4.12: Cría de pez cebra y manipulación de embriones

El pez cebra es un sistema modelo pequeño pero poderoso. Estos peces prolíficos pueden generar cientos de crías por semana y muchos miles a lo largo de su vida. El rápido desarrollo externo y los cuerpos transparentes hacen que los embriones sean ideales para diversas aplicaciones. Este video cubrirá los conceptos básicos de la recolección y el manejo de embriones antes de describir los métodos de investigación actuales que aprovechan los embriones de pez cebra.

Para generar embriones, es útil saber un poco sobre el comportamiento de apareamiento del pez cebra.

El pez cebra se somete a la reproducción sexual, por lo que la cría requiere peces machos y hembras. Los machos tienen cuerpos más delgados con un tono ligeramente rojo, mientras que las hembras tienen vientres plateados más grandes llenos de huevos.

El apareamiento periódico mantiene los huevos sanos, pero producir todos esos huevos requiere mucho trabajo, por lo que las hembras individuales solo deben aparearse una vez por semana.

Finalmente, como muchos otros animales, los procesos sensoriales guían el comportamiento de apareamiento en los peces.

Las señales olfativas del macho ayudan a preparar a su amiga para desovar, mientras que un poco de iluminación ambiental los pone a ambos en acción.

Habiendo aprendido a identificar peces machos y hembras, es hora de establecer un cruce.

Para la cría de peces cebra, los investigadores utilizan tanques diseñados específicamente para el apareamiento. Los tanques de cría suelen contar con un inserto extraíble con agujeros que permiten que los huevos caigan a través de ellos. Esta característica protege los huevos de ser comidos por peces adultos hambrientos.

Para comenzar, combine los peces adultos en tanques de cría durante la tarde o la noche. Para recolectar embriones en etapa temprana a la mañana siguiente, separe los peces machos y hembras con un divisor, lo que evita que se reproduzcan antes de que esté listo para comenzar un experimento. Para evitar que los peces salten, asegúrese de cubrir el tanque de cría con una tapa. Luego, deje que los peces se aclimaten entre sí durante la noche.

Después de pasar la noche juntos en un tanque de cría, los peces se aparearán a la mañana siguiente.

El primer paso por la mañana es quitar el divisor entre el pez macho y la hembra para iniciar el desove. Si no se utiliza un divisor, los peces pondrán huevos poco después del inicio de la luz.

A medida que los machos persiguen a las hembras alrededor del tanque, estimulan el desove de los huevos mientras liberan esperma en el agua para la fertilización. Espere aproximadamente de 15 a 30 minutos después de tirar de un divisor para que los peces tengan tiempo de aparearse. Luego, retire a los adultos del tanque usando una red o levantando el inserto del tanque y colocando los peces en otro tanque.

A continuación, vierta el agua y los embriones a través de un colador de té de malla para su recolección. Luego, usando ?agua de huevo,? Lava los embriones del colador y colócalos en una placa de Petri. Puede ser necesario transferir embriones entre placas para lograr una densidad óptima de 50 a 100 por placa. Para asegurar que el desarrollo avance a un ritmo normal, coloque las placas en una incubadora a 28.5 ?C.

Una vez que tenga sus embriones, manéjelos con cuidado. ¡Son importantes para tus experimentos! Repasemos algunos consejos.

Para mantener los embriones sanos, asegúrate de mantener el agua de las placas de Petri limpia y libre de residuos. Los embriones muertos serán opacos y deben extraerse a diario. Además, se puede agregar azul de metileno al agua para prevenir el crecimiento de hongos.

Cada vez que necesites mover embriones de una placa a otra, utiliza una pipeta de transferencia. Al girar el plato, puede concentrar los embriones en el centro del plato, lo que facilita el pipeteo.

Algunos protocolos requieren algunos pasos adicionales para el mantenimiento del embrión. Durante los primeros tres días de vida, los embriones de pez cebra se desarrollan dentro de un corion, lo que puede impedir la manipulación del embrión. El corion se puede extirpar mediante tratamiento con la enzima proteolítica, pronasa, o mediante el uso de fórceps para extirparlo manualmente. Además, el pez cebra comienza a desarrollar pigmento a las 24 horas, como se muestra aquí en esta larva de pez cebra, que puede interferir con la microscopía. Para superar este problema, los científicos complementan el agua del embrión con PTU, que inhibe la producción del pigmento melanina.

Ahora que sabe cómo obtener y cuidar los embriones de pez cebra, exploremos algunas de las formas en que los investigadores los usan para el descubrimiento científico.

El desarrollo externo de los embriones de pez cebra permite la manipulación genética mediante microinyección de ADN, ARN o reactivos de eliminación de genes. Este método conduce a una distribución uniforme del material inyectado en todo el embrión y puede producir fenotipos visibles como resultado de la sobreexpresión o pérdida de una proteína. La misma técnica también se puede utilizar para hacer peces transgénicos en los que estructuras específicas están marcadas por la expresión de proteínas fluorescentes.

Además, el pequeño tamaño de los embriones y larvas de pez cebra los hace ideales para el cribado químico fenotípico. Aquí, los embriones se cargan en placas de 96 pocillos y luego se tratan con bibliotecas de moléculas pequeñas agregando los productos químicos al agua. Más tarde, estas placas de peces se examinan para detectar defectos morfológicos, como el desarrollo anormal que se muestra aquí.

Por último, la transparencia de los embriones de pez cebra los hace muy adecuados para la microscopía. Los embriones vivos que expresan proteínas fluorescentes en tipos específicos de células se pueden montar y visualizar con microscopía confocal, lo que permite a los investigadores examinar los movimientos celulares en los tejidos en desarrollo a lo largo del tiempo.

Acabas de ver el video de JoVE sobre la cría y el manejo de embriones de pez cebra. En este video, hemos discutido los conceptos básicos del apareamiento, la configuración de tanques de reproducción y el manejo de embriones. También discutimos algunos métodos de investigación que aprovechan este pequeño y poderoso embrión. ¡Gracias por mirar!