quitar manchas inespecífica, lavar varias veces con ddH 2 O. </li><li> Cortar los carriles en 1 mm piezas de gel y proceder con la digestión en gel. (De forma alternativa, las muestras se pueden secar unos minutos en una centrífuga de vacío y se almacenan durante un par de semanas antes de continuar con la digestión en gel.) </li></ol> 8. En la digestión-gel (Modificado de Shevchenko et al. 35) A tener en cuenta para preparar todos los tampones y soluciones poco antes de su uso y tomar botellas de vidrio para tampones que contienen acetonitrilo (ACN). &lt;br /&gt; ¡CUIDADO! Trabajar con ACN podría ser perjudicial, más información se puede descargar de: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927335 (2013). <ol><li> Lávese las piezas de gel con&gt; 10 volúmenes de ddH2O (~ 200 l) durante 30 segundos. </li><li> Incubar las piezas de gel con 300 l de 25 mM NH 4 HCO 3 de 15 min con agitación, eliminar el líquido. </li><li> Incubar las piezas de gel con 300 l de 25 mM NH 4 HCO 3 en 50% de ACN (preparar mediante la mezcla de ACN y 50 mM NH 4 HCO 3 en una proporción de 1:01) durante 15 min con agitación, eliminar el líquido. </li><li> Si las piezas de gel siguen azules, repita el NH 4 HCO 3 y NH 4 HCO 3 / ACN se lava hasta que la mayoría del Coomassie se retira. (Aunque la mayor parte de la tinción de Coomassie se debe quitar, no es necesario destain las piezas de gel completamente.) </li><li> Añadir 100 l de ACN para deshidratar las piezas de gel durante 5 min. Las piezas de gel deben reducir unnd aspecto completamente blanco. </li><li> Quite la mayor cantidad ACN como sea posible y continuar con la digestión con tripsina. Alternativamente, las muestras pueden ser almacenadas a -20 ° C durante unas pocas semanas. </li><li> Añadir 10-20 l por banda de 20 ng / l de tripsina en 10% de ACN / 25 mM NH 4 HCO 3 (recién diluido), mantener las muestras en hielo. </li><li> Después de 30 minutos, comprobar si toda la solución se absorbe y agregar más memoria intermedia tripsina, si es necesario. Piezas de gel deben estar completamente cubiertos con tampón de tripsina. Mantener las muestras en hielo. </li><li> Deja piezas de gel durante otros 90 minutos en hielo para saturar con tripsina. (Paso crítico: el rendimiento de péptidos trípticos aumenta considerablemente con el aumento de los tiempos de incubación en hielo, probablemente a causa de la lenta difusión de la enzima en la matriz de poliacrilamida Es necesario contar con un pequeño exceso de solución que cubre las piezas de gel para evitar que las piezas. caer en seco durante la incubación durante la noche.) </li><li> Digerir a 37 º C durante 4-6 horas. Para los experimentos que requierenrecuperación péptido máxima, digerir durante la noche. </li><li> Después de la digestión de girar búfer condensada. </li><li> Tubos déjelos en remojo durante 5 min para eluir los péptidos y centrifugar de nuevo. </li><li> Recoger el sobrenadante y transferir a un tubo nuevo. </li><li> Realizar la extracción de péptido con 80 l de 30% / 1% de ácido fórmico ACN (FA) en un baño de ultrasonidos durante 15 min. </li><li> Realizar la extracción con 80 l de 30% de ACN / 1% FA en un baño de ultrasonidos durante 15 min. </li><li> Realizar la extracción con 80 l de 70% de ACN / 1% FA en un baño de ultrasonidos durante 15 min. </li><li> Se centrifuga de nuevo y la piscina sobrenadante con el eluido anterior. (FA sirve para inactivar la tripsina y aumentar la solubilidad del péptido.) </li><li> Solución de péptido seco por completo en una centrífuga de vacío. (En este punto, las muestras pueden ser almacenadas por un par de semanas en -20 ° C antes de proceder con MS-análisis.) </li><li> Péptidos Resuspender en 6 l MS tampón (5% ACN, 0,1 v / v FA, agua) y déjelos en remojo durante 2-5 min. </li><li> Centrifugar las muestras a maximuVelocidad m durante 5 min para eliminar el material particulado. </li><li> Utilice 4 l de sobrenadante para el análisis de espectrometría de masas. </li></ol> 9. MS-Análisis de Datos con &quot;Proteomatic&quot; El análisis de los datos se realizó con el software de código abierto &quot;Proteomatic&quot; (que se puede descargar de la siguiente http://www.proteomatic.org/), una plataforma que permite la generación y terminación de MS / MS de las tuberías de evaluación de datos, mediante el uso de software libre y comercial 36. En pocas palabras, los ajustes se describen a continuación y la información más detallada se puede encontrar en 6,26. <ol><li> Identificación y cuantificación de datos MS- Identificación y cuantificación de proteínas a partir de los experimentos PESO vs ΔPSI se realizaron con OMSSA (versión 2.1.4 37) y qTrace 26, respectivamente, como se describe 6,26. Para el análisis de MS-datos del experimento PESO vs pgrl1 la siguiente tubería actualizado se utilizó:<ol><li> Además de OMSSA 37, las proteínas también se identificaron con X! Tandem (versión 1.2.2013 38). Ambos algoritmos se aplicaron mediante la búsqueda contra una base de datos generada por la combinación de la versión de la base de datos modelo de gen JGI Chlamydomonas 4.3 con la versión de la base de datos AUGUSTUS 10.2, así como contra una base de datos unido de la bases de datos NCBI BK000554.2 y NC_001638.1. </li><li> MS 2 identificación de los péptidos se realizó mediante el uso de un enfoque de objetivo-señuelo 39. Un señuelo para cada proteína fue creado por azar revolver péptidos trípticos sin perder la redundancia de péptidos nonproteotypic. </li><li> La validación estadística de los péptidos se realizó con el qvality software (versión 0.3.3 40) utilizando una probabilidad de error posterior (PEP) umbral de menos de 0,01 y los resultados se filtraron con una tolerancia de masa precursora de 5 ppm. </li><li> Los péptidos de OMSSA y X! Carreras Tandem se unieron y se cuantificaron con qTrace <sup&gt; 26 sobre aplicación de las siguientes medidas de filtro: requieren identificación MS 2, añadir nombres de las proteínas / información de grupo y requieren ambos péptidos hermanas. </li></ol></li></ol> Para investigar si la proteína ratios fueron significativamente diferentes el uno hacia el otro en las fracciones-CEF Supercomplejo mixtas de WT y pgrl1, se realizó un análisis estadístico vigente el software SPSS (versión 21). Las subunidades de la citocromo b 6 / f complejo se ensayaron frente a los demás, así como las proteínas FNR, FTSH2 y HCF136 contra las subunidades PSI. Las proporciones de péptido de cada número de exploraciones por la proteína de las cuatro réplicas se realizarán las pruebas de distribución normal mediante el test de Shapiro-Wilks. Dado que las poblaciones de péptidos no tenían distribución normal (p &lt;0,001), se realizaron estadísticas no paramétricas. En primer lugar, se aplicó la prueba de Kruskal-Wallis evaluar una divergencia significativa entre los grupos. Sólo si esta prueba predijo diferencia significativas entre los grupos, se realizó un análisis adicional para predecir diferencias significativas entre los dos grupos independientes con la prueba de Mann-Whitney-U.

Los autores declaran no tener ningún interés financiero en competencia.

Diferentes estudios proteómicos cuantitativos utilizando el etiquetado de isótopos estables se han publicado en los últimos años. En estos experimentos se comparan generalmente de dos muestras diferentes, de las cuales una muestra se marca con un isótopo estable. A partir de entonces las proteínas o péptidos de las dos muestras se combinan en una proporción igual y procesados ​​adicionalmente juntos 48. Estos estudios a menudo tienen la intención de comparar los compartimentos definidos aislados celulares <em...

Procesos fotosintéticos en las membranas tilacoides de plantas y algas pueden funcionar en un modo lineal y cíclica. Durante el flujo lineal de electrones (LEF) fotosistema I (PSI), fotosistema II (PSII) y citocromo b 6 / f en última instancia, la transferencia de electrones del agua al NADP + 1, que conduce a la generación de NADPH y ATP 2. En contraste, el flujo cíclico de electrones (CEF), que es conocido por ser inducida bajo diversas condiciones ambientales como el estado 2 3 y 4, las condiciones anaeróbicas en los resultados de la re-reducción de la ISP oxidado mediante la inyección de electrones de nuevo en la cadena de transporte de electrones. Este proceso puede llevarse a cabo en el lado del estroma del citocromo b 6 / f complejo 1 o en la piscina plastoquinona 5 y genera ATP, pero no NADPH 2. El objetivo del protocolo presentado es demostrar una espectrometría de masas (MS) m basadaétodo para el análisis comparativo, cuantitativo de los complejos multiproteicos en las membranas tilacoides de Chlamydomonas reinhardtii que permite conocer mejor la composición de estos complejos en diferentes condiciones (ejemplificados mediante la comparación de cepas genéticamente diferentes). Este enfoque fue aplicado en una publicación de Terashima et al. En 2012 que muestra una Ca 2 +-dependiente de la regulación de la CEF en C. reinhardtii mediada por un complejo multiproteicos incluyendo las proteínas de CAS, ANR1 y PGRL1 6. El procedimiento se explica por comparativamente el análisis de la composición de la CEF-Supercomplejo en dos cepas genéticamente diferentes, aprovechando de este modo el etiquetado una de las dos cepas con nitrógeno pesado (15 N). Brevemente, el protocolo incluye la preparación de membranas tilacoides, seguido de la solubilización de detergente y fraccionamiento de complejos fotosintéticos en un gradiente de densidad de sacarosa. Después del fraccionamiento de la pendiente, seleccionado fracnes de dos cepas se mezclaron basan en un volumen igual, separadas por SDS-PAGE seguido de la digestión en gel y análisis por MS cuantitativa posterior. Como se mencionó anteriormente, CEF es inducida bajo diferentes condiciones ambientales y una publicación a partir de 2010 demuestra el aislamiento de un CEF-Supercomplejo funcional de estado 2 celdas bloqueadas de C. reinhardtii 7, que se lleva a cabo mediante la separación de las membranas tilacoides solubilizadas en un gradiente de densidad de sacarosa durante la ultracentrifugación. A diferencia de Iwai et al. 7, el protocolo presentado describe el aislamiento de la CEF-Supercomplejo de anaeróbico crecido C. culturas reinhardtii siguiendo un procedimiento alternativo. Este comprende cambios en el protocolo de aislamiento de tilacoide así como las diferencias relativas a la etapa de solubilización y la separación de complejos de proteínas por ultracentrifugación. En el presente protocolo, las membranas tilacoidesestán aislados mediante la aplicación del procedimiento publicado por Chua y Bennoun 8, mientras que los tampones usados ​​para la preparación tilacoide por Iwai et al. contenida Mes 25 mM, 0,33 M de sacarosa, 5 mM de MgCl 2, 1,5 mM de NaCl (pH 6,5) como se describe 9. La solubilización se realizó con 0,7-0,8% de detergente (n-tridecilo-β-D-maltósido) durante 30 min en hielo en el caso de Iwai y compañeros de trabajo, mientras que el método de solubilización descrito aquí se basa en el uso de 0,9% de detergente (N -dodecil-β-D-maltósido (β-DM)) y se lleva a cabo por sólo 20 min en hielo. Ambos grupos utilizaron 0,8 mg de clorofila por ml para la solubilización con la respectiva detergente. Para la separación de los complejos fotosintéticos de las membranas tilacoides solubilizadas Iwai et al. Aplicado concentraciones de sacarosa entre 0,1-1,3 M, mientras que los autores de este protocolo utilizado concentraciones que van desde 0,4 hasta 1,3 M. La última diferencia es la velocidad de centrifugación, que es más baja en comparación A la cupublicación rlier. La solubilización de las membranas tilacoides con detergentes no iónicos, seguido de fraccionamiento de gradiente de densidad de sacarosa ya se ha aplicado en numerosos estudios que van desde la década de 1980 hasta hoy 7, 9-14 y también la aplicación de marcaje metabólico de las proteínas es un método muy extendido en el campo de la proteómica. El enfoque descrito se aplica el etiquetado 15 N metabólica para una de las dos cepas en comparación mediante el cultivo en presencia de nitrógeno pesado como única fuente de nitrógeno en forma de 15 N NH4Cl, que se incorpora en todos los aminoácidos que conducen a una masa cambiar dependiendo de la secuencia de aminoácidos del péptido. Cuando el análisis de una mezcla de 14 N y 15 N dentro de una MS ejecuta, este cambio de masa se ​​puede utilizar para determinar el origen de la muestra para cada péptido y péptido relativa abundancia se puede calcular que representa la abundancia relativa para la correspondening proteína de 15. Numerosos estudios de proteómica cuantitativa sobre C. reinhardtii están disponibles, que compara una cantidad definida de proteínas para analizar los cambios en el proteoma entre las condiciones experimentales (por ejemplo, cambios en el proteoma de nutrientes debido a la 16-19 o la luz de estrés 20,21). En comparación con los estudios, en el enfoque que actualmente se presenta se combinaron y analizaron volúmenes iguales de muestras. Esta configuración permite estudiar el comportamiento de la migración de las proteínas dentro del gradiente y, además, para analizar la composición de diferentes complejos con respecto a las cepas investigadas. Este método se explicará mediante la concentración principalmente en tres proteínas: El primer candidato es la proteína sensor de calcio CAS-cloroplasto localizada, que ha demostrado estar implicado en la foto-aclimatación en C. reinhardtii 22. El calcio se considera que es una señal importanteción de iones de las vías que se activan debido a diferentes estreses bióticos y abióticos, finalmente, conduce a cambios en la expresión genética y la fisiología celular 23 y se propuso que los cloroplastos podrían contribuir a celular Ca 2 + señalización a través de la proteína CAS 22,24,25. La segunda proteína es ANR1 (respuesta anaeróbica 1 6), una proteína que ha demostrado ser inducida en condiciones de crecimiento anóxicas en C. reinhardtii 26. En particular, CAS, así como ANR1 se identificaron como subunidades de la CEF-Supercomplejo y por otra parte, mediante el uso de enfoques de genética inversa, se demostró que ambas proteínas contribuyen funcionalmente a CEF in vivo 6, apoyando su papel como subunidades funcionales de este complejo de proteínas. La tercera proteína es la proteína tilacoide PGR5-igual que 1 (PGRL1), que ha demostrado estar involucrados en CEF en Chlamydomonas 4,27, así como en Arabidopsis 5,28 y era también identified en la obra de Iwai et al. 7 Este enfoque será presentado por muestra los resultados de dos experimentos diferentes: de tipo salvaje (WT) versus (vs) una cepa ΔPSI 29, que presenta una deleción del gen PSAB, que codifica para un fotosistema esencial que la subunidad, que es también parte de la CEF-Supercomplejo y WT vs un pgrl1 ronda cepa 4. Para cada uno de esos experimentos la composición cuantitativa de la CEF-Supercomplejo entre un N-y una cepa 14 N-etiquetados se ha comparado 15.

<table><tbody><tr><td>Chemicals</Ácido acético fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>AppliChem</td><td>A0662</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>Acetona</td><td>AppliChem</td><td>A2300</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>Acetonitrilo Optigrade f&uuml; r LC-MS</td><td>Diagonal</td><td>9340</td><td>Nocivo, trabajar con guantes. Consulte el texto del protocolo para obtener más precauciones. https://www.diagonal.de/</td></tr><tr><td>Cloruro de amonio 15N</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>39466-62-1</td><td>http://www.isotope.com/cil/index.cfm</td></tr><tr><td>Cloruro de amonio 14N</td><td>AppliChem</td><td>A0988</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>Fosfato de hidrógeno de amonio&nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A3583</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>Sulfato de amonio&nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A3598</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>Coomassie azul brillante R-250</td><td>Fisher Scientific 10041653</td><td></td><td>http://www.de.fishersci.com/index.php/deindex</td></tr><tr><td>n-Dodecil-&beta;-D-maltósido</td><td>AppliChem</td><td>A0819</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>EDTA</td><td>AppliChem</td><td>A2937</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>Ácido fórmico&nbsp; &nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A3858</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>HEPES</td><td>AppliChem</td><td>A3724</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>Cloruro de magnesio</td><td>AppliChem</td><td>A4425</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>Metanol</td><td>AppliChem</td><td>A2954</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>Ácido fosforado</td><td>AppliChem</td><td>A0989</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>Fosfato de hidrógeno dipotásico&nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A1042</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>Fosfato de dihidrógeno de potasio&nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A1043</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>AppliChem</td><td>A1551</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>Sacarosa</td><td>AppliChem</td><td>A1125</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>Tricine</td><td>AppliChem</td><td>A3954</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>Tris</td><td>AppliChem</td><td>A2264</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>Tripsina (grado de secuenciación modificado) y tampón de tripsina</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td>http://www.promega.de/</td></tr><tr><td>Equipment</td>Nebulizador (disruptor celular <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioNeb)</td>Tubos de centrífuga <td>http://www.glascol.com/product/subproduct/id/75 Glas-Col</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(14 mm x 89 mm)&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td>para la preparación de degradados estilo Takahashi
Tubos de centrífuga http://www.beckmancoulter.de/</td></tr> <tr><td>25 mm x 89 mm </td><td>Beckman Coulter</td><td>344058</td><td>para la preparación de gradientes de aislamiento de tilacoides.
http://www.beckmancoulter.de/</td></tr><tr><td>Coulter Centrífuga Avanti J-20 XP</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>http://www.beckmancoulter.de/</td></tr> <tr><td>Cámara de couting de célula Fuchs-Rosenthal</td><td>Diagonal</td><td>449/72</td><td>https://www.diagonal.de/</td></tr> <tr><td>Homogeneizador (Potter) 50 ml&nbsp;</td><td>Fisherbrand</td><td>10618242</td><td>http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand</td></tr><tr><td>Pistilo para homogeneizador</td><td>Fisherbrand</td><td>105252220</td><td>http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand</td></tr><tr><td>Ultracentrífuga (Ultracentrífuga Optima XPN-80)</td>Sitio web de <td>Beckman Coulter</td><td></td><td>: http://www.beckmancoulter.de/</td></tr><tr><td>Other</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpos&nbsp;</td><td>Agrisera</td><td></td><td>http://www.agrisera.com/en/index.html</td></tr></tbody></table>

un nuevo enfoque para el análisis comparativo de multiproteinas complejos basados ​​en<sup&gt; 15</sup&gt; n metabólico etiquetado y cuantitativa de espectrometría de masas

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

El protocolo introducido proporciona una herramienta para el análisis de complejos multiproteicos en la membrana tilacoide, mediante la revelación de conocimientos sobre composición compleja en diferentes condiciones. En este protocolo el enfoque se demuestra mediante la comparación de la composición de la proteína complejo responsable de flujo cíclico de electrones (CEF) en Chlamydomonas reinhardtii, aislado a partir de diferentes cepas genéticamente. El procedimiento comprende el aislamiento de membranas tilacoides, seguido por su separación en complejos multiproteicos por centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa, SDS-PAGE, y la inmunodetección, espectrometría de masas cuantitativa comparativa (MS) basados ​​en el marcaje metabólico diferencial (14 N / 15 N) de la cepas analizadas. Membranas tilacoides solubilizados detergentes se cargan en gradientes de densidad de sacarosa en una concentración igual clorofila. Después de ultracentrifugación, los gradientes se separan en fracciones, que se analizan en masa-spectrometry basado en el mismo volumen. Este enfoque permite la investigación de la composición dentro de las fracciones de gradiente y, además, para analizar el comportamiento de la migración de diferentes proteínas, centrándose especialmente en ANR1, CAS, y PGRL1. Además, este método se demuestra mediante la confirmación de los resultados con inmunotransferencia y además, mediante el apoyo a los hallazgos de los estudios anteriores (la identificación y la migración PSI-dependiente de las proteínas que se describieron anteriormente para ser parte de la CEF-Supercomplejo tales como PGRL1, FNR, y cyt f). Cabe destacar que este enfoque es aplicable a abordar una amplia gama de preguntas para las que este protocolo se puede adoptar y, por ejemplo utilizado para los análisis comparativos de composición compleja multiproteico aislado de las condiciones ambientales distintas.

El enfoque de la proteómica cuantitativa introducida tiene como objetivo caracterizar la composición de los complejos multiproteicos en las membranas tilacoides demostrados por el análisis comparativo de los componentes de CEF-Supercomplejo en diferentes genéticamente C. reinhardtii cepas. El método descrito con éxito ha sido aplicado por Terashima et al. 6 y comprende el aislamiento de membranas tilacoides de cultivos anaeróbicos crecido, seguido de la solubilización de detergente. Posterio...

El enfoque descrito comparativa, cuantitativa proteómica tiene por objeto la obtención de conocimientos sobre la composición de los complejos multiproteicos bajo diferentes condiciones y se demuestra comparando genéticamente diferentes cepas. Para el análisis cuantitativo volúmenes iguales de diferentes fracciones de un gradiente de densidad de sacarosa se mezclan y se analizaron por espectrometría de masas.

Un nuevo enfoque para el análisis comparativo de Multiproteinas complejos basados ​​en<sup&gt; 15</sup&gt; N metabólico Etiquetado y cuantitativa de Espectrometría de Masas

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex ...

El objetivo general de este procedimiento es analizar comparativamente la composición de los complejos MultiPro en membranas de cordón tal bajo diferentes condiciones. Esto se logra primero aislado las membranas tal a partir de células lamona expuestas a condiciones anaeróbicas. A continuación, las membranas de cordón tal se solubilizan y fraccionan en un gradiente de densidad de sacarosa.Luego se mezclan volúmenes iguales de las fracciones deseadas y se separan mediante electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE). Finalmente, las bandas teñidas con coomassie se digieren con tripsina. En última instancia, las muestras se analizan mediante espectrometría de masas cuantitativa para observar los cambios en la abundancia de proteínas entre las fracciones estudiadas.La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como los estudios proteómicos cuantitativos que comparan una cantidad definida de proteína, es que en nuestro enfoque se combinan e analizan volúmenes iguales de muestras fraccionadas. Esto permite estudiar el comportamiento migratorio de las proteínas dentro del gradiente y, además, analizar la composición de diferentes complejos no proteicos en la membrana del grupo tres. En cuanto a las cepas utilizadas, después de cultivar cepas de Chlamydomonas reinhardtii, según el protocolo descrito, utilice soluciones stock de sacarosa 2 M, beta-DM al 10 % en agua y tris 0,5 M, pH 8,0.Para preparar las siguientes soluciones para gradientes de densidad de sacarosa y preparar los gradientes utilizando tubos de centrífuga de 14 por 89 milímetros, comience vertiendo lentamente un mililitro de la solución 1,3 molar, seguido de un mililitro de la solución 1,0 molar. Luego, vierta dos mililitros de cada una de las soluciones 0,85, 0,7, 0,65 y, finalmente, la solución 0,4 molar. Almacene los gradientes durante la noche en la cámara fría para inducir condiciones anaeróbicas.En los cultivos de chlamydomonas, inserte una pipeta de vidrio en los matraces de cultivo y burbujee con Argonne durante cuatro horas con agitación continua e iluminación para aislar las membranas del cordón talo. Después de la incubación, comience centrifugando las células durante cinco minutos a 2.500 × g y 4 °C. Luego, resuspenda los pellet celulares en 30 mililitros de tampón H1.Repita la centrifugación y, nuevamente, resuspenda. Suspender las células en tampón H uno para romper las células, pasarlas a través de un nebulizador con una presión de nitrógeno de 1.500 pascales. Asegúrese de que la distancia entre la bola de cerámica y el metal sea lo suficientemente pequeña para que las células se rompan.Luego, centrifugue las células durante siete minutos a 2.500 × g y 4 °C. El sobrenadante debe tener un color verde claro. Si la rotura celular fue exitosa, resuspenda las células en 50 mililitros de tampón H₂ y péletelas durante 10 minutos a 32.800 × g y 4 °C.Luego, después de resuspender las células en 10 mililitros de tampón H tres, utilice un homogeneizador Potter para homogeneizar la suspensión celular. A continuación, prepare gradientes de densidad de sacarosa en tubos de ultracentrífuga. Comience con 12 mililitros de células en tampón H tres.Luego, vierta lentamente una capa de 12 mililitros de tampón H cuatro y termine con 12 mililitros de tampón H cinco. Use H cinco para equilibrar el rotor y centrifugue los gradientes durante una hora a 70.700 ×g. Retire las bandas de TH de los gradientes y dilúyalas con un volumen adecuado de tampón H seis.Centrifugar las células a 37.900 ×g durante 20 minutos a cuatro grados Celsius. Si el sedimento no es compacto, añadir más tampón H seis al paso de centrifugación. A continuación, resuspender.Suspenda los cordones tilacoides en un pequeño volumen de tampón H seis para cargar un gradiente de densidad de sacarosa en un sistema fotográfico. Primero, calcule las cantidades de cordones tilacoides, beta DM y tampón H seis necesarias para cada gradiente. Siguiendo estas indicaciones, cada gradiente contendrá 0.8 miligramos por mililitro de clorofila en beta DM al 0,9 % y el tampón H seis llevará el volumen final a 700 microlitros.Para solubilizar los tilsos, prepare por separado Eloqua con tilsacoides beta DM y tampón H seis para cada gradiente. Incube las muestras en hielo durante 20 minutos e invierta cada pocos minutos para mezclar. Después, centrifugue las muestras a 14.000 ×g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius.El precipitado debe ser pequeño y de color blanquecino, y el sobrenadante será verde oscuro. Cargue el sobrenadante sobre los gradientes equilibrados con tampón H seis y ultracentrifugue a 134.470 × g durante 14 horas a cuatro grados Celsius. Después de la centrifugación, tome fotografías de los gradientes y luego fracciónelos.Utilice una aguja para perforar un orificio en la parte inferior del tubo y recolecte las fracciones en tubos de 500 microlitros. O bien, un proceso en placa de 96 pocillos. Las muestras para SDS-PAGE, digestión en gel y espectrometría de masas según el protocolo descrito en el texto, utilizando los resultados del análisis inmunológico: fracción seis del tipo salvaje y fracción 13 del delta PS uno.Se seleccionaron las fracciones pico de A y R uno para el análisis de los componentes del supercomplejo de flujo de electrones cíclico en esta figura. Se muestran las proporciones relativas de proteínas representadas como tipo silvestre sobre delta PS uno 14 N sobre 15 N para varias proteínas del núcleo de PS uno y de captación de luz de PS uno, así como para proteínas asignadas al supercomplejo de flujo de electrones cíclico. Las diferencias en abundancia de NR uno y CAS en las fracciones seis y 13 del tipo silvestre y del mutante delta PS uno sugieren que son componentes novedosos de este complejo. Aquí se presentan los resultados de la comparación cuantitativa de este supercomplejo de flujo de electrones cíclico entre el tipo silvestre y una cepa con deleción de PG L uno. Curiosamente, HCF 1 36, citocromo B seis, subunidad cuatro del citocromo B seis F y PET C parecen estar enriquecidos en el tipo silvestre, mientras que FTSH dos, citocromo F y PET O parecen estar enriquecidos en PG L uno.Después de ver este video, tendrá una buena comprensión de cómo comparar la composición de complejos MultiPro en membranas líquidas di bajo diferentes condiciones. Tenga en cuenta que para la preparación exitosa de las membranas líquidas y el aislamiento del flujo de electrones cíclico, la ruptura de células supercomplejas, el homogenizado de células y la solubilización de las membranas líquidas son pasos críticos. Además, los gradientes de densidad de sacarosa deben centrifugarse durante al menos 12 horas para lograr la separación completa de los complejos fotosintéticos.

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Investigación

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Biología

Espectrometría de masas ha demostrado ser una valiosa herramienta para el análisis de grandes complejos de proteínas. Este método permite a los puntos de vista en la arquitectura de la composición, estequiometría y en general de las asambleas de múltiples subunidades. Aquí se describe, paso a paso, cómo realizar un análisis de espectrometría de masas estructurales, y caracterizar estructuras macromoleculares.

El análisis de grandes complejos de proteínas por espectrometría de masas estructurales

Se presenta una variación de la RÁPIDA (inmunoprecipitación cuantitativa Combinado con Knockdown) enfoque que se introdujo anteriormente para distinguir entre verdadera y falsa interacciones proteína-proteína. Nuestro enfoque se basa...

El Protocolo para la identificación de las interacciones proteína-proteína base de<sup&gt; 15</sup&gt; N metabólico Etiquetado, inmunoprecipitación, cuantitativa Espectrometría de Masas y Modulación Affinity

Describimos aquí un novedoso, robusto y eficiente método de purificación de afinidad en tándem (TAP) para la expresión, aislamiento y caracterización de complejos de proteínas de células eucariotas. Este protocolo podría utilizarse para la caracterización bioquímica de complejos discretos, así como para la identificación de nuevos interactores y modificaciones postraduccionales que regulen su función.

Tandem Affinity purificación de complejos de proteínas a partir de células eucariotas

Combinado precursor de marcaje isotópico y etiquetado isobárico (cPILOT) es una estrategia proteómica cuantitativa que mejora las capacidades de multiplexación de muestra de las etiquetas isobáricas. Este protocolo describe la aplicación de cPILOT a los tejidos de los controles de modelo de ratón de la enfermedad y de tipo salvaje de un Alzheimer.

Muestra mejorada Multiplexing de tejidos usando combinada Precursor isotópico etiquetado y isobárico Tagging (cPILOT)

Presentamos un protocolo para cuantificar con precisión las proteínas con etiquetado isobárico, fraccionamiento extensa, herramientas bioinformáticas y pasos de control de calidad en combinación con interfaz a un espectrómetro de masas de alta resolución de la cromatografía líquida.

Proteoma profundo perfiles de etiquetado isobárico, extenso de la cromatografía líquida, espectrometría de masas y asistida por el Software de cuantificación

La arquitectura de complejos de la proteína es esencial para su función. Combinando varias técnicas de espectrometría de masa probado poderoso para el estudio de su montaje. Ofrecemos protocolos de reticulación química y espectrometría de masas nativa y mostrar cómo estas técnicas complementarias ayudan a dilucidar la arquitectura de los conjuntos de multi-subunidades de proteína.

La combinación de reticulación química y espectrometría de masas de complejos de proteína intacta para el estudio de la arquitectura de multi-subunidades proteína asambleas

Este manuscrito describe el protocolo para la purificación de afinidad de complementación Bimolecular (BiCAP). Este novedoso método facilita el aislamiento específico y la caracterización proteómica aguas abajo de cualquier dos proteínas obran recíprocamente, mientras que excluyendo un complejado proteínas individuales como complejos formados con competidores socios de enlace.

Disección señalización complejos por purificación de la afinidad de complementación Bimolecular (BiCAP)

Espectrometría de masas (MS) se ha convertido en una herramienta importante para la investigación de la estructura y la dinámica de asambleas macromoleculares. Aquí, integramos los enfoques basados en la MS para interrogar la formación de complejos de proteína y de ligando.

Análisis de arquitecturas de proteínas y complejos de proteína-ligando por espectrometría de masa estructural integrativo

El protocolo descrito proporciona un análisis proteómico cuantitativo optimizado de muestras de tejido utilizando dos enfoques: cuantificación basada en etiquetas y sin etiquetas. Los enfoques basados en etiquetas tienen la ventaja de una cuantificación más precisa de las proteínas, mientras que un enfoque sin etiquetas es más rentable y se utiliza para analizar cientos de muestras de una cohorte.

Flujo de trabajo integral de proteómica de escopeta basada en espectrometría de masas de muestras de tejido

Se describen los procedimientos experimentales para realizar el etiquetado covalente a base de dietilpirocarbonato con detección espectrométrica de masas. El dietilpirocarbonato simplemente se mezcla con la proteína o complejo proteico de interés, lo que lleva a la modificación de residuos de aminoácidos accesibles al disolvente. Los residuos modificados se pueden identificar después de la digestión proteolítica y la cromatografía líquida / análisis de espectrometría de masas.

Etiquetado Covalente Con Dietilpirocarbonato Para El Estudio De La Estructura De Orden Superior De Proteínas Por Espectrometría De Masas

Aquí, presentamos un protocolo para el enriquecimiento de fosfoproteínas fosfatasas endógenas y sus proteínas que interactúan a partir de células y tejidos y su identificación y cuantificación mediante proteómica basada en espectrometría de masas.

Un enfoque basado en la espectrometría de masas para identificar fosfoproteínas fosfatasas y sus interactores

Aprende a analizar complejos multiproteicos en membranas de tilacoides de Chlamydomonas mediante espectrometría de masas cuantitativa. Este método permite estudiar cambios en la abundancia de proteínas bajo condiciones anaeróbicas.

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