High Throughput Screening Expresión cuantitativa y Purificación Aplicada a Recombinante Disulfide ricos en proteínas del veneno Producido en E. coli

El objetivo general del siguiente procedimiento es utilizar un protocolo de cribado de expresión de alto rendimiento para cuantificar en E. coli el nivel de proteínas solubles utilizando un robot automatizado de manipulación de líquidos. Esto se logra mediante la inoculación previa.96. Al día siguiente, se inoculan placas de 24 pocillos llenas de medios de autoinducción con los precultivos nocturnos para generar expresión.

Los cultivos, después de la cosecha y la congelación, las proteínas solubles de los cultivos de expresión se purifican mediante cromatografía de afinidad de metales inmovilizados. En última instancia, los niveles de solubilidad para cada fusión de diana intacta se pueden medir para determinar las condiciones óptimas de expresión para la producción de proteínas y la generación de dianas exitosas. A partir de las ventajas de esta técnica de los métodos tradicionales de mayor eficiencia, la radiación limitada de lote a lote y la simplicidad del manejo y seguimiento de datos es fundamental.

Los pasos automatizados pueden parecer desalentadores y difíciles de comprender solo en formato de texto, ya que el texto no transmite la rapidez o la simplicidad del procedimiento. Después de la transformación de las bacterias, comience usando la pinza robótica para apartar la tapa de la primera placa de agar LB de 24 pocillos. A continuación, utilice el brazo de manejo de líquidos de ocho canales para mezclar y luego aspirar 50 microlitros de mezcla de transformación de una placa de transformación de 96 pocillos.

Dispense la mezcla de transformación dentro de los primeros cuatro canales del brazo de manejo de líquidos en la primera columna de la placa de agar LB y las transformaciones dentro de los últimos cuatro canales en la segunda columna de la placa de agar LB Lave bien todas las puntas después de dispensar y luego continúe transfiriendo la mezcla de transformación de la placa de 96 pocillos a todos los pocillos en las siguientes cuatro columnas de la placa de agar LB hasta que Esa placa está terminada. Una vez que se haya completado la transferencia a la primera placa, vuelva a colocar la tapa y comience la transferencia para la siguiente placa. Una vez que se hayan plateado todas las transformaciones, agite todas las placas durante un minuto a 1200 RPM para generar una distribución homogénea de la mezcla de transformación.

Luego, después de mezclar, use el brazo multicanal 96 para aspirar 60 microlitros de la mezcla de transformación restante de la placa de 96 pocillos y dispense la mezcla en una placa de 96 pocillos profundos que contenga caldo LB. Selle los 96 precultivos de pozo profundo con una película adhesiva transpirable para permitir la aireación del cultivo, y luego coloque la placa en una incubadora agitadora de 37 grados Celsius a máxima velocidad durante la noche. Una vez que los precultivos estén en la incubadora, introduzca las placas de agar LB en una campana sin tapas durante unos 10 minutos.

Luego invierta las placas en una incubadora de placas a 37 grados Celsius durante la noche. Al día siguiente, use el brazo de manejo de líquidos para aspirar 100 microlitros del precultivo nocturno en una placa de pocillo profundo 96 para inocular los cultivos de expresión a una dilución de un 40, utilizando el mismo esquema que antes, lavando a fondo el brazo de manejo de líquidos en la estación de lavado entre cada columna de los precultivos. Una vez finalizada la inoculación, se colocaron los cultivos de expresión en una incubadora agitadora a 37 grados centígrados, sellada con adhesivo transpirable durante cuatro horas.

Luego reduzca la temperatura a 17 grados centígrados para una incubación durante la noche. A la mañana siguiente, centrifugar las 24 placas del pozo profundo durante 10 minutos a 3000 Gs. Deseche el sobrenadante en un contenedor de residuos que contenga un agente antimicrobiano y luego golpee las placas boca abajo sobre papel absorbente para eliminar cualquier medio residual y verificar que los cultivos hayan crecido correctamente. Compruebe la presencia de gránulos en el pozo profundo.

A continuación, aspire 125 microlitros de tampón de lisis y dispense el tampón dos veces en cada pocillo de las 24 placas de pocillo profundo con cuatro puntas en cada pocillo. Para alcanzar el volumen final de un mililitro de tampón de lisis para resuspender los pellets, agite las placas a 1200 RPM durante cinco minutos. En el robot, transfiera las suspensiones de celdas a los pozos apropiados de una placa de pozo profundo 96 y almacene las placas selladas a menos 80 grados Celsius durante un mínimo de una hora.

Para esta demostración, utilizaremos el protocolo con 50 microlitros de perlas de níquel para la purificación de las proteínas de fusión objetivo. Primero descongele la placa del pozo profundo 96 en un baño de agua durante aproximadamente 15 minutos. A continuación, suspenda los lisados celulares en la incubadora agitadora a máxima velocidad durante 10 minutos adicionales, los cultivos deben volverse viscosos.

A continuación, utilice una pipeta manual de ocho canales para dispensar ADN y mezcla de sulfato de magnesio en cada pocillo de la placa de pocillo profundo 96 hasta una concentración final de 10 microgramos por mililitro y 20 milimolares respectivamente. Agite la placa sellada durante otros 15 minutos, momento en el que el cultivo debe dejar de ser viscoso. Para evitar la obstrucción de la placa filtrante durante la purificación, es fundamental comprobar visualmente cuidadosamente que ninguno de los lisados sea viscoso.

En el robot de manejo de líquidos, use puntas de diámetro ancho de 200 microlitros para mezclar completamente la lechada de resina antes de transferir 200 microlitros de la suspensión a la placa de pozo profundo 96 que contiene el lisado. Agite la placa 96 de pozo profundo a 1400 RPM y temperatura ambiente durante 10 minutos para permitir la unión, y luego use las puntas de diámetro ancho para mezclar y luego transferir los 1200 microlitros completos de lechada de lisado de resina en alícuotas de 200 microlitros a la placa de filtro. Ahora encienda la aspiradora durante aproximadamente 30 segundos para filtrar el lisado a través de la placa, recogiendo el flujo en un pozo profundo.

96 por debajo del pozo profundo 96 que contiene el flujo a través de él se retira de debajo de la placa filtrante y se almacena en un estante hasta el final del experimento. A continuación, lave la resina dos veces con 800 microlitros de tampón aglutinante cada vez que después del segundo lavado, utilice la pinza robótica para colocar una placa 96 fresca, profunda y bien debajo de la placa de filtro para recoger los 50 milimolares I midaz lavado. Agregue 150 microlitros de tampón de lavado en la placa del filtro y aplique el vacío nuevamente hasta que el tampón haya pasado a través del pozo profundo 96 que contiene.

El lavado se retira de debajo de la placa de filtro y se almacena en una rejilla hasta el final del experimento. Luego, después de lavar dos veces más con 800 microlitros de tampón de lavado, como se demostró para el tampón de unión, los lavados utilizaron la pinza robótica para transferir la microplaca a la mesa de trabajo y volver a colocar el bloque SPE y la placa de filtro encima de la microplaca para recoger el elucian. A continuación, añade 190 microlitros de tampón Elucian a la resina de la placa filtrante.

Después de tres minutos, aplique la aspiradora un minuto para permitir el paso de todo el tampón. Compruebe rápida y visualmente que los volúmenes de Ellucian son correctos. Finalmente, las muestras en bloque del lavado Ellucian y fluyen a través de placas para la cuantificación del nivel de expresión soluble.

Analice primero la placa elluciana y solo cuando sea necesario, verifique el lavado relevante y el flujo a través de fracciones. Estos datos ilustran un resultado de electroforesis del sistema de chips de laboratorio de calibradores. Las proteínas de fusión escindidas intactas están representadas por las bandas superiores y los fragmentos de proteínas escindidos se representan como las bandas inferiores.

Se determinó que los rendimientos de fusión para cada proteína objetivo se encontraban dentro de los rangos de 0,1 a dos, dos a 10 y 10 a 25 microgramos por litro de cultivo, o en algunos casos no se detectaron. La evaluación del éxito de la expresión de la proteína por el número de enlaces de sulfuro diss presentes dentro de cada fragmento de proteína de fusión demuestra un éxito razonable para todos los números de enlaces disulfuro probados, siendo el nivel de éxito más bajo del 66% para los objetivos que contienen seis enlaces disulfuro. El análisis de la distribución del éxito de la expresión en función del punto isoeléctrico y el número de residuos no indica ningún sesgo particular para la técnica, tanto con los objetivos expresados con éxito como con los objetivos que no se detectaron dispersos por toda la parcela.

Una vez que las fusiones han sido detectadas y escindidas, los blancos purificados se someten a un control de calidad mediante ionización por electrospray, espectrometría de masas. Aquí, el objetivo representativo que se muestra es una proteína venenosa rica en sulfuro de 5,7 kilodalton con cuatro enlaces disulfuro. Este espectro muestra los resultados de la proteína antes de la reducción con DTT, como lo fue después de la escisión y la desalinización sin mayor intervención.

Este espectro muestra la proteína después de la reducción con DTT seguida de desalinización para eliminar cualquier exceso de DTT. Las flechas indican los iones correspondientes a las masas experimentales y la designación de cada ion se indica en verde. Las masas progenitoras experimentales calculadas para estos iones se muestran en la tabla y corresponden a una diferencia de masa de ocho Daltons, equivalente a cuatro enlaces de sulfuro oxidados.

Cuando se configura, el protocolo completo se puede realizar en más de mil cultivos en una semana. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar cultivos de E. coli a pequeña escala para identificar las condiciones exitosas necesarias para la producción de proteínas solubles utilizando métodos de alto rendimiento.