Comportamiento Fenotipificación de modelos murinos de enfermedades con la Estación Integrada Comportamiento (InBest)

El objetivo general de esta metodología es mejorar la reproducibilidad y la estandarización del fenotipado conductual y los ratones experimentales mediante el monitoreo continuo de las medidas básicas de comportamiento en un entorno familiar. Este sistema modular está compuesto por una rueda de correr computarizada de malla de escalada digitalizada, un dispensador de alimentos automatizado, dos TER controlados por fotocélulas, un estímulo luminoso controlado por computadora y un refugio, componentes de terceros y cuatro paquetes de software MPEG infrarrojos integrados con seguimiento de video y grabación de eventos Los paquetes de software están interconectados para crear ocho arenas, lo que permite el monitoreo simultáneo de cuatro animales experimentales y cuatro de control. Las latencias, frecuencias y duraciones de comportamientos específicos se analizan utilizando el software MED PC four.

Mientras que la actividad locomotora y la topografía de las trayectorias de movimiento se evalúan con el software ETH ovision XT 8.5 utilizando un análisis estadístico completo. Los datos a menudo se procesaban para revelar cambios de comportamiento inducidos por la progresión de la enfermedad en diversos modelos de ratón. La naturaleza compleja y sensible del comportamiento a menudo hace que las mediciones confiables en ratones con enfermedades crónicas sean muy difíciles.

Utilizar nuevas tecnologías que permitan un análisis preciso e imparcial del comportamiento. Describimos un sistema de monitoreo hecho a medida llamado Inves o Estación Integrada de Comportamiento. Este aparato está diseñado para proporcionar mediciones prolongadas de productos funcionales básicos, como la actividad espontánea, la ingesta de alimentos y agua, la reactividad emocional, el comportamiento motivado, todo en un entorno doméstico de bajo estrés.

Las principales ventajas de la inversión sobre las pruebas de comportamiento individuales incluyen el monitoreo continuo, la reducción del estrés del transporte y la recopilación rápida de múltiples conjuntos de datos que se alimentan instantáneamente para un análisis computarizado imparcial. Aunque el monitoreo continuo aborda los factores de confusión comunes en los estudios tradicionales, es importante tener en cuenta que algunos dominios del comportamiento, como la función neurológica y el aprendizaje espacial, no se pueden estudiar en el entorno de la jaula doméstica, por lo que se requieren pruebas adicionales. Para completar la evaluación del perfil conductual, una o dos semanas antes del inicio del experimento, Comienza a habituar a los ratones a un ciclo de 12 a 12 luces a sombras. Los ratones son más activos durante la noche.

Establezca el período de tiempo del ciclo oscuro para que sea paralelo a las horas de trabajo del experimentador. Todos los demás factores ambientales, como la temperatura y la ventilación, deben permanecer constantes durante este período. Para la identificación numérica permanente, tatúe la cola de los ratones durante cinco a siete días antes de la prueba.

Manipula regularmente a los ratones hasta dos horas al día, habituándolos así a la medida de estrés y registra el peso corporal, la temperatura rectal y toma notas de su aspecto general. Excluya del estudio a los ratones que muestren anomalías graves, como bajo consumo de alimentos o agua, pérdida de peso corporal, una postura encorvada, hidrocefalia de pelaje arrugada o manchada, o que muestren secreción de porfirina alrededor de los ojos. Además, se puede realizar una amplia variedad de pruebas de comportamiento, como el campo abierto, durante este período de tiempo, lo que permite una comprensión más completa de los déficits de rendimiento.

Para un estudio de comportamiento prolongado, el dispensador de alimentos debe tener un suministro completo de gránulos de comida para ratones. Cada uno con un peso de 20 miligramos. Una botella siempre debe estar llena con agua fresca del grifo.

En una prueba de preferencia, una segunda botella puede proporcionar una solución alternativa de interés, como una que contenga azúcar. Pesa los frascos para estimar el volumen consumido entre sesiones. Para medir la latencia y la frecuencia de los episodios de bebida, las boquillas de las botellas deben estar conectadas a los TER.

Un sensor de infrarrojos detecta el lamido, así que asegúrese de que el sensor no esté bloqueado por la boquilla de la boquilla. Si es así, cambie la longitud de la boquilla para que quepa dentro de la jaula. Se debe colocar un refugio en una esquina distal de la rueda de carrera.

Para el seguimiento de vídeo, es necesario que la habitación esté iluminada con una luz difusa tenue que no se refleje en el suelo o las paredes interiores. Una vez que la iluminación se configura correctamente, el campo de pruebas se puede digitalizar para el software de pruebas. Para esta demostración, se utiliza el paquete de software ETH Ovision XT 8.5 para configurar la arena.

Comience abriendo un proyecto de seguimiento predeterminado e ingresando la configuración experimental. A continuación, elija la fuente de vídeo, en este caso el piccolo diligent grabber. Establece el número de arenas de seguimiento en cuatro.

Elija el centro de la nariz y la cola para los puntos de seguimiento y seleccione las unidades de medida Siguiente de la lista de prueba. En el menú de configuración, defina el número de pruebas haciendo clic en el botón Agregar pruebas. A continuación, active la opción de añadir variable para especificar variables independientes como el ID del ratón, el grupo de género, la asignación y la tensión.

Ahora capture una imagen de fondo de la arena haciendo clic en la pestaña de configuración de la arena y definiendo el perímetro de la arena usando las herramientas de dibujo disponibles después de definir la arena, use la opción agregar zona para delinear zonas de interés como el piso, los TER, el dispensador de alimentos, etc. A continuación, añada zonas en las que no se pueda ver el ratón mediante la opción añadir grupo de zonas ocultas. Esto incluiría el refugio y la rueda para correr.

Cada zona oculta también debe tener un punto de entrada y salida especificado. Después de definir el perímetro y las zonas de cada arena, realice pruebas de calibración utilizando la opción de calibración en el software. Utilice la herramienta de acceso a la escala para determinar la anchura y la longitud de cada arena.

A continuación, valide la configuración de cada arena con el botón de validación y proceda a configurar los parámetros de prueba y recopilar datos. Para adquirir datos, los parámetros de adquisición deben establecerse primero en el programa. Comience accediendo a la pestaña de configuración de control de prueba y especificando los períodos de tiempo para el conjunto de prueba.

La condición de inicio para comenzar cuando la duración del punto central supera un segundo en la arena, la duración de la prueba se establece expandiendo el cuadro de condición de parada y configurando la prueba para que finalice después de un retraso preestablecido, como 10 horas, ahora seleccione una opción del método de detección en la pestaña de configuración de detección. A continuación, tome la imagen de referencia de la arena vacía usando el botón de configuración y seleccionando Agarrar corriente mientras aún está en el módulo de detección, ajuste el rango de contraste para los puntos de detección de la nariz central y la cola. Establezca el rango para que sea continuo.

A continuación, indique que el ratón es más brillante o más oscuro que el fondo. Ahora ajuste la configuración del tamaño del sujeto, que se basa en el campo de visión de la cámara. A continuación, si es necesario, ajuste los fotogramas por segundo de análisis en función de lo que sea capaz de hacer el equipo.

Procesamiento de 14,9 fotogramas. El segundo suele ser suficiente. Cuando se hayan realizado todos los cambios en las opciones del módulo de detección, asegúrese de guardarlos antes de proceder a medir la latencia, la frecuencia y la duración de los actos de comportamiento.

Se utiliza una rutina personalizada en MED PC four para la entrada paso a paso de los parámetros de la sesión, como la identificación del ratón, la duración de la prueba, los combates de la rueda de carrera, etc. Cuando todos estos parámetros hayan sido ingresados y todo el equipo de prueba haya sido encendido, proceda colocando el mouse en la arena. Luego, sincronice los paquetes de seguimiento de eventos y video presionando simultáneamente los botones de grabación y salga silenciosamente de la habitación más tarde cuando expire el período de grabación, devuelva los ratones a sus jaulas domésticas, mida el peso de las botellas y guarde todos los datos grabados en medios digitales.

Los datos sin procesar se pueden enviar a una hoja de cálculo para su análisis, y los archivos de video sin procesar se pueden calificar para comportamientos poco frecuentes, como estereotipos o convulsiones. Se realizó un estudio prolongado con ratones CD uno utilizando el mejor de los casos durante varios días antes de la cirugía. Se recopilaron datos basales, seguidos de datos postoperatorios que incluyen la administración sostenida intraceloventricular de anticuerpos reactivos cerebrales.

A partir del quinto día, los grupos experimentales mostraron varios deterioros, incluida la reducción del lamido de las botellas de agua. También mostraron un aumento de la latencia para acercarse a los biberones con solución de sucralosa, y mostraron una disminución del consumo de alimentos. Coincidiendo con estos cambios, los ratones a los que se les administraron anticuerpos reactivos cerebrales también mostraron una disminución de la actividad de la rueda de carrera en comparación con los ratones de control, la deambulación medida por el software de seguimiento de video también disminuyó.

En el grupo experimental, los ratones tratados prefirieron pasar tiempo en los refugios. Con estos datos, se construyó un rogram simple para ilustrar estas diferencias de comportamiento. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo configurar un aparato de monitoreo personalizado para un análisis de comportamiento imparcial.

En un entorno similar al hogar, el fenotipado automatizado de jaulas en el hogar proporciona una gran cantidad de información que permite una evaluación más precisa de la cinética de inicio y la gravedad de la enfermedad Los déficits conductuales inducidos relacionados con el comportamiento motivado por la locomoción espontánea y la reactividad emocional al minimizar los problemas relacionados con entornos ambientales inconsistentes, el transporte, el estrés y los aparatos de manejo repetidos como inves pueden mejorar significativamente la consistencia y la precisión de los resultados conductuales a través de estudios separados.