Name: Identificación de MyoD Interactome Usando Tandem Affinity purificación Acoplada a la Espectrometría de Masas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 47 s
Description: Aprende a identificar el interactoma de MyoD mediante purificación de afinidad en tándem y espectrometría de masas en células HeLa. Este método revela socios proteicos de baja abundancia en compartimentos subnucleares específicos.

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El trabajo en el laboratorio de Ait-Si-Ali fue apoyado por la Association Française contre les Myopathies Téléthon (AFM-Téléthon); Instituto Nacional del Cáncer (INCa); Agence Nationale de la Recherche (ANR), Fondation Association pour la Recherche sur le Cancer (Fondation ARC); Groupement des Entreprises Françaises pour la Lutte contre le Cancer (GEFLUC); CNRS; La Université Paris Diderot y el ''¿Quién soy yo?'' Laboratorio de Excelencia #ANR-11- LABX-0071 financiado por el Gobierno francés a través de su programa ''Inversiones para el Futuro'' operado por la ANR bajo la subvención #ANR-11-IDEX-0005-01. EB contó con el apoyo de una beca del INCa.

<ol><li>Ait-Si-Ali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Suv39h-dependent+mechanism+for+silencing+S-phase+genes+in+differentiating+but+not+in+cycling+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">A Suv39h-dependent mechanism for silencing S-phase genes in differentiating but not in cycling cells.</a> Embo J. 23 (3), 605-615 (2004).</li>
<li>Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+development+and+the+role+of+the+myogenic+regulatory+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle development and the role of the myogenic regulatory factors.</a> Biochem Soc Trans. 24 (2), 506-509 (1996).</li>
<li>Arnold, H. H., Winter, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+differentiation%3A+more+complexity+to+the+network+of+myogenic+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Muscle differentiation: more complexity to the network of myogenic regulators.</a> Curr Opin Genet Dev. 8 (5), 539-544 (1998).</li>
<li>Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+formation+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle formation in vertebrates.</a> Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 440-448 (2001).</li>
<li>Yun, K., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+determination+and+differentiation%3A+story+of+a+core+regulatory+network+and+its+context%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle determination and differentiation: story of a core regulatory network and its context.</a> Curr Opin Cell Biol. 8 (6), 877-889 (1996).</li>
<li>Molkentin, J. D., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+regulatory+networks+for+muscle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Defining the regulatory networks for muscle development.</a> Curr Opin Genet Dev. 6 (4), 445-453 (1996).</li>
<li>Arnold, H. H., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+inactivation+of+myogenic+factor+genes+reveals+their+role+during+mouse+myogenesis%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Targeted inactivation of myogenic factor genes reveals their role during mouse myogenesis: a review.</a> Int J Dev Biol. 40 (1), 345-353 (1996).</li>
<li>Puri, P. L., Sartorelli, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+muscle+regulatory+factors+by+DNA-binding%2C+interacting+proteins%2C+and+post-transcriptional+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Regulation of muscle regulatory factors by DNA-binding, interacting proteins, and post-transcriptional modifications.</a> J Cell Physiol. 185 (2), 155-173 (2000).</li>
<li>Tapscott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+circuitry+of+a+master+switch%3A+Myod+and+the+regulation+of+skeletal+muscle+gene+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The circuitry of a master switch: Myod and the regulation of skeletal muscle gene transcription.</a> Development. 132 (12), 2685-2695 (2005).</li>
<li>Lassar, A. B., Paterson, B. M., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+a+DNA+locus+that+mediates+the+conversion+of+10T1%2F2+fibroblasts+to+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transfection of a DNA locus that mediates the conversion of 10T1/2 fibroblasts to myoblasts.</a> Cell. 47 (5), 649-656 (1986).</li>
<li>Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+single+transfected+cDNA+converts+fibroblasts+to+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts.</a> Cell. 51, 987-1000 (1987).</li>
<li>Tapscott, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MyoD1%3A+a+nuclear+phosphoprotein+requiring+a+myc+homology+region+to+convert+fibroblasts+to+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts.</a> Science. 242, 405-411 (1988).</li>
<li>Weintraub, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+muscle-specific+genes+in+pigment%2C+nerve%2C+fat%2C+liver%2C+and+fibroblast+cell+lines+by+forced+expression+of+MyoD%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Activation of muscle-specific genes in pigment, nerve, fat, liver, and fibroblast cell lines by forced expression of MyoD.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (14), 5434-5438 (1989).</li>
<li>Mal, A., Harter, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MyoD+is+functionally+linked+to+the+silencing+of+a+muscle-specific+regulatory+gene+prior+to+skeletal+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">MyoD is functionally linked to the silencing of a muscle-specific regulatory gene prior to skeletal myogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (4), 1735-1739 (2003).</li>
<li>Ohkawa, Y., Marfella, C. G., Imbalzano, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+specification+by+myogenin+and+Mef2D+via+the+SWI%2FSNF+ATPase+Brg1%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle specification by myogenin and Mef2D via the SWI/SNF ATPase Brg1.</a> Embo J. 25 (3), 490-501 (2006).</li>
<li>Ling, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysine+methyltransferase+G9a+methylates+the+transcription+factor+MyoD+and+regulates+skeletal+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Lysine methyltransferase G9a methylates the transcription factor MyoD and regulates skeletal muscle differentiation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (3), 841-846 (2012).</li>
<li>Zhang, C. L., McKinsey, T. A., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+class+II+histone+deacetylases+with+heterochromatin+protein+1%3A+potential+role+for+histone+methylation+in+control+of+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Association of class II histone deacetylases with heterochromatin protein 1: potential role for histone methylation in control of muscle differentiation.</a> Mol Cell Biol. 22 (20), 7302-7312 (2002).</li>
<li>Forcales, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal-dependent+incorporation+of+MyoD-BAF60c+into+Brg1-based+SWI%2FSNF+chromatin-remodelling+complex%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Signal-dependent incorporation of MyoD-BAF60c into Brg1-based SWI/SNF chromatin-remodelling complex.</a> The EMBO journal. 31 (2), 301-316 (2011).</li>
<li>Nakatani, Y., Ogryzko, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoaffinity+purification+of+mammalian+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Immunoaffinity purification of mammalian protein complexes.</a> Methods Enzymol. 370, 430-444 (2003).</li>
<li>Ouararhni, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histone+variant+mH2A1.1+interferes+with+transcription+by+down-regulating+PARP-1+enzymatic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The histone variant mH2A1.1 interferes with transcription by down-regulating PARP-1 enzymatic activity.</a> Genes Dev. 20 (23), 3324-3336 (2006).</li>
<li>Fritsch, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+subset+of+the+histone+H3+lysine+9+methyltransferases+Suv39h1%2C+G9a%2C+GLP%2C+and+SETDB1+participate+in+a+multimeric+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">A subset of the histone H3 lysine 9 methyltransferases Suv39h1, G9a, GLP, and SETDB1 participate in a multimeric complex.</a> Mol Cell. 37 (1), 46-56 (2010).</li>
<li>Robin, P., Fritsch, L., Philipot, O., Svinarchuk, F., Ait-Si-Ali, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+modifications+of+histones+H3+and+H4+associated+with+the+histone+methyltransferases+Suv39h1+and+G9a%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Post-translational modifications of histones H3 and H4 associated with the histone methyltransferases Suv39h1 and G9a.</a> Genome Biol. 8 (12), R270(2007).</li>
<li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+integrative+analysis+of+large+gene+lists+using+DAVID+bioinformatics+resources%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources.</a> Nat Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).</li>
<li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinformatics+enrichment+tools%3A+paths+toward+the+comprehensive+functional+analysis+of+large+gene+lists%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists.</a> Nucleic Acids Res. 37 (1), 1-13 (2009).</li>
<li>Ohta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+composition+of+mitotic+chromosomes+determined+using+multiclassifier+combinatorial+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The protein composition of mitotic chromosomes determined using multiclassifier combinatorial proteomics.</a> Cell. 142 (5), 810-821 (2010).</li>
<li>Yahi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+cooperation+between+heterochromatin+protein+HP1+isoforms+and+MyoD+in+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential cooperation between heterochromatin protein HP1 isoforms and MyoD in myoblasts.</a> J Biol Chem. 283 (35), 23692-23700 (2008).</li>
<li>Philipot, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+core+binding+factor+CBF+negatively+regulates+skeletal+muscle+terminal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">The core binding factor CBF negatively regulates skeletal muscle terminal differentiation.</a> PloS one. 5 (2), (2010).</li>
<li>Joliot, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SWI%2FSNF+subunit%2Ftumor+suppressor+BAF47%2FINI1+is+essential+in+cell+cycle+arrest+upon+skeletal+muscle+terminal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">The SWI/SNF subunit/tumor suppressor BAF47/INI1 is essential in cell cycle arrest upon skeletal muscle terminal differentiation.</a> PloS one. 9 (10), e108858(2014).</li>
<li>Tanese, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-scale+density+gradient+sedimentation+to+separate+and+analyze+multiprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Small-scale density gradient sedimentation to separate and analyze multiprotein complexes.</a> Methods. 12 (3), 224-234 (1997).</li>
<li>Singh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+KAP1+phosphorylation+switch+controls+MyoD+function+during+skeletal+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A KAP1 phosphorylation switch controls MyoD function during skeletal muscle differentiation.</a> Genes Dev. 29 (5), 513-525 (2015).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Yahi, H., Philipot, O., Guasconi, V., Fritsch, L., Ait-Si-Ali, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modification+and+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Ther+Targets%22%5BJournal%5D)">Chromatin modification and muscle differentiation.</a> Expert Opin Ther Targets. 10 (6), 923-934 (2006).</li>
<li>Sun, L., Liu, L., Yang, X. J., Wu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akt+binds+prohibitin+2+and+relieves+its+repression+of+MyoD+and+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci.+117%22%5BJournal%5D)">Akt binds prohibitin 2 and relieves its repression of MyoD and muscle differentiation.</a> J Cell Sci. 117. 117 (Pt 14), 3021-3029 (2004).</li>
<li>Caretti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+helicases+p68%2Fp72+and+the+noncoding+RNA+SRA+are+coregulators+of+MyoD+and+skeletal+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">The RNA helicases p68/p72 and the noncoding RNA SRA are coregulators of MyoD and skeletal muscle differentiation.</a> Dev Cell. 11 (4), 547-560 (2006).</li>
<li>Knoepfler, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+motif+N-terminal+to+the+DNA-binding+domains+of+myogenic+bHLH+transcription+factors+mediates+cooperative+DNA+binding+with+pbx-Meis1%2FPrep1%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A conserved motif N-terminal to the DNA-binding domains of myogenic bHLH transcription factors mediates cooperative DNA binding with pbx-Meis1/Prep1.</a> Nucleic Acids Res. 27 (18), 3752-3761 (1999).</li>
<li>Albini, S., Puri, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SWI%2FSNF+complexes%2C+chromatin+remodeling+and+skeletal+myogenesis%3A+it%27s+time+to+exchange%21%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">SWI/SNF complexes, chromatin remodeling and skeletal myogenesis: it's time to exchange!</a> Exp Cell Res. 316 (18), 3073-3080 (2010).</li>
<li>Yahi, H., Fritsch, L., Philipot, O., Guasconi, V., Souidi, M., Robin, P., Polesskaya, A., Losson, R., Harel-Bellan, A., Ait-Si-Ali, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Cooperation+between+Heterochromatin+Protein+HP1+Isoforms+and+MyoD+in+Myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential Cooperation between Heterochromatin Protein HP1 Isoforms and MyoD in Myoblasts.</a> J Biol Chem. 283 (35), 23692-23700 (2008).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El método presentado permite la identificación exhaustiva de los socios de un factor de transcripción, MyoD. Se reveló socios MyoD en un sistema heterólogo resistente a la diferenciación inducida por MyoD, es decir, células HeLa-S3. Por lo tanto, por definición, los socios de MyoD identificados se expresan de forma ubicua. Estos incluyen factores generales y específicos de la secuencia de transcripción, enzimas de la cromatina modificadores de proteínas, procesamiento del ARN, quinasas (Tablas 1 y <stro...

organismos multicelulares eucariotas están compuestos de diferentes órganos y tejidos. Cada tejido funcional tiene una expresión patrón de gen específico, que se determina en cada paso diferenciación. La diferenciación celular implica la activación de genes específicos, el mantenimiento de su expresión y, en general, el silenciamiento de un conjunto de genes, tales los que participan en la proliferación celular. la diferenciación del músculo esquelético, o miogénesis, es por tanto un proceso de múltiples pasos, que comienza con la determinación de las células madre mesodérmicas en mioblastos, y luego lleva a la diferenciación terminal de estas mioblastos en primera mono-nucleado, y a continuación, multi-nucleado, miotubos . Por lo tanto, los mioblastos se &quot;determinan&quot; las células, que son todavía capaces de proliferar, pero que están comprometidos con el linaje del músculo esquelético, y por lo tanto pueden diferenciar únicamente en las células del músculo esquelético, ya sea durante el desarrollo embrionario o en la regeneración del músculo adulto. El proceso de la terminal de músculo esquelético difierendife- está orquestada por un programa genético específico que comienza con la salida permanente del ciclo celular de las células precursoras de mioblastos que conduce a un silenciamiento definitiva de la proliferación asociada genes, tales como E2F genes diana 1. De hecho, durante el proceso de diferenciación terminal, detener la proliferación de mioblastos es un paso crucial que precede a la expresión de genes específicos del músculo esquelético y la fusión de mioblastos en miotubos 2. un programa de este tipo permite células madre musculares adultas, también llamadas células satélite, para diferenciar durante el proceso de regeneración tras una lesión del músculo esquelético. Miogénesis mamífero es críticamente dependiente de una familia de miogénica hélice-bucle-hélice (bHLH) factores de transcripción MyoD, Myf5, MRF4 y Miogenina, a menudo referido como la familia de factores de determinación del esqueleto muscular o MFR (músculo factores reguladores) 3. Cada uno de ellos tiene un papel esencial en la especificación y difdiferencia- de las células del músculo esquelético y tiene un patrón de expresión específico 4 5-7. La activación de Myf5 y MyoD constituye el paso determinante que compromete a las células con el linaje miogénico, y la posterior expresión de miogenina desencadena la miogénesis con la activación de genes específicos de músculo esquelético, como MCK (Muscle creatina quinasa). Myogenic factores de transcripción bHLH cooperan con miembros de la familia MEF2 en la activación de genes musculares de loci previamente silenciosa 8. También estimulan la transcripción de genes del esqueleto muscular como heterodímeros con proteínas bHLH ubicua, E12 y E47, conocidas como proteínas E, que se unen las denominadas cajas E en varias regiones gen regulador de las 8. Twist, Id (inhibidor de la diferenciación) y otros factores regulan negativamente este proceso, al competir con MyoD de proteínas E de unión 8. MyoD es considerado como el principal jugador en el desencadenamiento de la diferenciación terminal muscular 9 </shasta&gt; ya que tiene la capacidad de inducir un programa de determinación miogénica / diferenciación (trans-diferenciación) en muchos sistemas no musculares completamente diferenciadas 10-13. De hecho, la expresión forzada de MyoD induce la trans-diferenciación de los distintos tipos celulares, incluso las derivadas de otro origen embriológico 12. Por ejemplo, puede convertir MyoD hepatocitos, fibroblastos, melanocitos, los neuroblastos, y adipocitos en células musculares similares. La acción trans-diferenciación de MyoD implica una activación anormal del programa genético miogénica (en particular sus genes diana) en un entorno no-muscular, concomitante con el silenciamiento del programa genético original (en particular, la proliferación de genes). En la proliferación de mioblastos, MyoD se expresa pero es incapaz de activar sus genes diana incluso cuando se une a sus promotores 14-16. Por lo tanto, el requisito de MyoD a ser expresadas de forma continua en mioblastos indiferenciados sigue siendo bastante elusiva. MyoD pudo reprimir sus genes diana debido a la contratación de las enzimas represivas cromatina modificadores en la proliferación de mioblastos antes de la carga de la activación de las enzimas de remodelación de la cromatina 14,17. Por ejemplo, en la proliferación de mioblastos, MyoD se asocia con co-represor transcripcional CAP-1, las histona desacetilasas (HDACs) y methyltransferases lisina represivos (KMTS), incluyendo la lisina de la histona H3 9 o H3K9 y H3K27 KMTS, y suprimir de forma activa su expresión genes diana mediante el establecimiento de un local represiva 14,17 estructura de la cromatina. Es importante destacar que un informe reciente indica que MyoD resulte directa metilado H3K9 por el KMT G9a lo que resulta en la inhibición de su actividad transactivadora 16. Los mecanismos epigenéticos que participan en este trans-diferenciación de las células no musculares por MyoD son en gran parte desconocidos. En particular, algunas líneas de células son resistentes a la MyoD inducida trans-diferenciación. Por lo tanto, en células HeLa, MyoD es o bien inactiva oincluso podría funcionar como represor en lugar de activador de la transcripción debido a la falta de expresión de la subunidad BAF60C de la remodelación de la cromatina complejo SWI / SNF 18. Este modelo puede por lo tanto ser de elección para caracterizar mejor los mecanismos de la represión de genes MyoD inducida. También es adecuado para ensayar la capacidad de MyoD para inducir la cromatina medio ambiente represivo en su meta loci asociados con sus socios y por lo tanto descubrir los mecanismos represivos MyoD-dependiente en la proliferación de mioblastos para afinar la diferenciación terminal. A continuación se describe el protocolo para la identificación de los socios MyoD utilizando Tandem Purificación por Afinidad (TAP-Tag) acoplada a espectrometría de masas caracterización (MS). El uso de células HeLa-S3 que expresan de forma estable Bandera-HA-MyoD permitido obtener suficiente material para purificar los complejos de MyoD a partir de extractos nucleares fraccionadas. La identificación de los socios MyoD en el sistema heterólogo fue seguido por validatien un sistema en cuestión.

<table><tbody><tr><td>Líneas celulares</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HeLa-S3</td><td>ATCC</td><td>CCL-2.2</td><td></td></tr><tr><td>C2C12</td><td>ATCC</td><td>CRL-1772</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spinner</td><td>Corning</td><td>778531</td><td></td></tr><tr><td>Homogeneizador:&nbsp; Homogeneizador de onza&nbsp;</td><td>Wheaton</td><td>432-1273 y 432-1271</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo agitador para hilanderas</td><td>Bellco</td><td>778531</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Diagenode</td><td>UCD 200</td><td></td></tr><tr><td>Hemocitómetro</td><td>Marienfeld Superior&nbsp;</td><td>640610</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de baja ligereza</td><td>Sorenson</td><td>27210</td><td></td></tr><tr><td>Columna de centrifugación vacía</td><td>Bio-Rad</td><td>7326204<</td><td></td></tr><tr><td>strong>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS-poliacrilamida 4-12%&nbsp; gel</td><td>Life technologies</td><td>NP0336BOX</td><td></td></tr><tr><td>4x tampón de carga&nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>Agente reductor 10x</td><td>Life technologies</td><td>NP0004</td><td></td></tr><tr><td>Kit de tinción de plata</td><td>Life technologies</td><td>A8592</td><td></td></tr><tr><td>Unidades de filtro centrífugo, 10K</td><td>Millipore</td><td>UFC501024</td><td></td></tr><tr><td>Proteína G perlas de agarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4691</td><td></td></tr><tr><td>Proteína A/G&nbsp; Resina</td><td>Thermo Scientific</td><td>53132</td><td></td></tr><tr><td>Resina Flag (gel de afinidad anti-Flag M2-agarose)</td><td>Resina Sigma-Aldrich</td><td>A2220</td><td></td></tr><tr><td>HA (monoclonal Anti-HA agarosa)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2095</td><td></td></tr><tr><td>MNase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3755</td><td></td></tr><tr><td>Péptido libre de banderas (DYKDDDDK)</td><td>Ansynth Service BV</td><td>Síntesis personalizada</td><td>Resuspender hasta 4 mg/ml en 50 mM Tris-HCl, pH 7,8</td></tr><tr><td>Péptido libre de HA (YPYDVPDYA)</td><td>Ansynth Service BV</td><td>Síntesis personalizada</td><td>Resuspender hasta 4 mg/ml en 50 mM Tris-HCl, pH 7,8</td></tr><tr><td>Kit de ensayo de proteínas a base de ácido bicinconínico : Kit BCA</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidores de la proteasa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8830</td><td></td></tr><tr><td>Quimioluminiscencia mejorada (ECL) a base de luminol Sustrato HRP</td><td>Tecnologías de vida</td><td>34075</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>ADN de esperma de salmón cortado (Sal sódica de ácido desoxirribonucleico de testículos de salmón)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1626</td><td></td></tr><tr><td>Tetraclorhidrato de espermina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1141</td><td></td></tr><tr><td>Espermidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0266</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de funcionamiento MOPS</td><td>Life technologies</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (alta glucosa)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0822</td><td>Pre-calentamiento&nbsp; a 37 &deg; C antes</td></tr><tr><td>de usar Tripsina-EDTA (0.05% rojo de fenol</td><td>Life technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Suero</td><td>GE ciencias de la vida para la salud&nbsp;</td><td>PAA A15-102</td><td>Cada lote de suero debe ser analizado primero para sus células.</td></tr><tr><td>Penicilina y estreptomicina&nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Solución de Trypan Blue, 0.4%</td><td>Life technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Agua (filtrada estéril)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W3500</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Anticuerpos</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HA de rata (12CA5)</td><td>Roche</td><td>11583816001</td><td></td></tr><tr><td>Flag</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8592</td><td></td></tr><tr><td>MyoD</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-32758</td><td>Para usar para Western blot</td></tr><tr><td>MyoD</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-760</td><td>Para usar para inmunoprecipitación y Western blot</td></tr><tr><td>CBFbeta</td><td>Santa Cruz</td><td>FL-182&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>HP1alpha</td><td>Euromedex</td><td>2HP2G9</td><td></td></tr><tr><td>HP1beta</td><td>Euromedex</td><td>1MOD1A9AS</td><td></td></tr><tr><td>HP1gamma</td><td>Euromedex</td><td>2MOD1GC</td><td></td></tr><tr><td>Suv39h1</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>8729</td><td></td></tr><tr><td>BAF47</td><td>BD Biosciences</td><td>612111</td><td></td></tr><tr><td>Myf5</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-302</td><td></td></tr><tr><td>Tubulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9026</td><td></td></tr><tr><td>Actina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5441</td><td></td></tr><tr><td>IgG Ratón</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-2025</td><td></td></tr><tr><td>IgG Conejo</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-2027</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-rata -HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9037</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-conejo -HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6154&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-ratón -HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4416</td><td></td></tr></tbody></table>

identificación de myod interactome usando tandem affinity purificación acoplada a la espectrometría de masas

Identification of MyoD Interactome Using Tandem Affinity Purification Coupled to Mass Spectrometry

Esquelética diferenciación terminal muscular comienza con el compromiso de las células precursoras mesodérmicas pluripotentes de mioblastos. Estas células tienen todavía la capacidad de proliferar o pueden diferenciar y fusible en miotubos multinucleados, que maduran adicionalmente para formar miofibras. Esquelético muscular diferenciación terminal está orquestada por la acción coordinada de diversos factores de transcripción, en particular los miembros de los factores o MFR reguladoras musculares (MyoD, Miogenina, Myf5 y MRF4), también llamado el bHLH myogenic factores de transcripción de la familia. Estos factores cooperan con los complejos de remodelación de la cromatina dentro elaborada red de regulación transcripcional para lograr la miogénesis esquelético. En esto, MyoD se considera el factor de transcripción miogénica principal en el desencadenamiento de la diferenciación terminal muscular. Esta noción se ve reforzada por la capacidad de MyoD para convertir células no musculares en las células del músculo esquelético. Aquí se describe un enfoque utilizado para identificar MyoDcompañeros de la proteína de una manera exhaustiva con el fin de dilucidar los diferentes factores que intervienen en la diferenciación terminal del esqueleto muscular. El objetivo a largo plazo es entender los mecanismos epigenéticos implicados en la regulación de los genes del músculo esquelético, es decir, las metas. MyoD. socios MyoD se identifican mediante el uso de Tandem Purificación por Afinidad (TAP-Tag) de un sistema heterólogo acoplado a la caracterización Espectrometría de Masas (MS), seguido de la validación del papel de los interlocutores relevantes durante la diferenciación terminal del esqueleto muscular. formas aberrantes de factores miogénicos, o su regulación aberrante, se asocian con una serie de trastornos musculares: miastenia congénita, distrofia miotónica, rabdomiosarcoma y defectos en la regeneración muscular. Como tal, factores miogénicos proporcionan un número de posibles dianas terapéuticas en trastornos musculares, tanto con respecto a los mecanismos que causan la enfermedad en sí y los mecanismos de regeneración que puede mejorar el tratamiento de la enfermedad. Por lo tanto, la understan detalladading de las interacciones intermoleculares y los programas genéticos controlados por los factores miogénicos es esencial para el diseño racional de terapias eficaces.

Para entender la regulación de la actividad MyoD, se realizó la caracterización exhaustiva de los complejos MyoD utilizando purificación bioquímica, basado en la inmunopurificación de una forma de doble etiquetado de MyoD seguido por espectrometría de masas (MS). El uso de la línea celular HeLa-S3 expresar MyoD Bandera de etiquetado-HA y una línea celular de control que expresa permisos Bandera-HA para obtener material suficiente para purificar el complejo MyoD mediante la realización de...

MyoD es un factor de transcripción miogénico con una gran capacidad para inducir la transdiferenciación miogénica de muchas líneas celulares no musculares completamente diferenciadas. Los mecanismos epigenéticos implicados en esta transdiferenciación son en gran parte desconocidos. Aquí describimos un método de purificación de doble afinidad seguido de espectrometría de masas para caracterizar exhaustivamente a los socios de MyoD.

Identificación de MyoD Interactome Usando Tandem Affinity purificación Acoplada a la Espectrometría de Masas

Skeletal muscle terminal differentiation starts with the commitment of pluripotent mesodermal precursor cells to myoblasts. These cells have still the ...

El objetivo general de este experimento es caracterizar exhaustivamente las proteínas asociadas MyoD. Este método puede responder a preguntas clave en el campo de la biología del músculo esquelético, como la regulación molecular de la deformación tonal del músculo esquelético mediante el factor de transcripción muscular clave, MyoD. La principal ventaja de esta técnica es que nos permite desentrañar parejas MyoD que tienen una abundancia electivamente baja, una localizada en un compartimento subnuclear específico.Aunque este método puede proporcionar información sobre la regulación de la diferenciación muscular, también se puede aplicar a otros sistemas, como cualquier otro tejido, específicamente la diferenciación nuclear. La Dra. Lauriane Fritsch, asistente de investigación de nuestro laboratorio, demostrará el procedimiento. En este protocolo, los complejos MyoD se purificarán a partir de células HeLa S3 que expresan MyoD de forma estable con etiquetas de glutenina FLAG.Las células HeLa S3 transducidas con el vector vacío se utilizarán como control. Ambas líneas celulares se cultivaron, recolectaron y almacenaron previamente a menos 80 grados centígrados, como se describe en el

identification-myod-interactome-using-tandem-affinity-purification

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Tandem purificación de afinidad es un enfoque sólido para la identificación de socios de la unión a proteínas. Como prueba de concepto, esta metodología se aplicó a la traducción factor eIF4E bien caracterizado iniciación a co-precipitado los factores implicados en la célula huésped iniciación de la traducción. Este método se adapta fácilmente a cualquier proteína celular o viral.

Identificación de los socios interacción de proteínas en tándem de purificación de afinidad

La purificación por afinidad de las proteínas etiquetadas en combinación con espectrometría de masas (APMS) es un potente método para la asignación sistemática de las redes de interacción de proteínas y para la investigación de la base mecánica de los procesos biológicos. A continuación, se describe un péptido secuencial optimizado afinidad (SPA) APMS procedimiento desarrollado por la...

Identificación de los complejos de proteínas en<em&gt; Escherichia coli</em&gt; La purificación mediante afinidad del péptido secuencial en combinación con espectrometría de masas tándem

Drosophila es famoso por su gran alcance de la manipulación genética, pero no por su idoneidad del análisis bioquímico en profundidad. Aquí presentamos un procedimiento basado en TAP para identificar socios que interactúan de cualquier proteína de interés a partir de cerebro de la mosca. Este procedimiento puede potencialmente conducir a nuevas vías de investigación.

La identificación de la interacción proteína-proteína en<em&gt; Drosophila</em&gt; Jefes adultas por Tandem Affinity purificación (TAP)

Presentamos un protocolo para cuantificar con precisión las proteínas con etiquetado isobárico, fraccionamiento extensa, herramientas bioinformáticas y pasos de control de calidad en combinación con interfaz a un espectrómetro de masas de alta resolución de la cromatografía líquida.

Proteoma profundo perfiles de etiquetado isobárico, extenso de la cromatografía líquida, espectrometría de masas y asistida por el Software de cuantificación

Descrito es un flujo de trabajo proteómico para identificar socios de interacción de proteínas a partir de una fracción subcelular nuclear utilizando el enriquecimiento de inmunoafinidad de una proteína dada de interés y espectrometría de masas sin etiquetas. El flujo de trabajo incluye fraccionamiento subcelular, inmunoprecipitación, preparación de muestras asistidas por filtro, limpieza fuera de línea, espectrometría de masas y una canalización bioinformática aguas abajo.

Flujo de trabajo de espectrometría de masas de inmunoprecipitación sin etiquetas para la generación de perfiles de interactome nuclear a gran escala

Este flujo de trabajo describe el rendimiento del enriquecimiento eficiente en tiempo y costo de múltiples modificaciones post-traduccionales de proteínas (PTF) simultáneamente para el análisis proteómico global cuantitativo. El protocolo utiliza el enriquecimiento de PTM a nivel de péptido con múltiples anticuerpos conjugados, seguido de un análisis de espectrometría de masas de adquisición independiente de datos para obtener información biológica sobre la conversación cruzada PTM.

Enriquecimiento de afinidad simultánea de dos modificaciones post-traduccionales para la cuantificación y la localización del sitio

Presentamos un protocolo de etiquetado optimizado de etiquetas de masa en tándem (TMT) que incluye información detallada para cada uno de los siguientes pasos: extracción de proteínas, cuantificación, precipitación, digestión, etiquetado, envío a una instalación proteómica y análisis de datos.

Preparación de muestras TMT para la presentación de instalaciones proteómicas y análisis de datos posteriores

Aquí, presentamos un protocolo para el enriquecimiento de fosfoproteínas fosfatasas endógenas y sus proteínas que interactúan a partir de células y tejidos y su identificación y cuantificación mediante proteómica basada en espectrometría de masas.

Un enfoque basado en la espectrometría de masas para identificar fosfoproteínas fosfatasas y sus interactores

Este video demuestra la preparación de un diseño ultra-delgado de matriz / analito capa para el análisis de péptidos y proteínas por láser asistida por matriz de desorción ionización espectrometría de masas (MALDI-MS).

MALDI preparación de la muestra: el método de ultra capa fina

Un protocolo corto para la tinción de proteínas con Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 en geles de poliacrilamida se describe sin el uso de disolventes orgánicos o en ácido acético como en los procedimientos clásicas de tinción con CBB.

Tinción de las proteínas en geles con Coomassie G-250, sin ácido disolvente orgánico y el acético

Aprende a identificar el interactoma de MyoD mediante purificación de afinidad en tándem y espectrometría de masas en células HeLa. Este método revela socios proteicos de baja abundancia en compartimentos subnucleares específicos.

Identificación de MyoD Interactome Usando Tandem Affinity purificación Acoplada a la Espectrometría de Masas

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