Name: La extracción del veneno y veneno glándula microdisecciones de arañas de Proteómica y análisis Transcriptomic (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Aprende a extraer veneno de arañas mediante estimulación eléctrica y microdiseccionar glándulas venenosas para estudios proteómicos y transcriptómicos. Este protocolo sistemático permite analizar la composición del veneno y la expresión génica.

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Doy las gracias a las siguientes personas por su ayuda en el desarrollo de este protocolo: Chuck Kristensen, Greta Binford, Alex K. Lancaster, Konrad Zinsmaier, y Mays Imad. Datos de espectrometría de masas y proteómica fueron adquiridas por el Consorcio de Proteómica de Arizona con el apoyo de NIEHS subvención ES06694 al SWEHSC, NIH / NCI subvención CA023074 al AZCC y por el Instituto BIO5 de la Universidad de Arizona. La financiación de este trabajo fue proporcionado por los Institutos Nacionales de la Salud (Instituto Nacional de Medicina General) de las subvenciones 1F32GM83661-01 y 1R15GM097714-01 a Jessica E. Garb.

1. Preparación del aparato electro-estimulador <ol><li> Conecte el cable de alimentación electro-estimulador a la salida y adjuntar pedal externo para la entrada de señal externa. Nota: Los cables eléctricos deben estar aislados correctamente y metal expuesto actual entrega no se deben tocar. Use guantes de látex o nitrilo para la protección. Interruptor de energía electro-estimulador debe estar en la posición OFF al conectar el cable de alimentación y fijar los cables. </li><li> Conecte el electrodo positivo al terminal de salida de rojo en electro-estimulador (cuando el interruptor de polaridad está en modo normal) y conectar el electrodo negativo al terminal de salida negro. Nota: Cada alambre electrodo debe terminar en una pinza. </li><li> Establecer estimulador para los siguientes ajustes iniciales recomendados: Tensión = 7 V, Frecuencia = 1 pulsos por segundo, retardo = 0 milisegundos, duración = 200 milisegundos, pulsos individuales cambian = regular, y el interruptor de modo = apagado. </li><li> Prueba de salida de electrodos adjuntando pinzas de cocodrilo a voltmeter cables de prueba positivos y negativos. Encienda el interruptor de alimentación estimulador y suministrar corriente con pedal de pie. </li></ol> 2. Preparación de inmovilizar fórceps y Otros Materiales <ol><li> Sumerja una punta de pinzas de peso pluma en revestimiento de plástico líquido y esperar cuatro horas para dejar secar recubrimiento. Envuelva bien 15 mm de la punta de la púa de oposición con una sola capa de hilo de coser de algodón, y asegurar el hilo de atar el extremo de un nudo. Nota: El hilo se utiliza para absorber una solución salina aplicada que promueve la conductividad eléctrica, mientras que el revestimiento de plástico proporciona aislamiento para retardar actual. </li><li> Cortar la punta de la aguja hipodérmica roma con tijeras afiladas y suavizar la apertura con papel de lija. Coloque la aguja a una trampa de residuos de vacío (por ejemplo, matraz de filtración al vacío) a través de la tubería. Nota: La aguja de distancia succionar agua y regurgitar, y servirá para completar el circuito creado por los electrodos del estimulador. El mu abertura de la agujast ser lo suficientemente pequeño para no perjudicar la araña, pero lo suficientemente grande como para solución de vacío sin la obstrucción (por ejemplo, 25 G x 1 ½ en calibre, ver Lista de Materiales). </li><li> Fórceps Posición de peso pluma horizontalmente en una posición bien cerrado utilizando una pinza de doble vertiente cubierto de vinilo asegurada a una base magnética o un aparato de soporte fijado en el campo de un microscopio de disección de vista, con plástico recubierto puntas de unas pinzas en la parte superior y el hilo recubiertos púa en la parte inferior. Nota: La abrazadera de dos puntas se mantiene en una posición estacionaria a la base magnética por un soporte de abrazadera (ver Lista de Materiales). Una banda de goma puede ser fijado firmemente alrededor puntas de las pinzas de peso pluma, al lado del soporte de pinzas, para añadir presión adicional para mantener las pinzas de peso pluma en una posición cerrada alrededor de la araña una vez introducido. </li><li> Adjuntar pinza electrodo positivo a punta inferior fórceps &#39;aguas arriba de la rosca y adjuntar pinza negativa a despuntar la aguja de vacío de metal. </li&gt; <li> Circuito de prueba actual con voltímetro colocando el cable positivo en fórceps púa entre hilo y pinza y colocar el cable negativo en la aguja de vacío embotado. Presione el pedal para asegurar que se detecte suficiente corriente y retire los cables si se detecta corriente suficiente. </li><li> Prepare varios tubos microcapilares para la recolección de veneno. Sostenga un solo tubo microcapilar en un extremo con una mano enguantada y en el otro extremo con una pinza de metal estériles, colocando el extremo fórceps en posición horizontal sobre una llama de mechero Bunsen. Tire del microcapillary con las pinzas de metal lejos de la llama para crear una punta alargada, mientras mantiene el otro extremo en una posición estacionaria. Nota: usar gafas de protección como microcapilares pueden fracturarse fácilmente. </li><li> Descanse microcapilares preparados en una tira de masilla de montaje en una placa de Petri. Examinar microcapillary termina bajo un microscopio de disección y crear un pequeño, la apertura biselada en el extremo desmenuzado con pinzas de metal esterilizados. </li><li> Label número variable de tubos estériles de 0,5 ml. Añadir agua desionizada estéril a tubos estériles (por ejemplo, 5 l de agua desionizada en autoclave). Cerrar los tubos y colocar tubos en el hielo. </li><li> Preparar la solución salina en un vaso de precipitados y llenar un segundo vaso de precipitados con agua tratada en autoclave. </li></ol> 3. Inmovilización de la araña en el fórceps <ol><li> A su vez en CO 2 tanque y transferir araña de plástico recoger vial cerrado (ver Lista de Materiales) en CO 2 cámara utilizando pinzas metálicas largas. Nota: las arañas viuda negra tienen veneno peligroso; Siempre use guantes durante este protocolo. </li><li> Mantenga araña en la cámara durante 5-10 minutos o hasta que anestesiado y ya no se mueve cuando pinchó suavemente con unas pinzas largas. Use la pipeta de transferencia para mojar hilo en pinzas con solución salina. Nota: Para obtener instrucciones sobre el CO 2 parámetros de anestesia para las viudas negras, consulte Spagna y Moore 19. </li><li> Recuperar araña anestesiado de CO 2cámara por recogerlo por sus patas anteriores utilizando pinzas de disección roma y las manos enguantadas. Mueva araña anestesiado a peso pluma aparato fórceps. Puntas separadas de fórceps de peso pluma cerrados y lugar cefalotórax de la araña en entre los dientes y permitir que los dientes se cierren cerrada para garantizar la araña se mantiene firmemente en su lugar, pero no está siendo aplastado. Asegúrese de que la araña se coloca lado dorso del caparazón hacia abajo (ver Foelix 20 de guía a la anatomía de la araña), que descansa sobre hilo recubierto de púa, y parte ventral del caparazón de cara al revestimiento de plástico, mientras que el electrodo positivo permanece unido a la punta inferior. Trabaje con rapidez al manipular araña. </li><li> Ajuste la disección de magnificación del microscopio, el enfoque, y la fuente de luz hasta quelíceros de la araña y colmillos son claramente visibles. </li></ol> 4. Veneno Colección <ol><li> Encienda el vacío y spray quelíceros araña con una solución de agua con una segunda punta roma de la jeringa nEedle. Succionar el agua con la aguja de vacío para eliminar las impurezas. </li><li> Toque la aguja de vacío con electrodo negativo unido a tribuna araña y entregar impulsos con pedal de pie una o más veces. Vacío regurgitar de inmediato si es necesario. Nota: tribuna araña se encuentra dentro de la boca posterior a queliceras en la superficie dorsal entre quelíceros y enditos (ver Foelix 20 para la anatomía detallada de araña). Nota: Con cada impulso, el contrato de las piernas de la araña, y el veneno será visible en forma de gotas claras que salen de los colmillos. </li><li> Recoger las gotitas de veneno con punta microcapilar y punta capilar de transferencia en el tubo de 0.5 ml con agua o solución tampón (solución será absorbido por capilaridad). Nota: evitar perforar araña con capilar que puede conducir a la contaminación de la hemolinfa y la muerte. También evitar la contaminación de los capilares con seda y cola de hileras. </li><li> Adjuntar transferencia jeringa con adaptador de tubo para microcapilar (en el extremo opuesto a la punta de la colección) y dsolución de veneno ispense de nuevo en el tubo. Ponga el tubo en hielo. Nota: Deshágase de los capilares de residuos en un contenedor de objetos punzantes cerca. </li><li> Coloque plástico recoger abierto el vial, junto con su tapa, cerca de la araña. Sujete cuidadosamente las patas de araña con pinzas de disección roma a cabo en una mano y pluma cuidadosamente abierta fórceps dientes con la otra mano, araña cayendo en la recogida de vial con unas pinzas romas y rápidamente cierre la tapa. Continuar con los tubos que contienen veneno de araña-siguiente y almacenar en -80 ° C congelador cuando haya terminado. Nota: seguir ejerciendo cuidado al mover la araña de las pinzas de nuevo en el vial. Asegúrese de que el vial colector y la tapa es cercana a la araña para su rápida transferencia y usan guantes. </li></ol> 5. Veneno Glándula disecciones <ol><li> De dos a tres días después de la recolección de veneno, anestesiar araña en CO 2 cámara (consulte el paso 3.1). Rellene portador de nitrógeno líquido y el lugar junto al microscopio de disección. Nota: WHen trabajar con nitrógeno líquido, protección ocular y guantes de uso criogénicos. </li><li> Área de disección limpia y pinzas de disección con una solución que elimina RNasa y ADN contaminación. Llene una pequeña placa de Petri puesto bajo microscopio de disección con la disección de tampón (por ejemplo, citrato salino-sódico 1x (SSC) de amortiguación). </li><li> Araña de transferencia de CO 2 cámara de placa de Petri y el uso de fórceps para separar rápidamente el cefalotórax del abdomen. </li><li> Mantenga el cefalotórax bajo el microscopio de disección con una pinza y la posición de los quelíceros en el campo de vista. Utilice los afilados extremos de un segundo par de pinzas para cortar la cutícula de unirse a la caparazón de las caras laterales de los quelíceros. Lateralmente captar los quelíceros utilizando el segundo par de pinzas, y tirar suavemente hacia atrás y hacia delante hasta que las glándulas de veneno se sacan. </li><li> Glándulas separadas de los quelíceros (o salir unidos a queliceras si se desea) y la transferencia a un tubo de 0,5 ml cyrosafe. Coloque closed tubo en nitrógeno líquido. Nota: cada disección no debe tardar más de 15 min. </li><li> Repita la disección con arañas adicionales hasta que termine. Tubos de transferencia de nitrógeno líquido en -80 ° C congelador. </li></ol>

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</ol>

El autor no tiene nada que revelar y no los intereses financieros de la competencia.

Venenos representan una importante fuente de proteínas fisiológicamente reactivos, péptidos y otras moléculas con aplicaciones para el descubrimiento de fármacos, así como para los aspectos fundamentales de la investigación celular y ecológica 1-3. Sin embargo, la colección de veneno, en particular de animales peligrosos o pequeños, es una tarea difícil. Este protocolo se muestra cómo glándulas de veneno y veneno se pueden recoger de las arañas viuda negra, y confirma el éxito de este enfoque a través de una combinación de análisis MudPIT del veneno y una base de datos proteína derivada de ADNc clonado a partir de veneno de las glándulas 21. Si bien este protocolo funciona bien para las viudas negras y arañas de tamaño medio, otras técnicas de recolección de veneno se han empleado para ampliar mygalomorph arañas (tarántulas-similares), como la aspiración directa de veneno de los colmillos en vidrio pipetas por ejemplo, 24. Este último enfoque, sin embargo , no va a funcionar bien para las arañas de menor tamaño que no se aggressicinco. Un aspecto especialmente crítico de la protocolo de recogida de veneno descrito aquí es las fases iniciales de preparación y optimización del proceso de recogida de manera que se hace más de rutina, consistente y más rápida. El protocolo es un principio difícil de dominar, pero con pruebas repetidas, se hace más fácil y más rápido. También se instó a la precaución en todas las fases críticas que involucran el manejo de arañas peligrosas, el uso de corriente eléctrica, de punta fina de cristal micro capilares, y agujas de jeringas. Es importante usar el equipo de protección personal adecuado, como guantes de nitrilo, una bata de laboratorio, pantalones largos y zapatos cerrados, así como gafas de protección al dar forma a los micro capilares. Otro aspecto difícil de colección veneno es la pequeña cantidad de veneno producido por cualquiera de araña, particularmente especies de Latrodectus, de la cual las cantidades recogidas pueden ser limited a 1-2 microlitros por individuo en el mejor. La obtención de suficiente veneno para las aplicaciones posteriores, tales como geles de proteínas o ensayos funcionales puede requerir la combinación de veneno de varias personas en un solo tubo. En tales casos, el veneno sólo se debe combinar de individuos del mismo sexo, el estadio ontogénico, y la población recibió el reconocimiento de la variabilidad intersexual, de desarrollo y geográfica en algunos venenos de 25, 26. Las arañas también pueden presentar una variación considerable en la cantidad de veneno producido entre los individuos, en las cantidades menores siempre son representativas de la reciente destrucción de la glándula. Por lo tanto, puede ser aconsejable para recoger veneno de varios días después de su última alimentación. Si se libera poco veneno, exceso de corriente no debe aplicarse a la araña, que puede causar la cutícula se rompa, lo que conduce a la contaminación del veneno con hemolinfa o la muerte. La contaminación de las muestras de veneno de araña con SIfuentes lk o humanos también deben ser evitados a través del uso de material estéril o limpia. A pesar de estos desafíos, colección de veneno puro, dejando la araña viva, es preferible a los métodos que se obtienen a partir de homogeneizados de la glándula de veneno (que no se separan los componentes del veneno de otras proteínas celulares) y matan a la araña. También es fundamental para garantizar que las muestras se congelan rápidamente para evitar la degradación de proteínas. La extracción de veneno promueve la producción de veneno posterior, estimulando así la expresión génica en el veneno de la glándula de veneno. Por lo tanto, debido a este protocolo permite arañas para sobrevivir el agotamiento de veneno, sus glándulas pueden ser disecado varios días más tarde (matar la araña) en un punto donde se espera que la expresión de genes veneno para ser suficiente para los estudios genéticos, tales como la clonación de transcripción 10,11. Varios importantes precauciones también deben tenerse en disecciones de la glándula de veneno. Se debe hacer hincapié en el uso de equipm laboratorioent y reactivos que están libres de RNasas que degradan el ARN. Por lo tanto, se recomienda limpiar fórceps y otros equipos no desechables y superficies con soluciones que eliminan RNasa y ADN contaminación. Las disecciones deben realizarse lo más rápidamente posible y directamente congelado para garantizar aún más la integridad del ARN del tejido. Por último, las disecciones no se debe efectuar en arañas anestesiados, después de su cefalotórax y el abdomen se separan rápidamente. En conclusión, este artículo proporciona un protocolo verificada obtener glándulas de veneno de araña y veneno. Glándulas de veneno y veneno permiten el aislamiento y la caracterización de sus componentes de proteínas y péptidos utilizando enfoques proteómicos y transcriptomic. Además, las muestras de veneno pueden representar el punto de partida de ensayos funcionales, que determinan el potencial biomédico y farmacológico de sus moléculas constituyentes. Casi todas las arañas producen veneno, y la amplia buceadorsidad de componentes del veneno sintetizados por especies individuales sugiere una gran diversidad de moléculas del veneno están aún por descubrir 13. En consecuencia, este protocolo proporciona herramientas para investigar la fuente rica de moléculas biológicamente activas presentes en los venenos de araña.

Venenos son secreciones animales predominantemente inyectados en otro animal a los efectos de la depredación o la defensa, y también tienen importantes aplicaciones biológicas con relevancia biomédica 1-3. Sólo ciertos animales sintetizan veneno, pero su producción es taxonómicamente generalizada en invertebrados (por ejemplo, los cnidarios, caracoles cono, escorpiones y arañas) y vertebrados (por ejemplo, serpientes, algunos peces y mamíferos), debido a que ha evolucionado independientemente varias veces 1,4 . La caracterización bioquímica de los venenos muestran típicamente se componen de una amplia variedad de proteínas y péptidos, que actúan en gran medida de los sistemas circulatorio y nervioso de los animales inyectados para entregar rápidamente toxinas constituyentes 1. Una pequeña fracción de los animales venenosos puede representar una amenaza para los seres humanos, en particular las especies con distribuciones sinantrópicas 5. El estudio de la composición del veneno y las actividades funcionales ha jugado un papel importante enla caracterización funcional de los componentes celulares de vertebrados (en particular los canales iónicos neuronales) 6 y en la elucidación de los procesos celulares fundamentales (por ejemplo neurosecreción 7). Por otra parte, seleccione péptidos del veneno tienen propiedades útiles en contextos biomédicos, incluyendo sus usos como tratamientos para el cáncer y el dolor 8,9, y se extraen para los plomos de drogas candidatos y el desarrollo de antiveneno. Venenos también jugar un papel destacado en la investigación ecológica y evolutiva 1,4,10,11, por tanto, la colección de estas secreciones peligrosos tiene muchas utilidades. Hay&gt; 40.000 especies descritas de araña (orden Araneae), y todos menos uno de los más de 100 familias de arañas poseen pares de glándulas de veneno que terminan en 12 colmillos. La alta diversidad de especies de arañas sugiere que representan el mayor clado de organismos venenosos. Sin embargo, la caracterización bioquímica de venenos de araña tiene largely concentrado en un pequeño número de especies más frecuentemente asociados con envenenamiento humano. Recientes estudios de proteómica y transcriptómica de venenos de araña indican por lo general contienen muchas proteínas y péptidos 2,13,14 únicas. Los avances en alto rendimiento de secuenciación de ADNc y la espectrometría de masas de huellas dactilares péptido ha facilitado en gran medida el descubrimiento de estas proteínas de veneno de 15. Sin embargo, este trabajo comienza con la recolección de veneno suficiente y / o glándulas de veneno de las arañas, y la documentación detallada de estas técnicas son pocos 16. En este trabajo se presenta un protocolo para la recolección de veneno y veneno de las glándulas de arañas viuda negra, que se puede aplicar a las arañas de tamaño similar. La colección de veneno por separado de las glándulas permite la identificación de proteínas que se secretan en el veneno en oposición a las proteínas que realizan otras funciones celulares. Las viudas negras y otra Latrodectus especies son ampliamente reconocidos entre las arañas más peligrosas debido a su veneno altamente neurotóxico, lo que provoca dolor severo en los seres humanos, que a veces se acompaña de sudoración profusa, contracciones musculares, hipertensión, dificultad para respirar y parálisis desigual 5. El protocolo de recogida de veneno que aquí se presenta utiliza electro-estimulación para suministrar corriente eléctrica a las arañas anestesiados para provocar contracciones musculares y la liberación de veneno. Gotitas de veneno se recogen rápidamente con micro-capilares y se dispensan en tubos para almacenamiento en el congelador. Debido a que el protocolo implica procedimientos peligrosos, sólo debe ser realizado por individuos bien entrenados y se instó a la precaución en pasos clave. El veneno de recogida tiene numerosos usos, como la caracterización y aislamiento de moléculas constituyentes 2, para experimentos o ensayos fisiológicos funcionales 18, y para estimular el veneno de la expresión del gen 11. El protocolo concluye con una description de la disección glándula de veneno y la preservación útil para la clonación de genes-veneno específica, la expresión de los que se ha demostrado que se producen 2-3 días siguientes agotamiento de veneno de arañas en diferentes 10,11.

<table><tbody><tr><td>Estimulador nervioso y muscular (electroestimulador)&nbsp;</td><td>Grass Technologies</td><td>SD9</td><td></td></tr><tr><td>http://www.grasstechnologies.com/products/stimulators/stimsd9.html Voltímetro</td><td>RadioShack</td><td>22-223</td><td>cualquier voltímetro/multímetro genérico puede ser sustituido</td></tr><tr><td>Pinzas de peso pluma puntiagudas</td><td>Bioquip</td><td>4748</td><td></td></tr><tr><td>Plasti Dip</td><td>Performix</td><td></td><td>Disponible en Ace Hardware</td></tr><tr><td>25 G x 1&#189; en Precision Glide aguja de jeringa hipodérmica</td><td>BD Medical</td><td>305127</td><td></td></tr><tr><td>Matraz con filtro de vacío 1 L</td><td>Nalgene</td><td>DS4101-1000</td><td>Los tamaños de matraz más pequeños también pueden funcionar</td></tr><tr><td>Embudo Buchner de dos piezas, 90 mm</td><td>Nalgene</td><td>4280-0900</td><td></td></tr><tr><td>5 &#956; l Agujeros capilares (microcapilares)</td><td>VWR</td><td>53508-375</td><td></td></tr><tr><td>Tira de masilla de montaje&nbsp;</td><td>Loctite</td><td></td><td>disponible en Ace Hardware</td></tr><tr><td>Fisherbrand Pinzas extralargas de uso general Longitud: 11-13/16 pulg.</td><td>Tampón</td> SSC <td>10-316C</td><td></td></tr><tr><td>de Fisher, 20x (pH 7,0), grado molecular</td><td>Promega</td><td>V4261</td><td>puede fabricarse a partir de productos químicos originales (150 mM de NaCl, 15 mM de citrato de sodio)</td></tr><tr><td>Tubos Eppendorf Safe-Lock Tubos de 0,5 ml (seguros criogénicos)</td><td>Eppendorf</td><td>22363611</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Dewar, 1 L, HDPE, matraz de sobremesa de nitrógeno líquido</td><td>Thermo Scientific</td><td>4150-1000</td><td></td></tr><tr><td>Rnase Away</td><td>VWR</td><td>53225-514</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas ultrafinas (pinzas de disección)</td><td>EMS</td><td>78310-0</td><td>pinzas de punta fina similares de alta calidad que se pueden sustituir</td></tr><tr><td>Interruptor de pie/pedal</td><td>Linemaster Switch Corp.</td><td>491-S</td><td></td></tr><tr><td>Abrazadera de extensión de dos puntas, con manguitos recubiertos de vinilo, 8,5 pulgadas</td><td>VWR</td><td>21570-007</td><td>podrían sustituirse por modelos similares</td></tr><tr><td>Soporte de abrazadera</td><td>VWR</td><td>89084-746</td> se <td>pueden sustituir modelos similares, debe acomodar el diámetro de la varilla de sujeción de extensión</td></tr><tr><td>Base magnética (sujeta la abrazadera de extensión a través del soporte de abrazadera)</td><td>VWR</td><td>300042-270</td><td>Se puede sustituir por un aparato similar capaz de sujetar de forma segura la abrazadera de extensión en una posición fija</td></tr><tr><td>Viales colectores de plástico (grandes/40 dram)</td><td>Bioquip</td><td>8940</td><td></td></tr><tr><td>Hilo de coser de algodón</td><td>Tienda de telas y manualidades Joann</td><td>7245855</td><td>producto similar podría ser sustituido</td></tr></tbody></table>

la extracción del veneno y veneno glándula microdisecciones de arañas de proteómica y análisis transcriptomic

Extraction of Venom and Venom Gland Microdissections from Spiders for Proteomic and Transcriptomic Analyses

Venenos son químicamente secreciones complejas que comprenden típicamente numerosas proteínas y péptidos con actividades fisiológicas variadas. Caracterización funcional de las proteínas del veneno tiene importantes aplicaciones biomédicas, incluyendo la identificación de los clientes potenciales de la droga o sondas para los receptores celulares. Las arañas son la mayoría de las especies ricas clado de organismos venenosos, pero los venenos de sólo unas pocas especies son bien comprendidas, en parte debido a la dificultad asociada con la recolección de pequeñas cantidades de veneno de animales pequeños. En este trabajo se presenta un protocolo para la recolección de veneno de arañas utilizando la estimulación eléctrica, lo que demuestra el procedimiento de la viuda negro occidental (Viuda negra). El veneno de recogida es útil para diversos análisis aguas abajo, incluyendo la identificación directa de proteínas mediante espectrometría de masas, ensayos funcionales, y la estimulación de la expresión génica veneno para los estudios de transcriptómica. Esta técnica tiene la ventaja sobre los protocolos que isofinales de veneno de homogeneizados de la glándula enteros, que no se separan los componentes del veneno auténticos a partir de proteínas celulares que no son secretadas como parte del veneno. Los resultados representativos demuestran la detección de péptidos del veneno conocidos de la muestra recogida utilizando la espectrometría de masas. El procedimiento de recogida de veneno es seguido por un protocolo para la disección de las glándulas de veneno de araña, con resultados que demuestran que esto conduce a la caracterización de las proteínas y péptidos del veneno-expresado en el nivel de secuencia.

La colección de veneno y de las glándulas de veneno de las disecciones se realizan con frecuencia para caracterizar proteínas y péptidos del veneno en el plano secuencia 10,11,15. Veneno recogido puede usarse también en ensayos fisiológicos para determinar sus actividades funcionales 18. La colección de veneno estimulará la expresión del gen de la glándula de veneno, lo que facilita la clonación de las transcripciones de toxina específicos a través de RT-PCR 10,11. Identificación de proteínas del veneno se puede realizar también de una manera de alto rendimiento mediante la integración de técnicas de espectrometría de masas estándar con bases de datos de secuencia generados a partir de bibliotecas de ADNc de glándula de veneno 15,21. Un ejemplo de este tipo de trabajo, a partir de veneno y las glándulas recogidas utilizando el protocolo detallado anteriormente, lo que demuestra su eficacia, se ilustra en la Figura 1. Veneno de recogida de L. hesperus hembras adultas se digirió con tripsina y se sometieron a una solución enAnálisis MudPIT, que vincula la HPLC (cromatografía líquida de alta resolución) a la espectrometría de masas en tándem (MS / MS). Aquí el análisis MudPIT se llevó a cabo por la Universidad de Arizona Proteómica Consorcio. Las masas de péptidos detectadas y sus fragmentos disociados (iones hija, inferidos a partir de los espectros) se compararon con secuencias de péptidos predichos teóricamente a partir de las traducciones de las secuencias de ADNc obtenidas a partir de una biblioteca de expresión de gen construido a partir de L. hesperus glándulas de veneno (glándulas fueron adquiridos por el protocolo de disección se ha descrito anteriormente) 21. En este experimento, 36 proteínas se detectaron a partir de todos los espectros recogidos, en el umbral de probabilidad 99,9%, y contenían por lo menos un péptido detectados. Una de las proteínas detectadas se apoya en 43 espectros total (espectros ejemplar se muestra en la Figura 1A), correspondiente a tres péptidos exclusivos, que cubre 35% de la secuencia de la proteína (Figura 1B). La proteína detectada (traducido a partir de un collecte<html> d ADNc) tiene un éxito superior a BLASTp latrodectin de L. tredecimguttatus (GenBank adhesión P49125.1), con un e-score de 2e-46, y comparte el 80% de identidad en la secuencia de aminoácidos con la proteína detectada en este experimento. Latrodectin, que también se conoce como la proteína de bajo peso molecular de alfa-latrotoxina, es un componente reconocido de veneno de arañas viuda negro 22, 23, la verificación de la eficacia del protocolo presentado. Algunas proteínas identificadas a partir del veneno corresponden a secuencias para el que se ha encontrado ningún hit BLAST. No está claro si este resultado se debe a los limitados recursos genómicos disponibles para las arañas, así como la información funcional limitada por sus proteínas, o porque la proteína desconocida representa un contaminante veneno. Sin embargo, el gen o los análisis de expresión de la proteína examen de la abundancia de una proteína tal novela en glándulas de veneno relativos a otros tejidos deben revelar si se trata de un componente de veneno genuino. ent &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51618/51618fig1highres.jpg" width="600" /> Figura 1: péptido Latrodectin identificado del veneno de la viuda de negro utilizando la espectrometría de masa (A) espectros Representante (uno de 43) detectada a través de parte de MS / MS de análisis MudPIT de L.. hesperus veneno que se asignó a la traducción predicha de una secuencia de ADNc recogido se muestra en la parte B. Los espectros muestra relación masa a carga (m / z) de iones secundarios detectados en el eje horizontal producido por la fragmentación de péptido parental (CGEEDFGEEIVK), con letras en la parte superior fue asignado indicando la secuencia del péptido sobre la base de masas de iones hija. (B) de secuencias de proteínas a la que los espectros en la parte A, que muestra en rojo, negrita y subrayado de texto la secuencia correspondiente de los espectros se muestra en la parte A, el texto en rojo adicional (no negrita) representa otro péptido en esta proteína detectada con otra sp recogidaECTRA. La secuencia de la proteína se traduce de una secuencia de ADNc obtenido a partir de glándulas de veneno disecados.

Este artículo proporciona un protocolo para la extracción del veneno de arañas utilizando la estimulación eléctrica con el fin de 1) llevar a cabo la caracterización proteómica, 2) estimular el veneno de la expresión del gen de la glándula, y 3) realizar estudios funcionales de venenos. Esto es seguido por una descripción de microdisecciones glándula de veneno para estudios de expresión génica.

La extracción del veneno y veneno glándula microdisecciones de arañas de Proteómica y análisis Transcriptomic

Venoms are chemically complex secretions typically comprising numerous proteins and peptides with varied physiological activities. Functional ...

El objetivo general de este procedimiento es extraer veneno y diseccionar glándulas de veneno de arañas para estudios transcriptómicos y proteómicos; esto se logra primero preparando el equipo y los reactivos necesarios para recolectar el veneno mediante estimulación eléctrica. El segundo paso consiste en inmovilizar y anestesiar una araña con pinzas bajo un microscopio estereoscópico. A continuación, se aplica un impulso eléctrico a la araña y el veneno liberado se recoge con un tubo capilar de micro. El paso final consiste en diseccionar las glándulas de veneno de la araña dos o tres días después. En última instancia, se utiliza la espectrometría de masas u otros análisis proteómicos del veneno para determinar las secuencias de las proteínas constituyentes del veneno. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos para la recolección del veneno son difíciles de aprender porque implican una serie de acciones coordinadas que deben realizarse con rapidez, pero con cuidado.Para comenzar, conecte el cable de alimentación del estimulador eléctrico a un enchufe y conecte el pedal externo a una entrada de señal externa. A continuación, asegúrese de que el interruptor de polaridad esté en modo normal y conecte el electrodo positivo al terminal de salida rojo del estimulador eléctrico y el electrodo negativo al terminal de salida negro. Luego, configure el estimulador con los siguientes ajustes iniciales recomendados.Pruebe la salida del electrodo conectando pinzas cocodrilo a los cables de prueba positivo y negativo del voltímetro. Luego encienda el interruptor de alimentación del estimulador y aplique corriente mediante el pedal. Prepare la pinza de peso ligero recubriendo un extremo con plástico líquido y espere cuatro horas a que el recubrimiento se seque; después de que el plástico se haya secado, envuelva firmemente 15 milímetros del extremo opuesto AP del otro extremo con una sola capa de hilo de algodón para coser y asegure el hilo atando el extremo en un nudo.A continuación, utilizando tijeras afiladas, corte la punta de una aguja hipodérmica roma, lo suficientemente pequeña como para no dañar la araña, pero lo suficientemente grande como para evitar obstrucciones. Alise la abertura con papel de lija y conecte la aguja a un trampa de vacío para residuos. Luego, coloque la pinza de peso ultraligero en posición horizontal en una posición firmemente cerrada utilizando una pinza bimetálica recubierta de vinilo sujeta a una base magnética, debajo del campo de visión del microscopio estereoscópico, con la punta recubierta de plástico en la parte superior y la punta recubierta con hilo en la parte inferior.A continuación, sujete un clip cocodrilo del electrodo positivo a la punta inferior aguas arriba del hilo, y sujete un clip cocodrilo negativo a la aguja metálica roma de vacío. Luego, coloque el cable positivo en la punta de la pinza entre el hilo y el clip cocodrilo, y el cable negativo en la aguja de vacío roma. Para probar la corriente del circuito del voltímetro, presione el pedal con el pie para asegurarse de que se detecte una corriente suficiente, y retire los cables mientras usa protección ocular.Prepare varios tubos capilares microscópicos para la recolección del veneno. A continuación, coloque una tira de masilla de sujeción en una placa de Petri y apoye los capilares microscópicos sobre la tira. Sostenga con una mano enguantada un tubo capilar microscópico por un extremo y sostenga el otro extremo con pinzas metálicas estériles sobre la llama de un mechero Bunsen; luego, tire del extremo alejándolo de la llama para crear una punta alargada mientras mantiene el otro extremo en una posición fija. Examine los extremos de los capilares microscópicos bajo un microscopio estereoscópico y cree una pequeña abertura biselada en el extremo estirado utilizando pinzas metálicas esterilizadas.Cierre los tubos y colóquelos en hielo. Para comenzar la inmovilización de la araña, encienda el gas de la cámara de CO₂. Luego, transfiera la araña con pinzas metálicas largas desde el vial de recolección de plástico cerrado hasta la cámara de CO₂.Mantenga la araña en la cámara durante cinco a 10 minutos y verifique que ya no se esté moviendo, empujándola suavemente con pinzas largas. Luego, use una pipeta de transferencia con solución salina para humedecer el hilo sobre las pinzas.A continuación, retire la araña anestesiada de la cámara de CO2 tomándola por sus patas anteriores. Utilizando pinzas de disección romas y las manos con guantes, traslade la araña anestesiada al aparato de pinzas ligeras. Luego, separe los dientes de las pinzas ligeras cerradas y coloque el tórax cefálico de la araña entre los dientes.Permita que los dientes se cierren para asegurar que la araña quede firmemente sujeta, pero sin ser aplastada. Asegúrese rápidamente de que la araña esté colocada con el carapacho dorsal hacia abajo, apoyada sobre el diente recubierto de hilo, y que su lado ventral quede orientado hacia el revestimiento de plástico, mientras el electrodo positivo permanece unido al diente inferior. A continuación, ajuste el enfoque de la lupa de disección, su aumento y la fuente de luz hasta que las quélidas y los colmillos de la araña sean claramente visibles. Para iniciar la recolección del veneno, encienda el vacío y rocíe con agua el colmillo de la araña.Utilizando una segunda aguja de jeringa de punta roma, aspire el agua con una aguja de vacío para eliminar las impurezas. A continuación, toque la aguja de vacío, conectada al electrodo negativo, con el rostro del arácnido y aplique un pulso mediante el pedal. Las patas de la araña se contraerán y el veneno será visible como gotas transparentes que emergen de los colmillos.Extraiga mediante vacío el regurgitado si es necesario. Luego, recoja las gotas de veneno con la punta de la micropipeta y transfiera la punta a un tubo de 0,5 mililitros con agua, la cual será aspirada hacia el interior de la micropipeta. Evite perforar la araña con la micropipeta y la contaminación de esta con seda y cola procedentes de las glándulas de seda.A continuación, conecte la jeringa de transferencia con el adaptador de tubo al microcapilar en el extremo opuesto a la punta de recolección y expulse la solución de veneno nuevamente en el tubo; coloque el tubo en hielo y almacene los tubos que contienen veneno a menos 80 grados Celsius. Al finalizar, tras completar la recolección del veneno, coloque un vial plástico abierto de recolección junto con su tapa cerca de la araña. Para una transferencia rápida, sostenga cuidadosamente las patas de la araña con pinzas de disección romas sostenidas en una mano y abra cuidadosamente las pinzas ultraligeras con la otra mano.Luego, deslice la araña dentro del vial de recolección con pinzas romas. Y cierre rápidamente la tapa; dos o tres días después de la recolección del veneno, anestesie la araña en una cámara de CO2, luego llene un recipiente de nitrógeno líquido y colóquelo junto a un microscopio de disección. Limpie el área de disección y las pinzas con RNA away.Luego, llene un pequeño recipiente de Petri con un x de cloruro de sodio en citrato salino y colóquelo bajo el microscopio estereoscópico. A continuación, transfiera la araña de la cámara de CO2 al recipiente de Petri y use pinzas para separar rápidamente el cefalotórax del abdomen. Después, sostenga el cefalotórax bajo el microscopio estereoscópico con pinzas y coloque la glándula colifera en el campo de visión.Utilice los extremos afilados de un segundo par de pinzas para cortar la cutícula que une el carábasis con las partes laterales del colículo lateralmente. Sujete el colículo con el segundo par de pinzas y tire suavemente hacia adelante y hacia atrás hasta que se extraigan las glándulas de veneno. Realice este procedimiento en no más de 15 minutos.Separen las glándulas del colículo y transfiéranlas a un tubo criogénico seguro de 0.5 mililitros. Coloque el tubo cerrado en nitrógeno líquido, integrando técnicas de espectrometría de masas con bases de datos de secuencias generadas a partir de ADNc de glándulas de veneno. Las bibliotecas permitieron la identificación de proteínas del veneno. El péptido laro inept fue una de las 36 proteínas identificadas del veneno de viuda negra mediante espectrometría de masas.No olvide que trabajar con arañas como la viuda negra puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones, como usar guantes de protección, al realizar este procedimiento.

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