Name: Identificación de MyoD Interactome Usando Tandem Affinity purificación Acoplada a la Espectrometría de Masas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 47 s
Description: Aprende a identificar el interactoma de MyoD mediante purificación de afinidad en tándem y espectrometría de masas en células HeLa. Este método revela socios proteicos de baja abundancia en compartimentos subnucleares específicos.

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El trabajo en el laboratorio de Ait-Si-Ali fue apoyado por la Association Française contre les Myopathies Téléthon (AFM-Téléthon); Instituto Nacional del Cáncer (INCa); Agence Nationale de la Recherche (ANR), Fondation Association pour la Recherche sur le Cancer (Fondation ARC); Groupement des Entreprises Françaises pour la Lutte contre le Cancer (GEFLUC); CNRS; La Université Paris Diderot y el ''¿Quién soy yo?'' Laboratorio de Excelencia #ANR-11- LABX-0071 financiado por el Gobierno francés a través de su programa ''Inversiones para el Futuro'' operado por la ANR bajo la subvención #ANR-11-IDEX-0005-01. EB contó con el apoyo de una beca del INCa.

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<li>Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+development+and+the+role+of+the+myogenic+regulatory+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle development and the role of the myogenic regulatory factors.</a> Biochem Soc Trans. 24 (2), 506-509 (1996).</li>
<li>Arnold, H. H., Winter, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+differentiation%3A+more+complexity+to+the+network+of+myogenic+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Muscle differentiation: more complexity to the network of myogenic regulators.</a> Curr Opin Genet Dev. 8 (5), 539-544 (1998).</li>
<li>Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+formation+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle formation in vertebrates.</a> Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 440-448 (2001).</li>
<li>Yun, K., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+determination+and+differentiation%3A+story+of+a+core+regulatory+network+and+its+context%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle determination and differentiation: story of a core regulatory network and its context.</a> Curr Opin Cell Biol. 8 (6), 877-889 (1996).</li>
<li>Molkentin, J. D., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+regulatory+networks+for+muscle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Defining the regulatory networks for muscle development.</a> Curr Opin Genet Dev. 6 (4), 445-453 (1996).</li>
<li>Arnold, H. H., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+inactivation+of+myogenic+factor+genes+reveals+their+role+during+mouse+myogenesis%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Targeted inactivation of myogenic factor genes reveals their role during mouse myogenesis: a review.</a> Int J Dev Biol. 40 (1), 345-353 (1996).</li>
<li>Puri, P. L., Sartorelli, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+muscle+regulatory+factors+by+DNA-binding%2C+interacting+proteins%2C+and+post-transcriptional+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Regulation of muscle regulatory factors by DNA-binding, interacting proteins, and post-transcriptional modifications.</a> J Cell Physiol. 185 (2), 155-173 (2000).</li>
<li>Tapscott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+circuitry+of+a+master+switch%3A+Myod+and+the+regulation+of+skeletal+muscle+gene+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The circuitry of a master switch: Myod and the regulation of skeletal muscle gene transcription.</a> Development. 132 (12), 2685-2695 (2005).</li>
<li>Lassar, A. B., Paterson, B. M., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+a+DNA+locus+that+mediates+the+conversion+of+10T1%2F2+fibroblasts+to+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transfection of a DNA locus that mediates the conversion of 10T1/2 fibroblasts to myoblasts.</a> Cell. 47 (5), 649-656 (1986).</li>
<li>Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+single+transfected+cDNA+converts+fibroblasts+to+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts.</a> Cell. 51, 987-1000 (1987).</li>
<li>Tapscott, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MyoD1%3A+a+nuclear+phosphoprotein+requiring+a+myc+homology+region+to+convert+fibroblasts+to+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts.</a> Science. 242, 405-411 (1988).</li>
<li>Weintraub, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+muscle-specific+genes+in+pigment%2C+nerve%2C+fat%2C+liver%2C+and+fibroblast+cell+lines+by+forced+expression+of+MyoD%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Activation of muscle-specific genes in pigment, nerve, fat, liver, and fibroblast cell lines by forced expression of MyoD.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (14), 5434-5438 (1989).</li>
<li>Mal, A., Harter, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MyoD+is+functionally+linked+to+the+silencing+of+a+muscle-specific+regulatory+gene+prior+to+skeletal+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">MyoD is functionally linked to the silencing of a muscle-specific regulatory gene prior to skeletal myogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (4), 1735-1739 (2003).</li>
<li>Ohkawa, Y., Marfella, C. G., Imbalzano, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+specification+by+myogenin+and+Mef2D+via+the+SWI%2FSNF+ATPase+Brg1%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle specification by myogenin and Mef2D via the SWI/SNF ATPase Brg1.</a> Embo J. 25 (3), 490-501 (2006).</li>
<li>Ling, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysine+methyltransferase+G9a+methylates+the+transcription+factor+MyoD+and+regulates+skeletal+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Lysine methyltransferase G9a methylates the transcription factor MyoD and regulates skeletal muscle differentiation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (3), 841-846 (2012).</li>
<li>Zhang, C. L., McKinsey, T. A., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+class+II+histone+deacetylases+with+heterochromatin+protein+1%3A+potential+role+for+histone+methylation+in+control+of+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Association of class II histone deacetylases with heterochromatin protein 1: potential role for histone methylation in control of muscle differentiation.</a> Mol Cell Biol. 22 (20), 7302-7312 (2002).</li>
<li>Forcales, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal-dependent+incorporation+of+MyoD-BAF60c+into+Brg1-based+SWI%2FSNF+chromatin-remodelling+complex%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Signal-dependent incorporation of MyoD-BAF60c into Brg1-based SWI/SNF chromatin-remodelling complex.</a> The EMBO journal. 31 (2), 301-316 (2011).</li>
<li>Nakatani, Y., Ogryzko, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoaffinity+purification+of+mammalian+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Immunoaffinity purification of mammalian protein complexes.</a> Methods Enzymol. 370, 430-444 (2003).</li>
<li>Ouararhni, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histone+variant+mH2A1.1+interferes+with+transcription+by+down-regulating+PARP-1+enzymatic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The histone variant mH2A1.1 interferes with transcription by down-regulating PARP-1 enzymatic activity.</a> Genes Dev. 20 (23), 3324-3336 (2006).</li>
<li>Fritsch, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+subset+of+the+histone+H3+lysine+9+methyltransferases+Suv39h1%2C+G9a%2C+GLP%2C+and+SETDB1+participate+in+a+multimeric+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">A subset of the histone H3 lysine 9 methyltransferases Suv39h1, G9a, GLP, and SETDB1 participate in a multimeric complex.</a> Mol Cell. 37 (1), 46-56 (2010).</li>
<li>Robin, P., Fritsch, L., Philipot, O., Svinarchuk, F., Ait-Si-Ali, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+modifications+of+histones+H3+and+H4+associated+with+the+histone+methyltransferases+Suv39h1+and+G9a%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Post-translational modifications of histones H3 and H4 associated with the histone methyltransferases Suv39h1 and G9a.</a> Genome Biol. 8 (12), R270(2007).</li>
<li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+integrative+analysis+of+large+gene+lists+using+DAVID+bioinformatics+resources%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources.</a> Nat Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).</li>
<li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinformatics+enrichment+tools%3A+paths+toward+the+comprehensive+functional+analysis+of+large+gene+lists%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists.</a> Nucleic Acids Res. 37 (1), 1-13 (2009).</li>
<li>Ohta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+composition+of+mitotic+chromosomes+determined+using+multiclassifier+combinatorial+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The protein composition of mitotic chromosomes determined using multiclassifier combinatorial proteomics.</a> Cell. 142 (5), 810-821 (2010).</li>
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<li>Philipot, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+core+binding+factor+CBF+negatively+regulates+skeletal+muscle+terminal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">The core binding factor CBF negatively regulates skeletal muscle terminal differentiation.</a> PloS one. 5 (2), (2010).</li>
<li>Joliot, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SWI%2FSNF+subunit%2Ftumor+suppressor+BAF47%2FINI1+is+essential+in+cell+cycle+arrest+upon+skeletal+muscle+terminal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">The SWI/SNF subunit/tumor suppressor BAF47/INI1 is essential in cell cycle arrest upon skeletal muscle terminal differentiation.</a> PloS one. 9 (10), e108858(2014).</li>
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<li>Singh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+KAP1+phosphorylation+switch+controls+MyoD+function+during+skeletal+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A KAP1 phosphorylation switch controls MyoD function during skeletal muscle differentiation.</a> Genes Dev. 29 (5), 513-525 (2015).</li>
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<li>Yahi, H., Philipot, O., Guasconi, V., Fritsch, L., Ait-Si-Ali, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modification+and+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Ther+Targets%22%5BJournal%5D)">Chromatin modification and muscle differentiation.</a> Expert Opin Ther Targets. 10 (6), 923-934 (2006).</li>
<li>Sun, L., Liu, L., Yang, X. J., Wu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akt+binds+prohibitin+2+and+relieves+its+repression+of+MyoD+and+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci.+117%22%5BJournal%5D)">Akt binds prohibitin 2 and relieves its repression of MyoD and muscle differentiation.</a> J Cell Sci. 117. 117 (Pt 14), 3021-3029 (2004).</li>
<li>Caretti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+helicases+p68%2Fp72+and+the+noncoding+RNA+SRA+are+coregulators+of+MyoD+and+skeletal+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">The RNA helicases p68/p72 and the noncoding RNA SRA are coregulators of MyoD and skeletal muscle differentiation.</a> Dev Cell. 11 (4), 547-560 (2006).</li>
<li>Knoepfler, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+motif+N-terminal+to+the+DNA-binding+domains+of+myogenic+bHLH+transcription+factors+mediates+cooperative+DNA+binding+with+pbx-Meis1%2FPrep1%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A conserved motif N-terminal to the DNA-binding domains of myogenic bHLH transcription factors mediates cooperative DNA binding with pbx-Meis1/Prep1.</a> Nucleic Acids Res. 27 (18), 3752-3761 (1999).</li>
<li>Albini, S., Puri, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SWI%2FSNF+complexes%2C+chromatin+remodeling+and+skeletal+myogenesis%3A+it%27s+time+to+exchange%21%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">SWI/SNF complexes, chromatin remodeling and skeletal myogenesis: it's time to exchange!</a> Exp Cell Res. 316 (18), 3073-3080 (2010).</li>
<li>Yahi, H., Fritsch, L., Philipot, O., Guasconi, V., Souidi, M., Robin, P., Polesskaya, A., Losson, R., Harel-Bellan, A., Ait-Si-Ali, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Cooperation+between+Heterochromatin+Protein+HP1+Isoforms+and+MyoD+in+Myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential Cooperation between Heterochromatin Protein HP1 Isoforms and MyoD in Myoblasts.</a> J Biol Chem. 283 (35), 23692-23700 (2008).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El método presentado permite la identificación exhaustiva de los socios de un factor de transcripción, MyoD. Se reveló socios MyoD en un sistema heterólogo resistente a la diferenciación inducida por MyoD, es decir, células HeLa-S3. Por lo tanto, por definición, los socios de MyoD identificados se expresan de forma ubicua. Estos incluyen factores generales y específicos de la secuencia de transcripción, enzimas de la cromatina modificadores de proteínas, procesamiento del ARN, quinasas (Tablas 1 y <stro...

organismos multicelulares eucariotas están compuestos de diferentes órganos y tejidos. Cada tejido funcional tiene una expresión patrón de gen específico, que se determina en cada paso diferenciación. La diferenciación celular implica la activación de genes específicos, el mantenimiento de su expresión y, en general, el silenciamiento de un conjunto de genes, tales los que participan en la proliferación celular. la diferenciación del músculo esquelético, o miogénesis, es por tanto un proceso de múltiples pasos, que comienza con la determinación de las células madre mesodérmicas en mioblastos, y luego lleva a la diferenciación terminal de estas mioblastos en primera mono-nucleado, y a continuación, multi-nucleado, miotubos . Por lo tanto, los mioblastos se &quot;determinan&quot; las células, que son todavía capaces de proliferar, pero que están comprometidos con el linaje del músculo esquelético, y por lo tanto pueden diferenciar únicamente en las células del músculo esquelético, ya sea durante el desarrollo embrionario o en la regeneración del músculo adulto. El proceso de la terminal de músculo esquelético difierendife- está orquestada por un programa genético específico que comienza con la salida permanente del ciclo celular de las células precursoras de mioblastos que conduce a un silenciamiento definitiva de la proliferación asociada genes, tales como E2F genes diana 1. De hecho, durante el proceso de diferenciación terminal, detener la proliferación de mioblastos es un paso crucial que precede a la expresión de genes específicos del músculo esquelético y la fusión de mioblastos en miotubos 2. un programa de este tipo permite células madre musculares adultas, también llamadas células satélite, para diferenciar durante el proceso de regeneración tras una lesión del músculo esquelético. Miogénesis mamífero es críticamente dependiente de una familia de miogénica hélice-bucle-hélice (bHLH) factores de transcripción MyoD, Myf5, MRF4 y Miogenina, a menudo referido como la familia de factores de determinación del esqueleto muscular o MFR (músculo factores reguladores) 3. Cada uno de ellos tiene un papel esencial en la especificación y difdiferencia- de las células del músculo esquelético y tiene un patrón de expresión específico 4 5-7. La activación de Myf5 y MyoD constituye el paso determinante que compromete a las células con el linaje miogénico, y la posterior expresión de miogenina desencadena la miogénesis con la activación de genes específicos de músculo esquelético, como MCK (Muscle creatina quinasa). Myogenic factores de transcripción bHLH cooperan con miembros de la familia MEF2 en la activación de genes musculares de loci previamente silenciosa 8. También estimulan la transcripción de genes del esqueleto muscular como heterodímeros con proteínas bHLH ubicua, E12 y E47, conocidas como proteínas E, que se unen las denominadas cajas E en varias regiones gen regulador de las 8. Twist, Id (inhibidor de la diferenciación) y otros factores regulan negativamente este proceso, al competir con MyoD de proteínas E de unión 8. MyoD es considerado como el principal jugador en el desencadenamiento de la diferenciación terminal muscular 9 </shasta&gt; ya que tiene la capacidad de inducir un programa de determinación miogénica / diferenciación (trans-diferenciación) en muchos sistemas no musculares completamente diferenciadas 10-13. De hecho, la expresión forzada de MyoD induce la trans-diferenciación de los distintos tipos celulares, incluso las derivadas de otro origen embriológico 12. Por ejemplo, puede convertir MyoD hepatocitos, fibroblastos, melanocitos, los neuroblastos, y adipocitos en células musculares similares. La acción trans-diferenciación de MyoD implica una activación anormal del programa genético miogénica (en particular sus genes diana) en un entorno no-muscular, concomitante con el silenciamiento del programa genético original (en particular, la proliferación de genes). En la proliferación de mioblastos, MyoD se expresa pero es incapaz de activar sus genes diana incluso cuando se une a sus promotores 14-16. Por lo tanto, el requisito de MyoD a ser expresadas de forma continua en mioblastos indiferenciados sigue siendo bastante elusiva. MyoD pudo reprimir sus genes diana debido a la contratación de las enzimas represivas cromatina modificadores en la proliferación de mioblastos antes de la carga de la activación de las enzimas de remodelación de la cromatina 14,17. Por ejemplo, en la proliferación de mioblastos, MyoD se asocia con co-represor transcripcional CAP-1, las histona desacetilasas (HDACs) y methyltransferases lisina represivos (KMTS), incluyendo la lisina de la histona H3 9 o H3K9 y H3K27 KMTS, y suprimir de forma activa su expresión genes diana mediante el establecimiento de un local represiva 14,17 estructura de la cromatina. Es importante destacar que un informe reciente indica que MyoD resulte directa metilado H3K9 por el KMT G9a lo que resulta en la inhibición de su actividad transactivadora 16. Los mecanismos epigenéticos que participan en este trans-diferenciación de las células no musculares por MyoD son en gran parte desconocidos. En particular, algunas líneas de células son resistentes a la MyoD inducida trans-diferenciación. Por lo tanto, en células HeLa, MyoD es o bien inactiva oincluso podría funcionar como represor en lugar de activador de la transcripción debido a la falta de expresión de la subunidad BAF60C de la remodelación de la cromatina complejo SWI / SNF 18. Este modelo puede por lo tanto ser de elección para caracterizar mejor los mecanismos de la represión de genes MyoD inducida. También es adecuado para ensayar la capacidad de MyoD para inducir la cromatina medio ambiente represivo en su meta loci asociados con sus socios y por lo tanto descubrir los mecanismos represivos MyoD-dependiente en la proliferación de mioblastos para afinar la diferenciación terminal. A continuación se describe el protocolo para la identificación de los socios MyoD utilizando Tandem Purificación por Afinidad (TAP-Tag) acoplada a espectrometría de masas caracterización (MS). El uso de células HeLa-S3 que expresan de forma estable Bandera-HA-MyoD permitido obtener suficiente material para purificar los complejos de MyoD a partir de extractos nucleares fraccionadas. La identificación de los socios MyoD en el sistema heterólogo fue seguido por validatien un sistema en cuestión.

<table><tbody><tr><td>Líneas celulares</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HeLa-S3</td><td>ATCC</td><td>CCL-2.2</td><td></td></tr><tr><td>C2C12</td><td>ATCC</td><td>CRL-1772</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spinner</td><td>Corning</td><td>778531</td><td></td></tr><tr><td>Homogeneizador:&nbsp; Homogeneizador de onza&nbsp;</td><td>Wheaton</td><td>432-1273 y 432-1271</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo agitador para hilanderas</td><td>Bellco</td><td>778531</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Diagenode</td><td>UCD 200</td><td></td></tr><tr><td>Hemocitómetro</td><td>Marienfeld Superior&nbsp;</td><td>640610</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de baja ligereza</td><td>Sorenson</td><td>27210</td><td></td></tr><tr><td>Columna de centrifugación vacía</td><td>Bio-Rad</td><td>7326204<</td><td></td></tr><tr><td>strong>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS-poliacrilamida 4-12%&nbsp; gel</td><td>Life technologies</td><td>NP0336BOX</td><td></td></tr><tr><td>4x tampón de carga&nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>Agente reductor 10x</td><td>Life technologies</td><td>NP0004</td><td></td></tr><tr><td>Kit de tinción de plata</td><td>Life technologies</td><td>A8592</td><td></td></tr><tr><td>Unidades de filtro centrífugo, 10K</td><td>Millipore</td><td>UFC501024</td><td></td></tr><tr><td>Proteína G perlas de agarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4691</td><td></td></tr><tr><td>Proteína A/G&nbsp; Resina</td><td>Thermo Scientific</td><td>53132</td><td></td></tr><tr><td>Resina Flag (gel de afinidad anti-Flag M2-agarose)</td><td>Resina Sigma-Aldrich</td><td>A2220</td><td></td></tr><tr><td>HA (monoclonal Anti-HA agarosa)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2095</td><td></td></tr><tr><td>MNase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3755</td><td></td></tr><tr><td>Péptido libre de banderas (DYKDDDDK)</td><td>Ansynth Service BV</td><td>Síntesis personalizada</td><td>Resuspender hasta 4 mg/ml en 50 mM Tris-HCl, pH 7,8</td></tr><tr><td>Péptido libre de HA (YPYDVPDYA)</td><td>Ansynth Service BV</td><td>Síntesis personalizada</td><td>Resuspender hasta 4 mg/ml en 50 mM Tris-HCl, pH 7,8</td></tr><tr><td>Kit de ensayo de proteínas a base de ácido bicinconínico : Kit BCA</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidores de la proteasa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8830</td><td></td></tr><tr><td>Quimioluminiscencia mejorada (ECL) a base de luminol Sustrato HRP</td><td>Tecnologías de vida</td><td>34075</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>ADN de esperma de salmón cortado (Sal sódica de ácido desoxirribonucleico de testículos de salmón)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1626</td><td></td></tr><tr><td>Tetraclorhidrato de espermina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1141</td><td></td></tr><tr><td>Espermidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0266</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de funcionamiento MOPS</td><td>Life technologies</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (alta glucosa)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0822</td><td>Pre-calentamiento&nbsp; a 37 &deg; C antes</td></tr><tr><td>de usar Tripsina-EDTA (0.05% rojo de fenol</td><td>Life technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Suero</td><td>GE ciencias de la vida para la salud&nbsp;</td><td>PAA A15-102</td><td>Cada lote de suero debe ser analizado primero para sus células.</td></tr><tr><td>Penicilina y estreptomicina&nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Solución de Trypan Blue, 0.4%</td><td>Life technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Agua (filtrada estéril)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W3500</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Anticuerpos</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HA de rata (12CA5)</td><td>Roche</td><td>11583816001</td><td></td></tr><tr><td>Flag</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8592</td><td></td></tr><tr><td>MyoD</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-32758</td><td>Para usar para Western blot</td></tr><tr><td>MyoD</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-760</td><td>Para usar para inmunoprecipitación y Western blot</td></tr><tr><td>CBFbeta</td><td>Santa Cruz</td><td>FL-182&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>HP1alpha</td><td>Euromedex</td><td>2HP2G9</td><td></td></tr><tr><td>HP1beta</td><td>Euromedex</td><td>1MOD1A9AS</td><td></td></tr><tr><td>HP1gamma</td><td>Euromedex</td><td>2MOD1GC</td><td></td></tr><tr><td>Suv39h1</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>8729</td><td></td></tr><tr><td>BAF47</td><td>BD Biosciences</td><td>612111</td><td></td></tr><tr><td>Myf5</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-302</td><td></td></tr><tr><td>Tubulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9026</td><td></td></tr><tr><td>Actina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5441</td><td></td></tr><tr><td>IgG Ratón</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-2025</td><td></td></tr><tr><td>IgG Conejo</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-2027</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-rata -HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9037</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-conejo -HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6154&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-ratón -HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4416</td><td></td></tr></tbody></table>

identificación de myod interactome usando tandem affinity purificación acoplada a la espectrometría de masas

Identification of MyoD Interactome Using Tandem Affinity Purification Coupled to Mass Spectrometry

Esquelética diferenciación terminal muscular comienza con el compromiso de las células precursoras mesodérmicas pluripotentes de mioblastos. Estas células tienen todavía la capacidad de proliferar o pueden diferenciar y fusible en miotubos multinucleados, que maduran adicionalmente para formar miofibras. Esquelético muscular diferenciación terminal está orquestada por la acción coordinada de diversos factores de transcripción, en particular los miembros de los factores o MFR reguladoras musculares (MyoD, Miogenina, Myf5 y MRF4), también llamado el bHLH myogenic factores de transcripción de la familia. Estos factores cooperan con los complejos de remodelación de la cromatina dentro elaborada red de regulación transcripcional para lograr la miogénesis esquelético. En esto, MyoD se considera el factor de transcripción miogénica principal en el desencadenamiento de la diferenciación terminal muscular. Esta noción se ve reforzada por la capacidad de MyoD para convertir células no musculares en las células del músculo esquelético. Aquí se describe un enfoque utilizado para identificar MyoDcompañeros de la proteína de una manera exhaustiva con el fin de dilucidar los diferentes factores que intervienen en la diferenciación terminal del esqueleto muscular. El objetivo a largo plazo es entender los mecanismos epigenéticos implicados en la regulación de los genes del músculo esquelético, es decir, las metas. MyoD. socios MyoD se identifican mediante el uso de Tandem Purificación por Afinidad (TAP-Tag) de un sistema heterólogo acoplado a la caracterización Espectrometría de Masas (MS), seguido de la validación del papel de los interlocutores relevantes durante la diferenciación terminal del esqueleto muscular. formas aberrantes de factores miogénicos, o su regulación aberrante, se asocian con una serie de trastornos musculares: miastenia congénita, distrofia miotónica, rabdomiosarcoma y defectos en la regeneración muscular. Como tal, factores miogénicos proporcionan un número de posibles dianas terapéuticas en trastornos musculares, tanto con respecto a los mecanismos que causan la enfermedad en sí y los mecanismos de regeneración que puede mejorar el tratamiento de la enfermedad. Por lo tanto, la understan detalladading de las interacciones intermoleculares y los programas genéticos controlados por los factores miogénicos es esencial para el diseño racional de terapias eficaces.

Para entender la regulación de la actividad MyoD, se realizó la caracterización exhaustiva de los complejos MyoD utilizando purificación bioquímica, basado en la inmunopurificación de una forma de doble etiquetado de MyoD seguido por espectrometría de masas (MS). El uso de la línea celular HeLa-S3 expresar MyoD Bandera de etiquetado-HA y una línea celular de control que expresa permisos Bandera-HA para obtener material suficiente para purificar el complejo MyoD mediante la realización de...

MyoD es un factor de transcripción miogénico con una gran capacidad para inducir la transdiferenciación miogénica de muchas líneas celulares no musculares completamente diferenciadas. Los mecanismos epigenéticos implicados en esta transdiferenciación son en gran parte desconocidos. Aquí describimos un método de purificación de doble afinidad seguido de espectrometría de masas para caracterizar exhaustivamente a los socios de MyoD.

Identificación de MyoD Interactome Usando Tandem Affinity purificación Acoplada a la Espectrometría de Masas

Skeletal muscle terminal differentiation starts with the commitment of pluripotent mesodermal precursor cells to myoblasts. These cells have still the ...

El objetivo general de este experimento es caracterizar exhaustivamente las proteínas asociadas MyoD. Este método puede responder a preguntas clave en el campo de la biología del músculo esquelético, como la regulación molecular de la deformación tonal del músculo esquelético mediante el factor de transcripción muscular clave, MyoD. La principal ventaja de esta técnica es que nos permite desentrañar parejas MyoD que tienen una abundancia electivamente baja, una localizada en un compartimento subnuclear específico.Aunque este método puede proporcionar información sobre la regulación de la diferenciación muscular, también se puede aplicar a otros sistemas, como cualquier otro tejido, específicamente la diferenciación nuclear. La Dra. Lauriane Fritsch, asistente de investigación de nuestro laboratorio, demostrará el procedimiento. En este protocolo, los complejos MyoD se purificarán a partir de células HeLa S3 que expresan MyoD de forma estable con etiquetas de glutenina FLAG.Las células HeLa S3 transducidas con el vector vacío se utilizarán como control. Ambas líneas celulares se cultivaron, recolectaron y almacenaron previamente a menos 80 grados centígrados, como se describe en el texto del protocolo. Rápidamente, descongele los gránulos de la célula en un baño de agua a 37 grados centígrados.Todos los tampones y homogeneizadores deben enfriarse previamente y todo este procedimiento debe realizarse en una cámara frigorífica. Por lo general, se utilizan 20 gramos de células para cada punto experimental, pero para los fines de esta demostración, solo se procesarán 10 gramos, o alrededor de 10 ml de células. Vuelva a suspender las células en 10 mL de tampón hipotónico A, utilizando 5 mL del tampón al principio.Luego, se agregaron 2,5 mL, seguidos de otros 2,5 mL. Lave bien la pipeta con tampón fresco para obtener el máximo de células. Transfiera 20 mL de la suspensión celular al homogeneizador preenfriado con un mortero apretado.Homogeneizar las células con 20 golpes. Transfiera la suspensión de la celda a un tubo de 50 mililitros. Para una recuperación máxima de las células, lavar el homogeneizador con 3,5 mL de tampón de sacarosa.Transfiera esta suspensión rápidamente al tubo de 50 ml para preservar los núcleos y limitar las fugas. Teñir una alícuota de 30 microlitros de la suspensión celular con 30 microlitros de azul de tripano al 4% y analizar bajo el microscopio para determinar la eficiencia de la lisis. Todos los núcleos deben ser azules si la lisis es exitosa.Si es necesario, repita la homogeneización. Centrifugar durante siete minutos a 10.000 x g y cuatro grados centígrados para pellet los núcleos. Guarde el sobrenadante como una fracción citoplasmática.Iniciar el procedimiento de preparación de la fracción extraíble de sal nuclear resuspendiendo el pellet de núcleos en 4 mL de tampón de sacarosa. A continuación, añada 4 mL de tampón con alto contenido de sal gota a gota mientras mezcla bien en un vórtice para obtener una concentración final de 300 mM de cloruro de sodio. Incubar durante 30 minutos en hielo mezclando cada cinco minutos.A continuación, disminuya la concentración de cloruro de sodio a 150 mM agregando 8 mL de tampón de sacarosa. Centrifugar durante 10 minutos a 13.000 x g y cuatro grados centígrados. Recoge el sobrenadante, que es la fracción extraíble de sal, y déjalo en hielo.Para preparar la fracción unida a la cromatina, vuelva a suspender el pellet meticulosamente en 3,5 mL de tampón de sacarosa. Agregue cloruro de calcio hasta una concentración final de 1 mM y mezcle. El cloruro de calcio activará la nucleasa microcócica que se añadirá posteriormente.Precalienta la suspensión durante un minuto a 37 grados centígrados. Añadir 35 microlitros de un caldo de nucleasa microcócica de 5 unidades por microlitro para obtener una concentración final de 25 10 milésimas por microlitro. Incubar durante exactamente 12 minutos a 37 grados centígrados.Mezclar cada cuatro minutos. Después de 12 minutos, coloque inmediatamente la reacción en hielo. Para detener la actividad de la nucleasa microcócica, agregue 56 microlitros de EDTA 5 molares pH 8.0 a una concentración final de 4 mM y vórtice.Incubar durante cinco minutos en hielo. Sonicar cinco veces durante un minuto, cada vez a alta amplitud, permitiendo un descanso de un minuto entre sonicaciones. Centrifugar tanto la sal extraíble como las fracciones enriquecidas con nucleosomas durante 30 minutos a 85.000 x g a cuatro grados centígrados.Recoge los sobrenadantes. La fracción extraíble de sal debe ser de unos 13 mL. Y la fracción enriquecida con nucleasoma debe ser de aproximadamente 6 mL.Los complejos de proteínas MyoD se purificarán mediante purificación de doble afinidad. Dado que los procedimientos para la purificación basada en GALP y en HA son similares, solo se demostrará la purificación basada en GALP. Después de añadir TEGN, transfiera el volumen adecuado de resina FLAG a un tubo de 50 ml.Se necesitan 300 microlitros de resina FLAG de la resina comercial 50%stock prewash FLAG para cada punto experimental. Centrifugar durante dos minutos a 1.000 x g. Retire el sobrenadante, agregue TEGN frío y vuelva a centrifugar.Lava la resina FLAG con TEGN en frío un total de cinco veces. Después del último lavado, vuelva a suspender la resina FLAG en un volumen igual de TEGN. Para cada punto experimental, mezcle 300 microlitros de resina FLAG lavada y el extracto proteico correspondiente.Utilice un tubo de 15 mL para la fracción enriquecida con nucleasoma y un tubo de 50 mL para la fracción extraíble con sal. Incubar los tubos en una rueda giratoria durante la noche a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, centrifugar todos los tubos durante dos minutos a 1.000 x g a cuatro grados centígrados.Recoja los sobrenadantes y manténgalos a cuatro grados centígrados hasta obtener el resultado de la prueba de eficiencia de purificación. Para las muestras extraíbles con sal, vuelva a suspender la resina FLAG en 4 mL de TEGN y transfiérala a un tubo de 15 mL. Repita este paso tres veces, cada vez transfiriendo a los mismos 15 ml para evitar perder perlas.Centrifugar durante dos minutos a 1.000 x g a cuatro grados centígrados. Después de retirar el sobrenadante, añadir 13 mL de TEGN a la resina FLAG y centrifugar durante dos minutos a 1.000 x g a cuatro grados centígrados. Lava la resina siete veces de esta manera.Después del último lavado, vuelve a suspender la resina en 1 mL de TEGN y transfiérela a un tubo de baja fijación de 1,5 mL. Centrifugar durante dos minutos y retirar el sobrenadante. Vuelva a suspender la resina para cada punto experimental en 100 microlitros de solución de péptidos FLAG a 4 mg/mL a pH 7,8 Mezcle bien y agregue 100 microlitros de tampón TEGN.Incubar a cuatro grados centígrados durante al menos cuatro horas para eluir las proteínas unidas. Centrifugar durante dos minutos y transferir la resina y el sobrenadante a una columna de centrifugación vacía colocada en un tubo de 2 mL. Centrifugar la columna durante un minuto a 6.000 x g.Recoja el sobrenadante sobrante en el tubo de 2 mL. A continuación, se prueba la eficiencia de la purificación como se describe en el texto del protocolo, antes de proceder con la purificación basada en HA. Aquí se muestran resultados representativos de complejos MyoD purificados de doble afinidad a partir de fracciones extraíbles con sal nuclear o enriquecidas con nucleasomas de una línea celular HeLa S3 que expresa de manera estable FLAG HA MyoD.La tinción de plata identificó FLAG HA MyoD, indicada por la flecha que está ausente de la línea celular simulada. Los complejos MyoD purificados de doble afinidad se fraccionaron en gradientes de glicerol. La Western blot de las fracciones utilizando anticuerpos anti-FLAG descubrió los subcomplejos MyoD en los dos compartimentos subnucleares.En particular, el MyoD extraíble en sal se distribuye en tres subcomplejos, mientras que el MyoD unido a la cromatina pertenece principalmente a un complejo. El análisis por espectrometría de masas de interactores de MyoD aislados de fracciones nucleares extraíbles con sales nucleares y enriquecidos con nucleosomas identificó una serie de socios conocidos y nuevos socios de MyoD. Aquí, los interactores MyoD que se encuentran en ambas fracciones o, específicamente para una de las fracciones, se agrupan en función de sus anotaciones funcionales.Algunos de los interactianos revelados por espectrometría de masas fueron confirmados por Western blot en complejos MyoD. Estos incluyen los factores de transcripción CBF, la subunidad SWI/SNF BAF47 y las proteínas HP1. Dado que las células HeLa no son células musculares y normalmente no expresan MyoD, es necesario confirmar las interacciones entre los interactores recién identificados y MyoD y los mioblastos.Se utilizaron extractos nucleares totales de mioblastos de ratón en proliferación y diferenciación para la inmunoprecipitación y el análisis occidental con los anticuerpos indicados. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en dos días y medio si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar refinar los resultados obtenidos en los mioblastos.Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el derribo de la pareja particular en el sistema de relevancia, como los mioblastos, para responder a preguntas adicionales como el significado funcional de la interacción. Después de su desarrollo, esta técnica allana el camino para que los investigadores en el campo de la epigenética biológica del desarrollo exploren la red de regulación de cinco factores de transcripción en la mayoría de los sistemas corporales. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo identificar los socios del factor de transcripción mediante la realización de un fraccionamiento celular seguido de una purificación de afinidad en tándem junto con espectrometría de masas.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Tandem purificación de afinidad es un enfoque sólido para la identificación de socios de la unión a proteínas. Como prueba de concepto, esta metodología se aplicó a la traducción factor eIF4E bien caracterizado iniciación a co-precipitado los factores implicados en la célula huésped iniciación de la traducción. Este método se adapta fácilmente a cualquier proteína celular o viral.

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Identificación de MyoD Interactome Usando Tandem Affinity purificación Acoplada a la Espectrometría de Masas

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