Un nuevo enfoque para el análisis comparativo de Multiproteinas complejos basados ​​en

El objetivo general de este procedimiento es analizar comparativamente la composición de los complejos MultiPro en membranas de cordón tal bajo diferentes condiciones. Esto se logra primero aislado las membranas tal a partir de células lamona expuestas a condiciones anaeróbicas. A continuación, las membranas de cordón tal se solubilizan y fraccionan en un gradiente de densidad de sacarosa.

Luego se mezclan volúmenes iguales de las fracciones deseadas y se separan mediante electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE). Finalmente, las bandas teñidas con coomassie se digieren con tripsina. En última instancia, las muestras se analizan mediante espectrometría de masas cuantitativa para observar los cambios en la abundancia de proteínas entre las fracciones estudiadas.

La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como los estudios proteómicos cuantitativos que comparan una cantidad definida de proteína, es que en nuestro enfoque se combinan e analizan volúmenes iguales de muestras fraccionadas. Esto permite estudiar el comportamiento migratorio de las proteínas dentro del gradiente y, además, analizar la composición de diferentes complejos no proteicos en la membrana del grupo tres. En cuanto a las cepas utilizadas, después de cultivar cepas de Chlamydomonas reinhardtii, según el protocolo descrito, utilice soluciones stock de sacarosa 2 M, beta-DM al 10 % en agua y tris 0,5 M, pH 8,0.

Para preparar las siguientes soluciones para gradientes de densidad de sacarosa y preparar los gradientes utilizando tubos de centrífuga de 14 por 89 milímetros, comience vertiendo lentamente un mililitro de la solución 1,3 molar, seguido de un mililitro de la solución 1,0 molar. Luego, vierta dos mililitros de cada una de las soluciones 0,85, 0,7, 0,65 y, finalmente, la solución 0,4 molar. Almacene los gradientes durante la noche en la cámara fría para inducir condiciones anaeróbicas.

En los cultivos de chlamydomonas, inserte una pipeta de vidrio en los matraces de cultivo y burbujee con Argonne durante cuatro horas con agitación continua e iluminación para aislar las membranas del cordón talo. Después de la incubación, comience centrifugando las células durante cinco minutos a 2.500 × g y 4 °C. Luego, resuspenda los pellet celulares en 30 mililitros de tampón H1.

Repita la centrifugación y, nuevamente, resuspenda. Suspender las células en tampón H uno para romper las células, pasarlas a través de un nebulizador con una presión de nitrógeno de 1.500 pascales. Asegúrese de que la distancia entre la bola de cerámica y el metal sea lo suficientemente pequeña para que las células se rompan.

Luego, centrifugue las células durante siete minutos a 2.500 × g y 4 °C. El sobrenadante debe tener un color verde claro. Si la rotura celular fue exitosa, resuspenda las células en 50 mililitros de tampón H₂ y péletelas durante 10 minutos a 32.800 × g y 4 °C.

Luego, después de resuspender las células en 10 mililitros de tampón H tres, utilice un homogeneizador Potter para homogeneizar la suspensión celular. A continuación, prepare gradientes de densidad de sacarosa en tubos de ultracentrífuga. Comience con 12 mililitros de células en tampón H tres.

Luego, vierta lentamente una capa de 12 mililitros de tampón H cuatro y termine con 12 mililitros de tampón H cinco. Use H cinco para equilibrar el rotor y centrifugue los gradientes durante una hora a 70.700 ×g. Retire las bandas de TH de los gradientes y dilúyalas con un volumen adecuado de tampón H seis.

Centrifugar las células a 37.900 ×g durante 20 minutos a cuatro grados Celsius. Si el sedimento no es compacto, añadir más tampón H seis al paso de centrifugación. A continuación, resuspender.

Suspenda los cordones tilacoides en un pequeño volumen de tampón H seis para cargar un gradiente de densidad de sacarosa en un sistema fotográfico. Primero, calcule las cantidades de cordones tilacoides, beta DM y tampón H seis necesarias para cada gradiente. Siguiendo estas indicaciones, cada gradiente contendrá 0.8 miligramos por mililitro de clorofila en beta DM al 0,9 % y el tampón H seis llevará el volumen final a 700 microlitros.

Para solubilizar los tilsos, prepare por separado Eloqua con tilsacoides beta DM y tampón H seis para cada gradiente. Incube las muestras en hielo durante 20 minutos e invierta cada pocos minutos para mezclar. Después, centrifugue las muestras a 14.000 ×g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius.

El precipitado debe ser pequeño y de color blanquecino, y el sobrenadante será verde oscuro. Cargue el sobrenadante sobre los gradientes equilibrados con tampón H seis y ultracentrifugue a 134.470 × g durante 14 horas a cuatro grados Celsius. Después de la centrifugación, tome fotografías de los gradientes y luego fracciónelos.

Utilice una aguja para perforar un orificio en la parte inferior del tubo y recolecte las fracciones en tubos de 500 microlitros. O bien, un proceso en placa de 96 pocillos. Las muestras para SDS-PAGE, digestión en gel y espectrometría de masas según el protocolo descrito en el texto, utilizando los resultados del análisis inmunológico: fracción seis del tipo salvaje y fracción 13 del delta PS uno.

Se seleccionaron las fracciones pico de A y R uno para el análisis de los componentes del supercomplejo de flujo de electrones cíclico en esta figura. Se muestran las proporciones relativas de proteínas representadas como tipo silvestre sobre delta PS uno 14 N sobre 15 N para varias proteínas del núcleo de PS uno y de captación de luz de PS uno, así como para proteínas asignadas al supercomplejo de flujo de electrones cíclico. Las diferencias en abundancia de NR uno y CAS en las fracciones seis y 13 del tipo silvestre y del mutante delta PS uno sugieren que son componentes novedosos de este complejo. Aquí se presentan los resultados de la comparación cuantitativa de este supercomplejo de flujo de electrones cíclico entre el tipo silvestre y una cepa con deleción de PG L uno. Curiosamente, HCF 1 36, citocromo B seis, subunidad cuatro del citocromo B seis F y PET C parecen estar enriquecidos en el tipo silvestre, mientras que FTSH dos, citocromo F y PET O parecen estar enriquecidos en PG L uno.

Después de ver este video, tendrá una buena comprensión de cómo comparar la composición de complejos MultiPro en membranas líquidas di bajo diferentes condiciones. Tenga en cuenta que para la preparación exitosa de las membranas líquidas y el aislamiento del flujo de electrones cíclico, la ruptura de células supercomplejas, el homogenizado de células y la solubilización de las membranas líquidas son pasos críticos. Además, los gradientes de densidad de sacarosa deben centrifugarse durante al menos 12 horas para lograr la separación completa de los complejos fotosintéticos.