Identificación de MyoD Interactome Usando Tandem Affinity purificación Acoplada a la Espectrometría de Masas

El objetivo general de este experimento es caracterizar exhaustivamente las proteínas asociadas MyoD. Este método puede responder a preguntas clave en el campo de la biología del músculo esquelético, como la regulación molecular de la deformación tonal del músculo esquelético mediante el factor de transcripción muscular clave, MyoD. La principal ventaja de esta técnica es que nos permite desentrañar parejas MyoD que tienen una abundancia electivamente baja, una localizada en un compartimento subnuclear específico.

Aunque este método puede proporcionar información sobre la regulación de la diferenciación muscular, también se puede aplicar a otros sistemas, como cualquier otro tejido, específicamente la diferenciación nuclear. La Dra. Lauriane Fritsch, asistente de investigación de nuestro laboratorio, demostrará el procedimiento. En este protocolo, los complejos MyoD se purificarán a partir de células HeLa S3 que expresan MyoD de forma estable con etiquetas de glutenina FLAG.

Las células HeLa S3 transducidas con el vector vacío se utilizarán como control. Ambas líneas celulares se cultivaron, recolectaron y almacenaron previamente a menos 80 grados centígrados, como se describe en el texto del protocolo. Rápidamente, descongele los gránulos de la célula en un baño de agua a 37 grados centígrados.

Todos los tampones y homogeneizadores deben enfriarse previamente y todo este procedimiento debe realizarse en una cámara frigorífica. Por lo general, se utilizan 20 gramos de células para cada punto experimental, pero para los fines de esta demostración, solo se procesarán 10 gramos, o alrededor de 10 ml de células. Vuelva a suspender las células en 10 mL de tampón hipotónico A, utilizando 5 mL del tampón al principio.

Luego, se agregaron 2,5 mL, seguidos de otros 2,5 mL. Lave bien la pipeta con tampón fresco para obtener el máximo de células. Transfiera 20 mL de la suspensión celular al homogeneizador preenfriado con un mortero apretado.

Homogeneizar las células con 20 golpes. Transfiera la suspensión de la celda a un tubo de 50 mililitros. Para una recuperación máxima de las células, lavar el homogeneizador con 3,5 mL de tampón de sacarosa.

Transfiera esta suspensión rápidamente al tubo de 50 ml para preservar los núcleos y limitar las fugas. Teñir una alícuota de 30 microlitros de la suspensión celular con 30 microlitros de azul de tripano al 4% y analizar bajo el microscopio para determinar la eficiencia de la lisis. Todos los núcleos deben ser azules si la lisis es exitosa.

Si es necesario, repita la homogeneización. Centrifugar durante siete minutos a 10.000 x g y cuatro grados centígrados para pellet los núcleos. Guarde el sobrenadante como una fracción citoplasmática.

Iniciar el procedimiento de preparación de la fracción extraíble de sal nuclear resuspendiendo el pellet de núcleos en 4 mL de tampón de sacarosa. A continuación, añada 4 mL de tampón con alto contenido de sal gota a gota mientras mezcla bien en un vórtice para obtener una concentración final de 300 mM de cloruro de sodio. Incubar durante 30 minutos en hielo mezclando cada cinco minutos.

A continuación, disminuya la concentración de cloruro de sodio a 150 mM agregando 8 mL de tampón de sacarosa. Centrifugar durante 10 minutos a 13.000 x g y cuatro grados centígrados. Recoge el sobrenadante, que es la fracción extraíble de sal, y déjalo en hielo.

Para preparar la fracción unida a la cromatina, vuelva a suspender el pellet meticulosamente en 3,5 mL de tampón de sacarosa. Agregue cloruro de calcio hasta una concentración final de 1 mM y mezcle. El cloruro de calcio activará la nucleasa microcócica que se añadirá posteriormente.

Precalienta la suspensión durante un minuto a 37 grados centígrados. Añadir 35 microlitros de un caldo de nucleasa microcócica de 5 unidades por microlitro para obtener una concentración final de 25 10 milésimas por microlitro. Incubar durante exactamente 12 minutos a 37 grados centígrados.

Mezclar cada cuatro minutos. Después de 12 minutos, coloque inmediatamente la reacción en hielo. Para detener la actividad de la nucleasa microcócica, agregue 56 microlitros de EDTA 5 molares pH 8.0 a una concentración final de 4 mM y vórtice.

Incubar durante cinco minutos en hielo. Sonicar cinco veces durante un minuto, cada vez a alta amplitud, permitiendo un descanso de un minuto entre sonicaciones. Centrifugar tanto la sal extraíble como las fracciones enriquecidas con nucleosomas durante 30 minutos a 85.000 x g a cuatro grados centígrados.

Recoge los sobrenadantes. La fracción extraíble de sal debe ser de unos 13 mL. Y la fracción enriquecida con nucleasoma debe ser de aproximadamente 6 mL.

Los complejos de proteínas MyoD se purificarán mediante purificación de doble afinidad. Dado que los procedimientos para la purificación basada en GALP y en HA son similares, solo se demostrará la purificación basada en GALP. Después de añadir TEGN, transfiera el volumen adecuado de resina FLAG a un tubo de 50 ml.

Se necesitan 300 microlitros de resina FLAG de la resina comercial 50%stock prewash FLAG para cada punto experimental. Centrifugar durante dos minutos a 1.000 x g. Retire el sobrenadante, agregue TEGN frío y vuelva a centrifugar.

Lava la resina FLAG con TEGN en frío un total de cinco veces. Después del último lavado, vuelva a suspender la resina FLAG en un volumen igual de TEGN. Para cada punto experimental, mezcle 300 microlitros de resina FLAG lavada y el extracto proteico correspondiente.

Utilice un tubo de 15 mL para la fracción enriquecida con nucleasoma y un tubo de 50 mL para la fracción extraíble con sal. Incubar los tubos en una rueda giratoria durante la noche a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, centrifugar todos los tubos durante dos minutos a 1.000 x g a cuatro grados centígrados.

Recoja los sobrenadantes y manténgalos a cuatro grados centígrados hasta obtener el resultado de la prueba de eficiencia de purificación. Para las muestras extraíbles con sal, vuelva a suspender la resina FLAG en 4 mL de TEGN y transfiérala a un tubo de 15 mL. Repita este paso tres veces, cada vez transfiriendo a los mismos 15 ml para evitar perder perlas.

Centrifugar durante dos minutos a 1.000 x g a cuatro grados centígrados. Después de retirar el sobrenadante, añadir 13 mL de TEGN a la resina FLAG y centrifugar durante dos minutos a 1.000 x g a cuatro grados centígrados. Lava la resina siete veces de esta manera.

Después del último lavado, vuelve a suspender la resina en 1 mL de TEGN y transfiérela a un tubo de baja fijación de 1,5 mL. Centrifugar durante dos minutos y retirar el sobrenadante. Vuelva a suspender la resina para cada punto experimental en 100 microlitros de solución de péptidos FLAG a 4 mg/mL a pH 7,8 Mezcle bien y agregue 100 microlitros de tampón TEGN.

Incubar a cuatro grados centígrados durante al menos cuatro horas para eluir las proteínas unidas. Centrifugar durante dos minutos y transferir la resina y el sobrenadante a una columna de centrifugación vacía colocada en un tubo de 2 mL. Centrifugar la columna durante un minuto a 6.000 x g.

Recoja el sobrenadante sobrante en el tubo de 2 mL. A continuación, se prueba la eficiencia de la purificación como se describe en el texto del protocolo, antes de proceder con la purificación basada en HA. Aquí se muestran resultados representativos de complejos MyoD purificados de doble afinidad a partir de fracciones extraíbles con sal nuclear o enriquecidas con nucleasomas de una línea celular HeLa S3 que expresa de manera estable FLAG HA MyoD.

La tinción de plata identificó FLAG HA MyoD, indicada por la flecha que está ausente de la línea celular simulada. Los complejos MyoD purificados de doble afinidad se fraccionaron en gradientes de glicerol. La Western blot de las fracciones utilizando anticuerpos anti-FLAG descubrió los subcomplejos MyoD en los dos compartimentos subnucleares.

En particular, el MyoD extraíble en sal se distribuye en tres subcomplejos, mientras que el MyoD unido a la cromatina pertenece principalmente a un complejo. El análisis por espectrometría de masas de interactores de MyoD aislados de fracciones nucleares extraíbles con sales nucleares y enriquecidos con nucleosomas identificó una serie de socios conocidos y nuevos socios de MyoD. Aquí, los interactores MyoD que se encuentran en ambas fracciones o, específicamente para una de las fracciones, se agrupan en función de sus anotaciones funcionales.

Algunos de los interactianos revelados por espectrometría de masas fueron confirmados por Western blot en complejos MyoD. Estos incluyen los factores de transcripción CBF, la subunidad SWI/SNF BAF47 y las proteínas HP1. Dado que las células HeLa no son células musculares y normalmente no expresan MyoD, es necesario confirmar las interacciones entre los interactores recién identificados y MyoD y los mioblastos.

Se utilizaron extractos nucleares totales de mioblastos de ratón en proliferación y diferenciación para la inmunoprecipitación y el análisis occidental con los anticuerpos indicados. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en dos días y medio si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar refinar los resultados obtenidos en los mioblastos.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el derribo de la pareja particular en el sistema de relevancia, como los mioblastos, para responder a preguntas adicionales como el significado funcional de la interacción. Después de su desarrollo, esta técnica allana el camino para que los investigadores en el campo de la epigenética biológica del desarrollo exploren la red de regulación de cinco factores de transcripción en la mayoría de los sistemas corporales. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo identificar los socios del factor de transcripción mediante la realización de un fraccionamiento celular seguido de una purificación de afinidad en tándem junto con espectrometría de masas.