Name: El Enfoque ChroP Combina chip y la espectrometría de masas para diseccionar Locus específicos proteómicos Paisajes de la cromatina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-11T21:00:00.000+00:00
Duration: 24 min 2 s
Description: Aprende el enfoque ChroP para analizar la composición proteómica de dominios cromatínicos específicos mediante inmunoprecipitación y espectrometría de masas. Este método permite estudiar modificaciones de histonas y proteínas asociadas.

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Esta investigación fue publicada originalmente en Mol Proteómica Celular. Soldi M. y Bonaldi T. La investigación proteómico de la cromatina dominios funcionales Revela Nuevos establecer sinergias entre Distinct Heterocromatina Componentes MCP. 2013; 12: 64-80. © la Sociedad Americana de Bioquímica y Biología Molecular. Damos las gracias a Roberta Noberini (Instituto Italiano de Tecnología y la OEI, Italia) para la lectura crítica del manuscrito. Trabajo TB es apoyado por becas de la Armenise-Harvard Programa Giovanni Fundación de Desarrollo de Carrera, la Asociación Italiana para la Investigación del Cáncer y el Ministerio de Sanidad italiano. MS trabajo fue apoyado por una beca FIRC.

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No hay conflictos de interés declarado.

Recientemente hemos descrito ChroP, una estrategia cuantitativa para la caracterización a gran escala de los componentes de la proteína de la cromatina. ChroP combina dos enfoques complementarios utilizados en el campo epigenética, CHIP y MS, aprovechando sus fortalezas y superar sus respectivas limitaciones. Chip acoplado a la secuenciación profunda (ChIP-Seq), permite el mapeo de todo el genoma de las modificaciones de histonas en la resolución de unos 35 nucleosomas. Aunque ventajosa por su sensibilidad, e...

La cromatina es un complejo altamente dinámico nucleoproteína que está implicado como molde principal para todos los procesos de ADN mediada. El nucleosoma es la unidad básica repetida de la cromatina y se compone de un núcleo octamérico proteínico que contiene dos moléculas de cada histona H2A canónica, H2B, H3 y H4, alrededor de la cual 147 pb de ADN se envuelven 1,2. Todas las histonas se estructuran como un dominio globular y una &quot;cola&quot; N-terminal flexible que sobresale fuera del nucleosoma. Uno de los principales mecanismos de regulación de la estructura de la cromatina y la dinámica se basa en covalentes modificaciones post-traduccionales (PTMs), que se producen principalmente en los extremos N de las histonas 3,4. Modificaciones de las histonas pueden funcionar ya sea mediante la alteración de la estructura de cromatina de orden superior, cambiando los contactos entre las histonas-ADN o entre nucleosomas, y controlando así la accesibilidad de las proteínas de unión al ADN (mecanismos cis), o actuando como DockInsitios g de proteínas reguladoras, ya sea como unidades individuales, o incrustado en complejos multiméricos. Tales proteínas reguladoras pueden ejercer su función de diferentes maneras: mediante la modulación de la expresión génica directamente (es decir, proteínas TAF), o mediante la alteración de la posicionamiento de nucleosomas (es decir, la remodelación de la cromatina complejos) o mediante la modificación de otros residuos de histonas (es decir, proteínas con metil-transferasa o acetil- actividad transferasa) (mecanismos trans) 5. La observación de que distintos PTM clúster patrones en los loci de la cromatina específica condujo a la elaboración de la hipótesis de que diferentes modificaciones en los sitios distintos pueden sinergizar para generar un código molecular mediar el estado funcional del ADN subyacente. El &quot;código de histonas hipótesis&quot; ha ganado amplio consenso en los próximos años, pero su verificación experimental se ha frenado por limitaciones técnicas 6,7. Proteómica La espectrometría de masas (MS) con sede en se ha convertido en unpoderosa herramienta para mapear los patrones de modificación de histonas y caracterizar proteínas de unión a la cromatina-8. MS detecta una modificación como Δmass específica entre la masa experimental y teórica de un péptido. A nivel de las histonas individuales, MS proporciona un método imparcial y exhaustiva para mapear PTM, lo que permite la detección de nuevas modificaciones y reveladoras interactúa entre ellos 9-14. En los últimos años, un número de estrategias han sido desarrolladas para diseccionar la composición proteómico de la cromatina, incluyendo la caracterización de los cromosomas mitóticos intactos 15, la identificación de proteínas de unión a Hptm-solubles 16-18 y el aislamiento y análisis de las regiones específicas de cromatina (es decir telómeros) 19,20. Sin embargo, la investigación de las sinergias locus específicos entre PTM histonas, variantes, y las proteínas asociadas a la cromatina es aún incompleta. Aquí se describe un nuevo enfoque, llamado ChroP (Roteomics matin P CHRO) 21, que hemos desarrollado para caracterizar eficientemente cromatina dominios funcionalmente distintos. Este enfoque se adapta inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP), un protocolo bien establecido utilizado en la investigación epigenética, para el análisis proteómico basado en MS eficiente de la muestra enriquecida. Hemos desarrollado dos protocolos diferentes, dependiendo del tipo de la cromatina utilizado como entrada y la cuestión abordada por MS; en particular: 1) chip de la cromatina nativa no fijado digerido con MNase se emplea para purificar mono-nucleosomas y para diseccionar los hPTMs co-asociando (N-ChroP); 2) chip de la cromatina reticulada fragmentado por sonicación se utiliza en combinación con un interactómica estrategia basada en SILAC para caracterizar todo cromatina co-enriquecer proteínas (X-ChroP) de unión. Se ilustra aquí la combinación de N-y X-ChroP para enriquecer y estudiando heterocromatina, utilizando H3K9me3 como cebo para los pasos de inmunoprecipitación. El uso de ChroP se puede extenderpara estudiar cualquiera de las regiones distintas en la cromatina, o cambios en la composición de la cromatina dentro de la misma región durante la transición a un estado funcional diferente, allanando así el camino para diversas aplicaciones en la epigenética.

<table><tbody><tr><td>DMEM&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>BE12-614F</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>SILAC DMEM</td><td>M-Medical</td><td>FA30E15086</td><td></td></tr><tr><td>Dializado FBS</td><td>Invitrogen</td><td>26400-044</td><td></td></tr><tr><td>Lisina 0 (12C6 14N2 L-lisina)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L8662</td><td></td></tr><tr><td>Arginina 0 (12C6 14N4 L-arginina)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6969</td><td></td></tr><tr><td>Lisina 8 (13C6 15N2 L-lisina)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>68041</td><td></td></tr><tr><td>Arginina 10 (13C6 15N4 L-arginina)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>608033</td><td></td></tr><tr><td>Micrococcal Nucleasa</td><td>Roche</td><td>10 107 921 001</td><td></td></tr><tr><td>Tabletas de cóctel de inhibidores de proteasas completos, sin EDTA</td><td>Roche</td><td>04 693 132 001</td><td></td></tr><tr><td>Spectra/Por 3 tubos de diálisis, 3.5K MWCO, 18 mm de ancho plano, 50 pies de largo</td><td>Spectrumlabs</td><td>132720</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Kit de purificación de PCR</td><td>QIAGEN</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Anti-histona H3 tri-metilado K9-ChIP grado</td><td>Abcam</td><td>ab8898</td><td></td></tr><tr><td>Histona H3 péptido tri-metilo K9&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab1773</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Proteína G</td><td>Invitrogen</td><td>100.04D</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4-12%&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Bis-Tris Gel&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>NP0335BOX</td><td></td></tr><tr><td>Kit de tinción de azul coloidal</td><td>Invitrogen</td><td>LC6025</td><td></td></tr><tr><td>LDS Tampón de muestra</td><td>Invitrogen</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>Formaldheyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Anhídrido aceti-d6</td><td>Sigma Aldrich</td><td>175641-1G</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Ácido fórmico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>94318-50ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Yodoacetamida &ge; 99% (HPLC), cristalino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I6125</td><td></td></tr><tr><td>DL-Ditiothreitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina modificada de grado de secuenciación, congelada 100 &mu; g (5 y veces; 20 &mu; g)</td> <td>Promega</td><td>V5113</td><td></td></tr><tr><td>Nanospray OD 360&mu; m x ID 75&mu; m, puntas ID 8 &mu; m sin recubrimiento Pk 5</td><td>Microcolumna Srl</td><td>FS360-75-8-N-5-C15</td><td></td></tr><tr><td>ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 3 y micro; m&nbsp; &nbsp; 15% C</td><td>Dr. Maisch GmbH</td><td>r13.aq.</td><td></td></tr><tr><td>Disco de extracción de carbono, 47 mm</td><td>Agilent Technologies</td><td>12145040</td><td></td></tr><tr><td>Disco de extracción catiónico</td><td>Agilent Technologies</td><td>66889-U</td><td></td></tr></tbody></table>

el enfoque chrop combina chip y la espectrometría de masas para diseccionar locus específicos proteómicos paisajes de la cromatina

The ChroP Approach Combines ChIP and Mass Spectrometry to Dissect Locus-specific Proteomic Landscapes of Chromatin

La cromatina es un complejo de nucleoproteína altamente dinámico hecho de ADN y las proteínas que controla diversos procesos dependientes de ADN. Estructura de la cromatina y la función a regiones específicas está regulada por el enriquecimiento local de la histona modificaciones después de la traducción (hPTMs) y variantes, proteínas de unión a la cromatina, incluyendo factores de transcripción, y la metilación del ADN. La caracterización proteómico de la composición de la cromatina en las regiones funcionales distintos ha sido hasta ahora obstaculizada por la falta de protocolos eficientes para enriquecer tales dominios en la pureza y cantidad apropiada para el posterior análisis en profundidad por espectrometría de masas (MS). Se describe aquí una estrategia proteómica de la cromatina de nuevo diseño, llamado ChroP (roteomics CHRO Matin P), el cual se utiliza una inmunoprecipitación de la cromatina preparativa para aislar las regiones de cromatina distintos cuyas características, en términos de hPTMs, variantes y co-asociados proteínas no histonic, son analizó por MS. Nos ilustran quere la creación de ChroP para el enriquecimiento y el análisis de las regiones heterochromatic transcripcionalmente silentes, marcada por la presencia de tri-metilación de la lisina 9 de la histona H3. Los resultados obtenidos demuestran el potencial de ChroP en la caracterización de fondo el proteoma heterocromatina y probarlo como una estrategia de análisis de gran alcance para la comprensión de cómo los determinantes de proteínas distintas de la cromatina interactúan y sinergia para establecer configuraciones estructurales y funcionales específicos de locus.

Inmunoprecipitación de la cromatina es una poderosa técnica utilizada para el perfil de la localización de una proteína o una modificación de las histonas a lo largo del genoma. En una proteómica equivalente, chip es seguido por la proteómica basadas en MS para identificar cualitativa y cuantitativamente los hPTMs, variantes de las histonas y las proteínas de unión a la cromatina que se inmunoprecipitaron junto con la modificación o la proteína de interés, utilizados como &quot;cebo&quot;. En el enfoque N-ChroP, se indi...

Al combinar nativa y reticular inmunoprecipitación de cromatina con una elevada resolución Espectrometría de Masas, enfoque ChroP permite diseccionar la arquitectura proteómico compuesta de modificaciones de las histonas, variantes y proteínas no histonic sinergizantes en cromatina dominios funcionalmente distintos.

El Enfoque ChroP Combina chip y la espectrometría de masas para diseccionar Locus específicos proteómicos Paisajes de la cromatina

Chromatin is a highly dynamic nucleoprotein complex made of DNA and proteins that controls various DNA-dependent processes. Chromatin structure and ...

El objetivo general de este procedimiento es caracterizar la composición proteómica de dominios de cromatina funcionalmente distintos, con el fin de comprender cómo los diferentes elementos actúan sinérgicamente para determinar el estado transcripcional. Esto se logra primero preparando núcleos a partir de células en cultivo y digiriendo la cromatina en fragmentos de longitud óptima mediante métodos enzimáticos o mecánicos. El segundo paso consiste en purificar un dominio funcional específico a partir de la cromatina total mediante inmunoprecipitación, utilizando anticuerpos dirigidos contra una modificación postraduccional de histonas o contra una proteína conocida por marcar específicamente la región de interés.A continuación, las proteínas de cromatina inmunopurificadas se separan mediante electroforesis SDS-PAGE y se digieren en gel antes de la espectrometría de masas. El siguiente paso es el análisis por cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas en un instrumento de alta resolución. Finalmente, los datos brutos de espectrometría de masas se analizan mediante software ad hoc, seguido de la inspección manual de los espectros para identificar y cuantificar modifica

the-chrop-approach-combines-chip-mass-spectrometry-to-dissect-locus

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Análisis de la interacción de la cromatina por género Secuenciación Paired-End (Chia-PET) es un método...

La cromatina Análisis de Interacción con la etiqueta de secuenciación pareadas final (Chia-PET) para el mapeo de la cromatina y la comprensión de las interacciones Reglamento Transcripción

Los avances en la espectrometría de masas han permitido el análisis de alto rendimiento de la expresión de proteínas y la modificación en un huésped de tejidos. En combinación con el fraccionamiento subcelular y modelos de enfermedad, espectrometría de masa cuantitativa y bioinformática puede revelar nuevas propiedades en los sistemas biológicos. El método descrito en la presente memoria analiza asociadas a la cromatina proteínas en el contexto de las enfermedades del corazón y es fácilmente...

Análisis cuantitativo de proteomas cromatina en la enfermedad

La identificación de moléculas asociadas con regiones genómicas específicas de interés es necesaria para comprender los mecanismos de regulación de las funciones de estas regiones. Este protocolo describe los procedimientos para realizar la inmunoprecipitación de cromatina mediada por moléculas de unión al ADN (enChIP) para la identificación de proteínas y ARN asociados con una región genómica específica.

El aislamiento de regiones genómicas específicas e identificación de moléculas asociadas por enChIP

Aquí, describimos un protocolo de secuencia de ChIP de alto rendimiento optimizado y tubería de análisis computacional para la determinación de patrones de estado de todo el genoma cromatina de líneas celulares y tejidos del tumor congelado.

Una plataforma integrada para la asignación de todo el genoma de cromatina Estados mediante secuenciación del ChIP de alto rendimiento en los tejidos del Tumor

Se trata de un método para identificar nuevas proteínas DNA-que obran recíprocamente en lugares geométricos específicos, basándose en la captura de la secuencia específica de cromatina reticular para análisis proteómicos posteriormente. No se requiere ningún conocimiento previo sobre posibles proteínas, ni modificaciones de la célula. Inicialmente desarrollado para la levadura, la tecnología ahora se ha adaptado para células de mamífero.

Adaptación de la hibridación de captura de las proteínas asociadas a cromatina para proteómica a células de mamíferos

Se describe un protocolo paso a paso para cromatina tándem inmunoprecipitación secuenciación (tChIP-Seq) que permite el análisis de modificaciones específicas del tipo de célula genoma histona.

TChIP-Seq: Perfiles de celular-tipo-específico epigenoma

CUT&amp;RUN y sus variantes se pueden utilizar para determinar la ocupación de proteínas en la cromatina. Este protocolo describe cómo determinar la localización de proteínas en la cromatina utilizando uliCUT&amp;RUN unicelular.

Localización de factor de una sola célula en cromatina utilizando escisión de entrada ultra baja bajo objetivos y liberación con nucleasa

Este protocolo describe el método Capture Hi-C utilizado para caracterizar la organización 3D de regiones genómicas específicas de tamaño megabasado en alta resolución, incluidos los límites de los dominios de asociación topológica (TAD) y las interacciones de cromatina de largo alcance entre los elementos reguladores y otros elementos de secuencia de ADN.

Descifrando la organización de la cromatina 3D de alta resolución a través de Capture Hi-C

La expresión génica está regulada por interacciones de promotores génicos con elementos reguladores distales. Aquí, describimos cómo la baja entrada de Capture Hi-C (liCHi-C) permite la identificación de estas interacciones en tipos de células raras, que antes no se podían medir.

Un flujo de trabajo integrado para estudiar la arquitectura del genoma espacio-temporal centrada en el promotor en poblaciones celulares escasas

Presentamos un protocolo de tinción y análisis de microscopía de localización de molécula única de cromatina en tres colores (SMLM) que permite el mapeo reproducible de eucromatina, heterocromatina y RNAP II para análisis espacial. Este protocolo permite un marcado multicolor eficiente en entornos nucleares densos, incluyendo objetivos asociados a la cromatina, permitiendo una detección simultánea fiable.

Un protocolo de microscopía de localización de molécula única multimarca para la investigación de la cromatina en el entorno nuclear denso

Aprende el enfoque ChroP para analizar la composición proteómica de dominios cromatínicos específicos mediante inmunoprecipitación y espectrometría de masas. Este método permite estudiar modificaciones de histonas y proteínas asociadas.

El Enfoque ChroP Combina chip y la espectrometría de masas para diseccionar Locus específicos proteómicos Paisajes de la cromatina (Video) | JoVE Journal

El Enfoque ChroP Combina chip y la espectrometría de masas para diseccionar Locus específicos proteómicos Paisajes de la cromatina

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