Cría de pez cebra y manipulación de embriones

Zebrafish Breeding and Embryo Handling

JoVE Science Education
Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick

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JoVE Science Education Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick

Zebrafish Breeding and Embryo Handling

4.10: Mouse Genotyping

4.15: Zebrafish Microinjection Techniques

57,002 Views

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07:48 min

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April 30, 2023

Overview

Pez cebra (Danio rerio) son un organismo modelo importante que es particularmente valioso para la investigación en Biología del desarrollo. Pez cebra son extremadamente fértil y puede producir cientos de progenie por semana, por lo que es relativamente fácil de recoger un gran número de embriones para los números de muestra alta. Además, pez cebra se someten a un desarrollo rápido y embriones son transparentes, lo que permite fácil visualización de procesos de desarrollo.

Este video cubre los pasos necesarios para la recogida de embriones de pez cebra recién fertilizado. Se presenta una breve descripción del comportamiento de acoplamiento de pez cebra, seguido por las instrucciones para configurar cruces en tanques que permiten para el apareamiento controlado de la cría de laboratorio especializado. También están las condiciones necesarias para iniciar la liberación de óvulos (conocido como desove) la mañana después de ajustan los tanques. Se presentan técnicas siguientes, esenciales para trabajar con embriones, incluyendo la inhibición del desarrollo de pigmento con la PTU química y dechorionation: un procedimiento en el que se retira la membrana de la concha que rodea el embrión (el corion). Por último, el vídeo concluye con algunas aplicaciones prácticas de estas técnicas en la investigación del desarrollo.

Procedure

Pez cebra son un sistema pequeño pero poderoso modelo. Estos peces prolíficos pueden generar cientos de crías a la semana y muchos miles más de sus vidas. Rápido desarrollo externo y cuerpos transparentes hacen los embriones ideal para diversas aplicaciones. Este video cubre los conceptos básicos de colección de embriones y manejo antes de describir los métodos actuales de investigación que se aprovechan de los embriones de pez cebra.

Con el fin de generar embriones, ayuda a saber un poco sobre el comportamiento de acoplamiento de pez cebra.

Pez cebra se someten a reproducción sexual, por lo que requiere de cría peces macho y hembra. Los machos tienen cuerpos más delgados con un color ligeramente rojo, mientras que las hembras tienen el abdomen más grande, de plata lleno de huevos.

Periódicos de acoplamiento mantiene huevos sanos, pero hacer todos esos huevos requiere mucho trabajo, por lo que las hembras individuales deben ser acopladas sólo una vez por semana.

Finalmente, como muchos otros animales, procesos sensoriales guían de comportamiento de acoplamiento en los peces.

Señales olfativas de la ayuda masculina para prepararse a su amiga desovar, aunque un poco de iluminación del humor pone en acción.

Haber aprendido a identificar peces macho y hembra, es hora de configurar una cruz.

Para la cría de pez cebra, los investigadores utilizan tanques específicamente diseñados para el apareamiento. Tanques de cría por lo general cuentan con un accesorio de inserción extraíble con agujeros que permiten que los huevos que caen a través de. Esta función protege los huevos de ser comidos por los peces adultos hambrientos.

Para empezar, combinar peces adultos en tanques de cría durante la tarde o la noche. Para recolectar embriones de etapa temprana la mañana siguiente, separar peces machos y hembras con un separador de ambientes, que les impide la cría antes de que usted esté listo para comenzar un experimento. Para evitar que los peces saltando, asegúrese de cubrir el tanque de cría con una tapa. Luego, dejar el pescado para aclimatar uno al otro durante la noche.

Después de pasar la noche juntos en un tanque de cría, los peces acoplan a la mañana siguiente.

El primer paso en la mañana es eliminar el divisor entre el pez macho y hembra para iniciar el desove. Si no se utiliza un divisor, los peces ponen huevos poco después del inicio ligero.

Como los machos persiguen a las hembras alrededor del tanque, estimula el desove de huevos mientras suelta el esperma en el agua para la fecundación. Espere aproximadamente 15-30 minutos después de tirar un divisor para permitir a los peces a mate. Luego, retire a los adultos el tanque mediante una red o levantando el relleno del tanque y colocar el pescado en otro tanque.

A continuación, vierta el agua y los embriones a través de un colador de té para la colección. Luego, utilizando “agua del huevo”, lavar los embriones fuera del filtro en una placa Petri. Puede ser necesario transferir embriones entre platos para lograr una densidad óptima de 50-100 por plato. Para asegurar el desarrollo procede a un ritmo normal, colocar los platos en una incubadora a 28,5 ° C.

Una vez que tienes tus embriones, Manipúlelos con cuidado. ¡Son importantes para sus experimentos! Repasemos algunos punteros.

Para mantener los embriones sanos, asegúrese de mantener el agua en los platos de petri limpia y libre de escombros. Embriones muertos serán opacos y deben eliminarse diariamente. Además, el azul de metileno puede añadirse al agua para evitar el crecimiento de hongos.

Cualquier momento que usted necesita mover los embriones de un plato a otro, utilice una pipeta de transferencia. Agitando el plato, puede concentrarse los embriones en el centro de la placa, haciendo más fácil pipetear.

Algunos protocolos requieren algunos pasos adicionales para el mantenimiento del embrión. Para los tres primeros días de vida, desarrollan de embriones de pez cebra dentro un corion, que puede impedir la manipulación del embrión. El corion se puede retirar por el tratamiento con la enzima proteolítica, pronasa, o mediante el uso de fórceps para extraer manualmente. Además, el pez cebra empiezan a desarrollar pigmento por 24 horas, como se muestra aquí en esta larva de pez cebra, que puede interferir con la microscopia. Para ver a través de este problema, los científicos complementan el agua de embrión con PTU, que inhibe la producción de la melanina de pigmento.

Ahora que sabes cómo obtener y cuidar embriones de pez cebra, exploremos algunas de las formas que los investigadores utilizan para el descubrimiento científico.

El desarrollo externo de los embriones de pez cebra permite manipulación genética por microinyección de ADN, ARN o reactivos de precipitación del gene. Este método conduce a una distribución uniforme del material inyectado en el embrión y puede producir fenotipos visibles ocasionados por la sobreexpresión o la pérdida de una proteína. La misma técnica puede utilizarse también para hacer peces transgénicos en los que estructuras específicas están marcadas por la expresión de proteínas fluorescentes.

Además, el pequeño tamaño de las larvas y embriones de pez cebra los hacen ideales para la detección fenotípica de química. Aquí, se cargan los embriones en placas de 96 pocillos y luego tratados con bibliotecas de moléculas pequeñas mediante la adición de los productos químicos en el agua. Más tarde, estos platos de pescado son evaluados por defectos morfológicos, tales como el desarrollo anormal que se muestra a continuación.

Por último, la transparencia de los embriones de pez cebra hace muy adecuado para microscopía. Embriones vivos, expresión de proteínas fluorescentes en tipos celulares específicos pueden ser montados y visualizados con microscopía confocal, permitiendo a los investigadores examinar los movimientos de la célula en el desarrollo de los tejidos con el tiempo.

Sólo has visto video de Zeus en pez cebra cría y manipulación de embriones. En este video, hemos analizado los conceptos básicos de acoplamiento, configuración de los tanques de cría y manipulación de embriones. También discutimos algunos métodos de investigación que se aprovechan de este embrión poco potente. ¡Gracias por ver!

Transcript

Zebrafish are a small but powerful model system. These prolific fish can generate hundreds of offspring per week and many thousands over their lifetimes. Rapid external development and transparent bodies make the embryos ideal for diverse applications. This video will cover the basics of embryo collection and handling before describing current research methods that take advantage of zebrafish embryos.

In order to generate embryos, it helps to know a little bit about zebrafish mating behavior.

Zebrafish undergo sexual reproduction, so breeding requires both male and female fish. Males have slimmer bodies with a slightly red hue, while females have bigger, silver bellies full of eggs.

Periodic mating keeps eggs healthy, but making all those eggs takes a lot of work, so individual females should only be mated once per week.

Finally, like many other animals, sensory processes guide mating behavior in fish.

Olfactory cues from the male help to get his lady friend ready to spawn, while a little bit of mood lighting sets them both in action.

Having learned how to identify male and female fish, it’s time to set up a cross.

For zebrafish breeding, researchers use tanks specifically designed for mating. Breeding tanks typically feature a removable insert with holes that allow eggs to fall through. This feature protects the eggs from being eaten by hungry adult fish.

To begin, combine adult fish in breeding tanks during the afternoon or evening. To collect early stage embryos the following morning, separate male and female fish with a divider, which stops them from breeding before you’re ready to begin an experiment. To prevent the fish from jumping out, be sure to cover the breeding tank with a lid. Then, leave the fish to acclimate to each other overnight.

After spending the night together in a breeding tank, the fish will mate the following morning.

The first step in the morning is to remove the divider from between the male and female fish to initiate spawning. If a divider is not used, the fish will lay eggs shortly after light onset.

As the males chase the females around the tank, they stimulate spawning of eggs while releasing sperm into the water for fertilization. Wait approximately 15 – 30 minutes after pulling a divider to give the fish time to mate. Then, remove the adults from the tank by using a net or by lifting the tank insert and placing the fish into another tank.

Next, pour the water and the embryos through a mesh tea strainer for collection. Then, using “egg water,” wash the embryos off the strainer into a petri dish. It may be necessary to transfer embryos between dishes to achieve an optimal density of 50 – 100 per dish. To ensure development proceeds at a normal pace, place the dishes in an incubator at 28.5 °C.

Once you’ve got your embryos, handle them with care. They are important for your experiments! Let’s go over some pointers.

To keep embryos healthy, make sure to keep the water in the petri dishes clean and free of debris. Dead embryos will be opaque and should be removed daily. Additionally, methylene blue can be added to the water to prevent fungal growth.

Any time you need to move embryos from one dish to another, use a transfer pipet. By swirling the dish, you can concentrate the embryos in the center of the plate, making the pipetting easier.

Some protocols require a few additional steps for embryo maintenance. For the first three days of life, zebrafish embryos develop inside of a chorion, which can impede manipulation of the embryo. The chorion can be removed by treatment with the proteolytic enzyme, pronase, or by using forceps to remove it manually. Additionally, zebrafish begin to develop pigment by 24 hours, as shown here in this zebrafish larva, which can interfere with microscopy. To see through this problem, scientists supplement the embryo water with PTU, which inhibits production of the pigment melanin.

Now that you know how to obtain and care for zebrafish embryos, let’s explore some of the ways researchers use them for scientific discovery.

The external development of zebrafish embryos allows for genetic manipulation by microinjection of DNA, RNA, or gene knockdown reagents. This method leads to uniform distribution of injected material throughout the embryo and can produce visible phenotypes resulting from the overexpression or loss of a protein. The same technique can also be used to make transgenic fish in which specific structures are marked by the expression of fluorescent proteins.

Additionally, the small size of zebrafish embryos and larvae make them ideal for phenotypic chemical screening. Here, embryos are loaded into 96-well plates and then treated with libraries of small molecules by adding the chemicals into the water. Later, these plates of fish are screened for morphological defects, such as the abnormal development shown here.

Finally, the transparency of the zebrafish embryos makes them well suited for microscopy. Live embryos expressing fluorescent proteins in specific cell types can be mounted and visualized with confocal microscopy, allowing researchers to examine cell movements in developing tissues over time.

You’ve just watched JoVE’s video on zebrafish breeding and embryo handling. In this video, we’ve discussed the basics of mating, setting up breeding tanks, and embryo handling. We also discussed some research methods that take advantage of this powerful little embryo. Thanks for watching!

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