La extracción del veneno y veneno glándula microdisecciones de arañas de Proteómica y análisis Transcriptomic

El objetivo general de este procedimiento es extraer veneno y diseccionar glándulas venenosas de arañas para estudios transcriptómicos y proteómicos, esto se logra preparando primero el equipo y los reactivos necesarios para recolectar el veneno por estimulación eléctrica. El segundo paso es inmovilizar una araña anestésica con pinzas bajo un microscopio de disección. A continuación, la araña se pulsa con corriente y el veneno liberado se recoge con un tubo microcapilar.

El paso final es diseccionar las glándulas venenosas de la araña dos o tres días después. En última instancia, la espectrometría de masas u otros análisis proteómicos del veneno se utilizan para mostrar las secuencias de las proteínas constituyentes del veneno. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de recolección de veneno son difíciles de aprender porque implican una secuencia de acciones coordinadas que deben realizarse de manera rápida pero cuidadosa.

Para comenzar, conecte un cable de alimentación del electroestimulador a una toma de corriente y conecte el pedal externo a una entrada de señal externa. A continuación, asegúrese de que el interruptor de polaridad esté en modo normal y conecte el electrodo positivo al terminal de salida rojo del electroestimulador y conecte el electrodo negativo al terminal de salida negro. A continuación, ajuste el estimulador a los siguientes ajustes iniciales recomendados.

Pruebe la salida del electrodo conectando pinzas de cocodrilo a los cables de prueba del voltímetro positivo y negativo. A continuación, encienda el interruptor de alimentación del estimulador y suministre corriente con el pedal. Prepare las pinzas de peso pluma cubriendo una punta con plástico líquido y espere cuatro horas para que el recubrimiento se seque después de que el plástico se haya secado, envuelva firmemente 15 milímetros de la punta de la punta opuesta AP con una sola capa de hilo de coser de algodón y asegure el hilo atando el extremo con un nudo.

A continuación, con unas tijeras afiladas, corte la punta de una aguja hipodérmica roma, lo suficientemente pequeña como para no dañar a la araña, pero lo suficientemente grande como para evitar que se obstruya. Alise la abertura con papel de lija y coloque la aguja en una trampa de desechos de la aspiradora. A continuación, coloque las pinzas de peso pluma horizontalmente en una posición muy cerrada utilizando una abrazadera de dos puntas cubierta de vinilo asegurada a una base magnética bajo el campo de visión de un microscopio de disección con la punta recubierta de plástico en la parte superior y la punta recubierta de hilo en la parte inferior.

A continuación, coloque una pinza de cocodrilo de electrodo positivo en la punta inferior aguas arriba de la rosca y fije una pinza de cocodrilo negativa a la aguja de vacío de metal romo. A continuación, coloque el cable positivo en la punta de la pinza entre el hilo y la pinza de cocodrilo y el cable negativo en la aguja de vacío roma. Para probar la corriente del circuito del voltímetro, presione el pedal para asegurarse de que se detecte una corriente suficiente y retire los cables mientras usa gafas protectoras.

Prepare varios microtubos capilares para la recolección del veneno. A continuación, coloque una tira de masilla de montaje en una placa de Petri y apoye los microcapilares en la tira. Con una mano enguantada, sostenga un solo tubo microcapilar en un extremo y sostenga el otro extremo con pinzas de metal estériles sobre la llama de un mechero Bunsen y aleje el extremo de la llama para crear una punta alargada mientras sostiene el otro extremo en una posición estacionaria, examine los extremos microcapilares bajo un microscopio de disección y cree una pequeña abertura biselada en el extremo tirado con pinzas de metal esterilizadas.

Cierre los tubos y colóquelos sobre hielo. Para comenzar la inmovilización de la araña, encienda el gas de la cámara de CO2. A continuación, transfiera la araña con pinzas metálicas largas desde el vial colector de plástico cerrado a la cámara de CO2.

Mantenga la araña en la cámara durante cinco a 10 minutos y verifique que la araña ya no se mueva. Pincharlo suavemente con pinzas largas. A continuación, utilice una pipeta de transferencia con solución salina para humedecer la rosca de las pinzas.

A continuación, recupera la araña anestesiada de la cámara de CO2 cogiéndola por sus patas anteriores. Usando pinzas de disección romas y manos enguantadas, mueva la araña anestesiada al aparato de pinzas de peso pluma. A continuación, separe las puntas de las pinzas de peso pluma cerradas y coloque las arañas cefálicas entre las puntas.

Deje que las puntas se cierren para asegurarse de que la araña se mantenga firmemente en su lugar pero no se aplaste Asegúrese rápidamente de que la araña esté colocada con el lado del dorso del carpace hacia abajo, descansando sobre la punta recubierta de rosca, y que el lado ventral del automóvil esté orientado hacia el revestimiento de plástico mientras que el electrodo positivo permanece unido a la punta inferior. A continuación, ajuste el enfoque de aumento del microscopio de disección y la fuente de luz hasta que la cintura y los colmillos de las arañas sean claramente visibles. Para comenzar la recolección de veneno, encienda la aspiradora y rocíe la mina de carbón con agua.

Con una segunda aguja de jeringa de punta roma, succiona el agua con una aguja de vacío para eliminar las impurezas. A continuación, toque la aguja de vacío con el electrodo negativo en el rostro de la araña y administre un pulso con el pedal. Las patas de la araña se contraerán y el veneno será visible en forma de gotas transparentes que emergen de los colmillos.

Aspire la regurgita si es necesario. A continuación, recoge las gotas de veneno con la punta microcapilar y transfiere la punta capilar a un tubo de 0,5 mililitros con agua, que será succionada por el capilar. Evite perforar la araña con el capilar y contaminar el capilar con seda y pegamento de las pintas.

A continuación, conecte la jeringa de transferencia con adaptador de tubo al microcapilar en el extremo opuesto a la punta de recolección y dispense la solución de veneno nuevamente en el tubo y coloque el tubo en los tubos que contienen veneno de almacenamiento de hielo a menos 80 grados Celsius. Cuando termine, cuando termine con la recolección de veneno, coloque un frasco recolector de plástico abierto junto con su tapa cerca de la araña. Para una transferencia rápida, agarre con cuidado las patas de la araña con pinzas de disección romas sostenidas con una mano y abra cuidadosamente las pinzas de peso pluma con la otra mano.

A continuación, deslice la araña en el vial colector con pinzas romas. Y cierre rápidamente la tapa dos o tres días después de la recolección del veneno, anestesie a la araña en una cámara de CO2, luego llene un portador de nitrógeno líquido y colóquelo junto a un microscopio de disección. Limpie el área de disección y las pinzas con ARN de distancia.

A continuación, llene una pequeña placa de Petri con citrato de sodio salino y colóquela bajo el microscopio de disección. A continuación, transfiera la araña de la cámara de CO2 a la placa de Petri y use fórceps para separar rápidamente el thax cefálico del abdomen. A continuación, sujete el thax cefálico bajo el microscopio de disección con pinzas y coloque la mina de carbón en el campo de visión.

Use los extremos afilados de un segundo par de pinzas para cortar la cutícula que une la base de carbón con los aspectos laterales de la mina de carbón lateralmente. Sujete la mina de carbón con el segundo par de pinzas y tire suavemente hacia adelante y hacia atrás hasta que se extraigan las glándulas venenosas. No tardará más de 15 minutos.

Separe las glándulas de la mina de carbón y transfiéralas a un tubo criogénico de 0,5 mililitros. Colocar el tubo cerrado en nitrógeno líquido, integrando técnicas de espectrometría de masas con bases de datos de secuencias generadas a partir de la glándula venenosa CD NA. Las bibliotecas permitieron la identificación de proteínas venenosas. El péptido inepto Laro fue una de las 36 proteínas identificadas a partir del veneno de la viuda negra mediante espectrometría de masas.

No olvide que trabajar con arañas como las viudas negras puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como el uso de guantes protectores mientras se realiza este procedimiento.