Preparación de muestras para perfiles metabólicos utilizando imágenes de espectrometría de masas MALDI

El objetivo de este protocolo es proporcionar una guía detallada sobre la preparación de la muestra al planificar experimentos con MALDI MSI para maximizar la detección metabólica y molecular en muestras biológicas.

La espectrometría de masas MALDI Imaging es un avance único en el campo de la metabolómica que nos permite medir y visualizar la abundancia y distribución relativa de metabolitos, que son indicativos de organismos, condiciones fisiológicas y patológicas. La principal ventaja de MALDI Imaging es su capacidad para detectar metabolitos en C2 sin necesidad de marcaje. Para demostrar el procedimiento, tenemos a Sami Sauma, un estudiante graduado del laboratorio de la Dra. Patricia Casita.

Yuki Chen y Kelly Veerasammy, estudiantes investigadores de mi laboratorio. Después de la cosecha, coloque inmediatamente el tejido en un bote de nitrógeno líquido, papel de aluminio enfriado y una caja de poliestireno. Cierre la tapa de la caja de poliestireno para congelar el pañuelo durante 2 a 10 minutos, según el tamaño del pañuelo.

Cuando el tejido esté lo suficientemente congelado, use pinzas para quitar el bote y transportar el tejido asegurado dentro del papel de aluminio en hielo seco al criostato. Antes de seccionar el tejido, tenga cuidado de no respirar sobre los portaobjetos. Utilice guantes y un voltímetro ajustado a la resistencia para probar la conductividad del número adecuado de portaobjetos de vidrio recubiertos de óxido de indio y estaño compatibles con MALDI para el análisis.

Después de etiquetar, coloque los portaobjetos sobre una toalla de papel limpia y un criostato limpio con etanol al 70% a menos 20 grados centígrados. Coloque la muestra de tejido en el criostato y ajuste la temperatura de la cámara del criostato y la cabeza de la muestra, de acuerdo con el tipo de tejido. Después de permitir que el tejido se equilibre durante 30 minutos, use el compuesto de inclusión de tejido criogénico para montar el tejido en el mandril.

Y coloque y bloquee una cuchilla limpia en la plataforma, ajuste la posición de la etapa y el ángulo de la muestra para lograr el ángulo de corte deseado. Y seccionar el tejido hasta que se revele la región de interés. Cuando se haya alcanzado la región deseada, obtenga secciones de 10 a 12 micras de grosor, usando un cepillo preenfriado para recoger cuidadosamente, pero rápidamente, cada sección en el lado etiquetado de cada portaobjetos a medida que se adquieren.

Coloque un dedo debajo de las guías para calentar las secciones, para garantizar un montaje seguro en la guía. Las secciones se volverán transparentes en 5 a 10 segundos y se volverán opacas después de unos 30 a 60 segundos. Cuando se hayan recogido todas las secciones, coloque los portaobjetos en el soporte de portaobjetos y llévelo el hielo seco a un profanador.

Alternativamente, las guías se pueden transportar en una caja de vacío. Coloque los portaobjetos en un profanador con desecante y seque los portaobjetos al vacío durante 45 a 60 minutos. Después del secado, si no se usa inmediatamente, coloque los portaobjetos en el transportador de portaobjetos y llénelo con nitrógeno.

Selle el soporte con parafilm y colóquelo en una bolsa con cierre hermético. Luego coloque la primera bolsa con cierre hermético en una segunda bolsa con cierre hermético etiquetada que contiene desecante para un almacenamiento de menos 80 grados Celsius hasta por seis meses. Después de la deshidratación, use un marcador plateado de punta negrita para colocar marcas X en los espacios en blanco de los portaobjetos fuera de las secciones de tejido y use un marcador negro de punta fina para colocar una segunda X negra encima de cada X plateada. Cargue un portaobjetos en el objetivo metálico del portaobjetos MALDI y coloque una cubierta de plástico sobre el portaobjetos.

Delinee la ubicación de la muestra en la cubierta de plástico y coloque el portaobjetos y el objetivo MALDI en la superficie de un escáner plano. A continuación, obtenga una vista previa de la diapositiva y seleccione el área deseada. Escanee la diapositiva en escala de grises de 16 bits, en 2.400 puntos por pulgada y guarde la imagen para su uso posterior.

Para aplicar la matriz a los portaobjetos, encienda una unidad de pulverización de matriz automática, asegurándose de que la válvula esté colocada en la carga, e inicie el software del pulverizador. Compruebe que el extractor de aire esté funcionando correctamente y confirme en la pestaña de comunicaciones que el sistema se está comunicando correctamente. Encienda la bomba de solvente a 100 microlitros por minuto con una contrapresión de aproximadamente 500 libras por pulgada cuadrada.

Y configure el tanque de nitrógeno a 30 libras por pulgada cuadrada para iniciar el flujo de aire comprimido al rociador de matriz. Ajuste el regulador de presión en la parte delantera del rociador a 10 libras por pulgada cuadrada y configure la temperatura de la boquilla del rociador como desee. Con la válvula y la posición de carga, use la jeringa para enjuagar el circuito con siete mililitros de metanol al 70% antes de llenar el circuito con seis mililitros por matriz.

Coloque un portaobjetos de vidrio en blanco en el soporte y el rociador, pegando ambos extremos con cinta adhesiva para evitar el movimiento y verificar que el caudal y la temperatura sean estables. Presione inicio para configurar la temperatura de la boquilla y ajustar el caudal de la bomba, para que coincida con el método seleccionado. Cambie la válvula de carga a pulverización y haga clic en continuar.

Permitió que el sistema se ejecutara hasta su finalización. Cuando finalice la deposición, cambie la válvula de rociado a carga y haga clic en continuar. Examine el patrón de codificación de la matriz bajo un microscopio.

Si se observa una capa uniforme de cristal de matriz fina, deposite la matriz en los portaobjetos de muestra apropiados como se acaba de demostrar. Cuando se hayan tratado todos los portaobjetos, limpie el sistema de acuerdo con las instrucciones del fabricante para evitar la obstrucción de la boquilla del rociador. Aquí, se muestran imágenes de salida del análisis de datos de MALDI MS Imaging de espectros de descarga de masa seleccionados de cada intervalo de 100 Dalton, que muestran claramente la utilidad para la identificación de espectros desde metabolitos de moléculas pequeñas hasta lípidos de alto peso molecular.

Cada carretera muestra mapas de calor iónicos respectivos que contienen información espacial y espectral de una especie específica de metabolito en tres tejidos recolectados en los días postnatales 1, 21 y 60. Uno de los puntos fuertes de la metodología MSI de MALDI es la capacidad de discernir la especificidad de ciertas especies identificadas por la relación masa-carga con los hitos del desarrollo o estructuras anatómicas específicas. En este análisis, se observó que algunos metabolitos estaban enriquecidos en los recién nacidos del primer día postnatal o en los adultos del día 60 posnatal, o que se distribuían uniformemente a lo largo de las edades probadas.

Se observó que otras especies moleculares estaban específicamente enriquecidas en materia gris, materia blanca o líquido cefalorraquídeo y ventrículos. También se analizó la distribución espacial de metabolitos representativos, como hipoxantina, ácido glutámico, ácido N-acetil aspártico, ácido araquidónico y varios lípidos. Para mantener la fidelidad de los estatos metabólicos, la disección adecuada de la muestra, el almacenamiento y el corte del cromo son cruciales para prevenir cambios metabólicos artificiales.

Después de realizar el experimento MALDI, es posible que desee verificar las identidades de los metabolitos que encontró. Esto se puede lograr mediante microextracción y cromatografía líquida en tándem MS. MALDI MS Imaging facilita la investigación basada en la metabolómica con resolución espacial y ofrece a los investigadores la oportunidad de determinar datos metabólicos en un medio cuantitativo y visual. Recientemente se ha prestado mucho interés al efecto de la dieta en los trastornos neurodegenerativos, la relación entre el microbioma intestinal y el cerebro.

Y por eso ha habido una tremenda importancia del estudio del metabolismo en la neurociencia, desde el neurodesarrollo hasta la neurodegeneración. El hecho principal de la interacción intestino-cerebro. Y es en este contexto que la idea de la instalación de imágenes MALDI puede proporcionar tecnologías excepcionales para visualizar el efecto que una manipulación específica podría tener en el cerebro.