La extracción del veneno y veneno glándula microdisecciones de arañas de Proteómica y análisis Transcriptomic

El objetivo general de este procedimiento es extraer veneno y diseccionar glándulas de veneno de arañas para estudios transcriptómicos y proteómicos; esto se logra primero preparando el equipo y los reactivos necesarios para recolectar el veneno mediante estimulación eléctrica. El segundo paso consiste en inmovilizar y anestesiar una araña con pinzas bajo un microscopio estereoscópico. A continuación, se aplica un impulso eléctrico a la araña y el veneno liberado se recoge con un tubo capilar de micro.

El paso final consiste en diseccionar las glándulas de veneno de la araña dos o tres días después. En última instancia, se utiliza la espectrometría de masas u otros análisis proteómicos del veneno para determinar las secuencias de las proteínas constituyentes del veneno. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos para la recolección del veneno son difíciles de aprender porque implican una serie de acciones coordinadas que deben realizarse con rapidez, pero con cuidado.

Para comenzar, conecte el cable de alimentación del estimulador eléctrico a un enchufe y conecte el pedal externo a una entrada de señal externa. A continuación, asegúrese de que el interruptor de polaridad esté en modo normal y conecte el electrodo positivo al terminal de salida rojo del estimulador eléctrico y el electrodo negativo al terminal de salida negro. Luego, configure el estimulador con los siguientes ajustes iniciales recomendados.

Pruebe la salida del electrodo conectando pinzas cocodrilo a los cables de prueba positivo y negativo del voltímetro. Luego encienda el interruptor de alimentación del estimulador y aplique corriente mediante el pedal. Prepare la pinza de peso ligero recubriendo un extremo con plástico líquido y espere cuatro horas a que el recubrimiento se seque; después de que el plástico se haya secado, envuelva firmemente 15 milímetros del extremo opuesto AP del otro extremo con una sola capa de hilo de algodón para coser y asegure el hilo atando el extremo en un nudo.

A continuación, utilizando tijeras afiladas, corte la punta de una aguja hipodérmica roma, lo suficientemente pequeña como para no dañar la araña, pero lo suficientemente grande como para evitar obstrucciones. Alise la abertura con papel de lija y conecte la aguja a un trampa de vacío para residuos. Luego, coloque la pinza de peso ultraligero en posición horizontal en una posición firmemente cerrada utilizando una pinza bimetálica recubierta de vinilo sujeta a una base magnética, debajo del campo de visión del microscopio estereoscópico, con la punta recubierta de plástico en la parte superior y la punta recubierta con hilo en la parte inferior.

A continuación, sujete un clip cocodrilo del electrodo positivo a la punta inferior aguas arriba del hilo, y sujete un clip cocodrilo negativo a la aguja metálica roma de vacío. Luego, coloque el cable positivo en la punta de la pinza entre el hilo y el clip cocodrilo, y el cable negativo en la aguja de vacío roma. Para probar la corriente del circuito del voltímetro, presione el pedal con el pie para asegurarse de que se detecte una corriente suficiente, y retire los cables mientras usa protección ocular.

Prepare varios tubos capilares microscópicos para la recolección del veneno. A continuación, coloque una tira de masilla de sujeción en una placa de Petri y apoye los capilares microscópicos sobre la tira. Sostenga con una mano enguantada un tubo capilar microscópico por un extremo y sostenga el otro extremo con pinzas metálicas estériles sobre la llama de un mechero Bunsen; luego, tire del extremo alejándolo de la llama para crear una punta alargada mientras mantiene el otro extremo en una posición fija. Examine los extremos de los capilares microscópicos bajo un microscopio estereoscópico y cree una pequeña abertura biselada en el extremo estirado utilizando pinzas metálicas esterilizadas.

Cierre los tubos y colóquelos en hielo. Para comenzar la inmovilización de la araña, encienda el gas de la cámara de CO₂. Luego, transfiera la araña con pinzas metálicas largas desde el vial de recolección de plástico cerrado hasta la cámara de CO₂.

Mantenga la araña en la cámara durante cinco a 10 minutos y verifique que ya no se esté moviendo, empujándola suavemente con pinzas largas. Luego, use una pipeta de transferencia con solución salina para humedecer el hilo sobre las pinzas.

A continuación, retire la araña anestesiada de la cámara de CO2 tomándola por sus patas anteriores. Utilizando pinzas de disección romas y las manos con guantes, traslade la araña anestesiada al aparato de pinzas ligeras. Luego, separe los dientes de las pinzas ligeras cerradas y coloque el tórax cefálico de la araña entre los dientes.

Permita que los dientes se cierren para asegurar que la araña quede firmemente sujeta, pero sin ser aplastada. Asegúrese rápidamente de que la araña esté colocada con el carapacho dorsal hacia abajo, apoyada sobre el diente recubierto de hilo, y que su lado ventral quede orientado hacia el revestimiento de plástico, mientras el electrodo positivo permanece unido al diente inferior. A continuación, ajuste el enfoque de la lupa de disección, su aumento y la fuente de luz hasta que las quélidas y los colmillos de la araña sean claramente visibles. Para iniciar la recolección del veneno, encienda el vacío y rocíe con agua el colmillo de la araña.

Utilizando una segunda aguja de jeringa de punta roma, aspire el agua con una aguja de vacío para eliminar las impurezas. A continuación, toque la aguja de vacío, conectada al electrodo negativo, con el rostro del arácnido y aplique un pulso mediante el pedal. Las patas de la araña se contraerán y el veneno será visible como gotas transparentes que emergen de los colmillos.

Extraiga mediante vacío el regurgitado si es necesario. Luego, recoja las gotas de veneno con la punta de la micropipeta y transfiera la punta a un tubo de 0,5 mililitros con agua, la cual será aspirada hacia el interior de la micropipeta. Evite perforar la araña con la micropipeta y la contaminación de esta con seda y cola procedentes de las glándulas de seda.

A continuación, conecte la jeringa de transferencia con el adaptador de tubo al microcapilar en el extremo opuesto a la punta de recolección y expulse la solución de veneno nuevamente en el tubo; coloque el tubo en hielo y almacene los tubos que contienen veneno a menos 80 grados Celsius. Al finalizar, tras completar la recolección del veneno, coloque un vial plástico abierto de recolección junto con su tapa cerca de la araña. Para una transferencia rápida, sostenga cuidadosamente las patas de la araña con pinzas de disección romas sostenidas en una mano y abra cuidadosamente las pinzas ultraligeras con la otra mano.

Luego, deslice la araña dentro del vial de recolección con pinzas romas. Y cierre rápidamente la tapa; dos o tres días después de la recolección del veneno, anestesie la araña en una cámara de CO2, luego llene un recipiente de nitrógeno líquido y colóquelo junto a un microscopio de disección. Limpie el área de disección y las pinzas con RNA away.

Luego, llene un pequeño recipiente de Petri con un x de cloruro de sodio en citrato salino y colóquelo bajo el microscopio estereoscópico. A continuación, transfiera la araña de la cámara de CO2 al recipiente de Petri y use pinzas para separar rápidamente el cefalotórax del abdomen. Después, sostenga el cefalotórax bajo el microscopio estereoscópico con pinzas y coloque la glándula colifera en el campo de visión.

Utilice los extremos afilados de un segundo par de pinzas para cortar la cutícula que une el carábasis con las partes laterales del colículo lateralmente. Sujete el colículo con el segundo par de pinzas y tire suavemente hacia adelante y hacia atrás hasta que se extraigan las glándulas de veneno. Realice este procedimiento en no más de 15 minutos.

Separen las glándulas del colículo y transfiéranlas a un tubo criogénico seguro de 0.5 mililitros. Coloque el tubo cerrado en nitrógeno líquido, integrando técnicas de espectrometría de masas con bases de datos de secuencias generadas a partir de ADNc de glándulas de veneno. Las bibliotecas permitieron la identificación de proteínas del veneno. El péptido laro inept fue una de las 36 proteínas identificadas del veneno de viuda negra mediante espectrometría de masas.

No olvide que trabajar con arañas como la viuda negra puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones, como usar guantes de protección, al realizar este procedimiento.