Cuantificación de proteína específica lisina acetilación y Succinylation estequiometría usando Spectrometry total de la adquisición de datos-independiente
4 de abril de 2018
Aquí, presentamos imparcial cuantificación de proteína específica acetilación o succinylation ocupación (estequiometría) de un proteoma completo mediante un análisis radiométrica de modificaciones endógenas a modificaciones introducidas después de cuantitativo química acilación con anhídridos marcado con el isótopo estables. En combinación con la espectrometría de masas adquisición independiente de los datos sensibles, se obtienen mediciones de ocupación del sitio exacto.
El objetivo general de este novedoso flujo de trabajo es determinar la ocupación o estequiometría de las modificaciones postraduccionales de proteínas en sitios de acetilación específicos. Este novedoso flujo de trabajo de espectrometría de masas proporciona un mayor nivel de precisión de cuantificación. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la regulación reversible de proteínas mediante modificaciones postraduccionales, como la acetilación de lisina o la succinilación, los sitios están más modificados y pueden alterar la función de la proteína. La principal ventaja de esta técnica es que la estequiometría a nivel de sitio de la acetilación y succinilación de lisina y la succinilación se determinan con precisión y el método puede determinar la estequiometría a partir de péptidos con múltiples residuos de lisina. Esta técnica es muy relevante porque revela la estequiometría de acetilación y succinilación, o proporción modificada frente a no modificada, en lugar de medir un cambio de abundancia relativa adimensional. La primera vez que tuve la idea de este método fue cuando me di cuenta de que el uso de adquisiciones independientes de datos y la cuantificación basada en MS2 para el análisis estequiométrico mejoraría en gran medida la precisión de la medición. Prepara tres réplicas de 100
Descripción general
Este estudio presenta un flujo de trabajo novedoso de espectrometría de masas para cuantificar modificaciones postraduccionales de proteínas, específicamente la acetilación y la succinilación. El método mejora la precisión de las mediciones mediante la determinación de la ocupación o estequiometría específica del sitio de estas modificaciones.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- bioquímica
- spectrometría de masas
- proteómica
Antecedentes
- Las modificaciones postraduccionales desempeñan un papel fundamental en la función de las proteínas.
- Comprender la acetilación y la succinilación es esencial para estudiar la regulación reversible de proteínas.
- Los métodos tradicionales pueden carecer de precisión al cuantificar estas modificaciones.
- Este estudio tiene como objetivo mejorar la exactitud de las mediciones de estequiometría.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un procedimiento para la cuantificación precisa de la acetilación y succinilación de proteínas.
- Identificar qué sitios de lisina están más modificados y su impacto en la función de las proteínas.
- Proporcionar un método que pueda analizar péptidos con múltiples residuos de lisina.
Métodos Utilizados
- Análisis ratiométrico de modificaciones endógenas.
- Acilación química cuantitativa utilizando anhídridos marcados con isótopos estables.
- Espectrometría de masas con adquisición independiente de datos.
- Preparación de múltiples réplicas para mayor precisión.
Resultados principales
- El método permite la determinación precisa de la estequiometría a nivel de sitio.
- Revela la proporción de residuos de lisina modificados frente a no modificados.
- Mayor precisión en las mediciones en comparación con los métodos tradicionales.
- Identifica los sitios clave de acetilación y succinilación que afectan la función proteica.
Conclusiones
- Este flujo de trabajo mejora significativamente la cuantificación de las modificaciones proteicas.
- Proporciona información sobre la regulación de la función proteica mediante acetilación y succinilación.
- La técnica es aplicable a una amplia gama de estudios proteómicos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La cuantificación precisa de la estequiometría de acetilación y succinilación en residuos específicos de lisina permite una evaluación exacta de la ocupación de las modificaciones postraduccionales, lo cual es fundamental para comprender la regulación reversible de proteínas en vías de dianas terapéuticas. Este método proporciona una medición imparcial y de todo el proteoma de los niveles de modificación, apoyando la validación de dianas al distinguir los sitios de acilación biológicamente relevantes del ruido de fondo. Al ofrecer datos estequiométricos en lugar de cambios relativos en abundancia, aumenta la confianza predictiva en la reducción de riesgos mecanicistas durante las fases iniciales del descubrimiento.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis terapéuticas mediante la cuantificación de la ocupación de acetilación y succinilación en residuos específicos de lisina.
- Valor operativo: Facilita la reducción del riesgo biológico mediante la medición precisa de la estequiometría de las modificaciones, aclarando su impacto funcional en la actividad proteica.
- Valor predictivo: Mejora la confianza en el blanco al identificar qué sitios modificados tienen mayor probabilidad de alterar la función, lo que ayuda en la selección de proyectos en la cartera.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Listo para ensayo: Prepara sistemas biológicos validados para flujos de trabajo posteriores al proporcionar datos de ocupación de la acetilación a nivel de sitio.
- Resultado cuantitativo: Utiliza las áreas de los picos de iones fragmento de la MS-DIA para permitir una cuantificación precisa y con interferencias reducidas, adecuada para la estandarización de ensayos.
- Escalabilidad: Facilita la preparación para cribado mediante un análisis proteómico reproducible y con capacidad de multiplexación de acetilación y succinilación.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Conecta el perfilado de modificaciones en fase de descubrimiento con la validación preclínica mediante la identificación de sitios de acilación relevantes para la enfermedad.
- Reducción de Riesgos Mecanísticos: Se centra en el valor predictivo al determinar la estequiometría a partir de péptidos con múltiples residuos de lisina, lo que permite una resolución específica por sitio.
- Avance Ajustado al Riesgo: Apoya las decisiones de continuar o descartar al revelar qué modificaciones de lisina son funcionalmente significativas frente a las estocásticas.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en la continuidad del descubrimiento, desde la validación inicial del blanco hasta la identificación del fármaco líder, proporcionando datos estequiométricos de acetilación y succinilación que aportan información sobre la comprensión mecanicista y los efectos de los compuestos en la función proteica.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías al cuantificar la ocupación de modificaciones en sitios específicos en respuesta a perturbaciones.
- Selección: Permite la preparación de ensayos mediante la medición estandarizada y cuantitativa de los niveles de modificación en muestras proteómicas.
- Análisis: Proporciona mediciones precisas de estequiometría mediante la cuantificación de iones fragmento por espectrometría de masas con adquisición independiente de datos (DIA-MS), lo que permite comparaciones exactas de los estados de modificación.
- Investigación Traducional: Se vincula con la continuidad preclínica al identificar sitios de acilación con alta ocupación que podrían servir como biomarcadores o indicadores mecanicistas.
- Reutilización Empresarial: Funciona como una capacidad proteómica reutilizable para un perfilado consistente de modificaciones postraduccionales (PTM) entre proyectos y clases de dianas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Proporciona confianza predictiva mediante la estequiometría precisa a nivel de sitio de acetilación y succinilación, reduciendo la ambigüedad mecanicista en la validación de dianas.
- Valor operativo: Asegura la estandarización y reproducibilidad mediante la cuantificación basada en MS-DIA y Skyline, minimizando la variabilidad técnica.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al identificar sitios de modificación con alta ocupación y relevancia funcional, reduciendo el riesgo biológico en fases tardías.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de dianas basada en evidencia funcional impulsada por modificaciones.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en proteómica basada en espectrometría de masas y técnicas de enriquecimiento de PTM.
- Depende de instrumentación compatible con DIA y de la generación de bibliotecas espectrales para la cuantificación precisa de iones fragmento.
- Necesita la estandarización entre equipos de los protocolos de preparación de muestras y de acilación química para garantizar la reproducibilidad.
- Implica consideraciones de adaptación al aplicar el flujo de trabajo a diversos sistemas modelo o tipos de tejidos.
- Conlleva limitaciones prácticas relacionadas con la detectabilidad de péptidos y la accesibilidad de los residuos de lisina en mezclas complejas.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
0:04
Title
1:18
Quantitatively Acetylate and/or Succinylate Proteins Using Isotope-labeled Acetic or Succinic Anhydride
3:48
Digest Reacted Protein Samples Using Glu-C Endoproteinase
6:27
Fractionate Peptides Using Offline Basic-pH Reversed Phase HPLC
8:15
Example Data Analysis Tutorial
10:28
Results: Succinylation Stoichiometry Ratio Calculation of Pre-succinylated BSA
11:13
Conclusion
