Name: Multi-electrodos Grabaciones variedad de epilepsia humana postoperatoria cortical del tejido (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 14 s
Description: Aprende a realizar grabaciones con matrices multielectrodo en tejido cortical humano epiléptico postoperatorio. Este método permite estudiar los mecanismos celulares y de red subyacentes a la iniciación y propagación de crisis.

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Este trabajo fue apoyado por becas de la ANR (Programa Blanc Neurociencias), FRC (Fédération pour la Recherche sur le Cerveau), Ciudad de París (Aparición Programa), el INSERM y el Hospital La Pitié Salpêtrière (contrato de investigación traslacional) a NR, de Neuropôle de Recherche Francilien (NERF) a la disfunción eréctil, de la Université Pierre et Marie Curie UPMC (Programa de Convergencia) y del Institut du Cerveau et e la Moelle epiniere (París) a GH

NOTA: El protocolo aquí descrito se ajusta a las directrices de los franceses &quot;Comité Consultivo Nacional d&#39;Ethique&quot; y se declara como una actividad de recolección por el INSERM. 1. Resección del Tejido Humano epiléptico <ol><li> Pacientes <ol><li> Obtener el tejido cerebral de pacientes que sufren de epilepsia intratable. Obtener un consentimiento informado por escrito antes de la cirugía. </li><li> Para todos operados pacientes epilépticos realizan un extenso estudio diagnóstico prequirúrgico incluyendo examen neurológico, evaluación neuropsicológica, EEG de superficie, y de neuroimagen (resonancia magnética y, a veces 18 FDG-PET; Figura 1A), seguido por el examen histológico post-quirúrgica del tejido resecado (Figura 1B) . NOTA: La cirugía está indicada cuando las diversas exploraciones localizar de manera similar la zona de inicio de la crisis y cuando el beneficio de su extracción supera los riesgos quirúrgicos. </li></ol></li><li> Cirugía <ol><li> Maiantiepilépticos ntain antes de la cirugía. Realizar la cirugía bajo anestesia general: inducción con sevoflurano inhalado (6% relación entregado y 100% inhalado fracción de O 2), sufentanilo intra venosa (0,3 mg / kg) y antracurium (0,5 mg / kg), seguido por mantenimiento con sufentanil intra venosa (0,5 g / kg / hr) y sevoflurano inhalado (1 MAC). </li><li> Utilice un sistema de neuronavegación para permitir una localización precisa de la corteza lesionada (Figura 1C). Después de la incisión de la piel, realizar un agujero de trépano en el hueso seguida de una craneotomía con un alto simulacro de derrame. Elevar suavemente el colgajo óseo, y abrir la duramadre con tijeras (Figura 1D). </li><li> Utilice ultrasonido intraoperatorio para facilitar la identificación de la corteza anormal, y los instrumentos de microcirugía y un aspirador ultrasónico bajo el microscopio quirúrgico. </li><li> Coagular y cortar el plano-pio arachnoidal de acuerdo con los límites sulcal. Utilice la disección subpial para rElease la corteza de la pia alrededor de la zona lesionada. </li><li> Cortar la materia blanca bajo la corteza anormal para llevar a cabo una sola pieza &quot;en bloque&quot; resección, evitando tanto como sea posible la vasculatura. Evite la manipulación traumática de la corteza. </li><li> Corte una rebanada 1 cm de espesor de tejido resecado largo de una dirección ortogonal a la superficie pial, incluyendo la parte inferior del surco y la corteza de transición. </li></ol></li></ol> 2. artificial líquido cefalorraquídeo (ACSF) para la preparación de la rebanada, incubación y grabación <ol><li> ACSF para la preparación rebanada <ol><li> Preparar 1 L de base de sacarosa ACSF 7,8, que contiene (en mM): 250 de sacarosa, 3 KCl, 25 NaHCO 3, 10 D-glucosa, 1 CaCl 2, MgCl 2 10; disolver estas sales en agua desionizada y oxigenar la solución con carbógeno durante al menos 10 min. </li><li> Ponga ~ 700 ml de sacarosa ACSF a -80 ° C durante 50-60 min (o -150 ° C durante 15-20 min). Mantenga el resto de lasolución bajo la oxigenación en el hielo. NOTA: La ACSF para la preparación rebanada se puede almacenar a 4 ° C; en este caso, añadir CaCl 2 y MgCl 2 el día del experimento, antes de enfriarla. </li></ol></li><li> ACSF para la incubación rebanada y grabación <ol><li> Preparar al menos 3 L de ACSF grabación 7,8, que contiene (en mM): 124 NaCl, 3 KCl, 26 NaHCO 3, 10 D-glucosa, 1,6 CaCl 2, 1,3 MgCl 2; disolver estas sales en agua desionizada y oxigenar la solución con carbógeno. Antes de la adición de MgCl2, mantener algunos ACSF para realizar grabaciones en 0 Mg 2+ ACSF. NOTA: La ACSF incubación / grabación se puede almacenar a 4 ° C; en este caso, añadir CaCl 2 y MgCl 2 el día del experimento. </li></ol></li></ol> 3. Equipo para la rebanada de Incubación y grabación <ol><li> Cámara de interfaz para la incubación rebanada <ol><li> Utilice una cámara de corte de cerebro para mantener las rebanadas ex vivo de estar &lt;/ Em&gt; en el modo de interfaz. NOTA: La cámara se compone de una sección inferior, que contiene la calefacción y los elementos sensores y un burbujeador de cerámica y se llena con agua destilada, y una parte superior, donde las rodajas descansan sobre una hoja de tejido del cristalino en el área plana en el centro de la cámara (Figura 2A - B). </li><li> Utilice dos tubos finos de PTFE separados, a través del cual el preoxygenated ACSF entra en la cámara. NOTA: Los tubos en espiral en el agua caliente y alcanzan la parte superior de la cámara; entonces la solución sale por medio de la acción capilar con el tejido objetivo, que transmite la solución en los pocillos de salida. </li><li> Conectar los tubos de PTFE de la cámara de interfaz a una bomba peristáltica, para permitir la perfusión continua de las rebanadas con el medio preoxygenated. </li><li> Mantener la tensión alta de oxígeno por la oxigenación con carbógeno (95% O 2 y 5% de CO 2) a través del burbujeador cerámica. NOTA: Esta mezcla de gas calentado y humedecido alcanza elrebanadas en la parte superior de la cámara a través de agujeros apropiados. </li><li> Mantener la temperatura en la parte superior de la cámara mediante la conexión de la cámara a un controlador de temperatura, a través de un cable de doble extremo especial, que tiene un conector para el elemento de calentamiento de la cámara y un sensor de temperatura exterior en un extremo. Coloque el sensor cerca de las rodajas para comprobar la temperatura a lo largo de la incubación (Figura 2C). </li></ol></li><li> Grabaciones matriz multi-electrodo <ol><li> Utilice matrices planas de múltiples electrodos con 120 electrodos de nitruro de titanio (30 micras de diámetro) aislados con nitruro de silicio y el electrodo de referencia interno, dispuestos en una matriz de 12 x 12 con 200 micras separación de centro a centro. NOTA: Son posibles otras configuraciones con diferente diámetro del electrodo y el espaciamiento. En particular, el chip MEA puede ampliarse para probar rebanadas más grandes de los tejidos humanos. </li><li> Adquirir señales eléctricas a 10 kHz utilizando un sistema MEA2100-120 (pre y fiamplificador con filtro integrado de adquisición de datos y un convertidor analógico-digital, resolución de datos de 16 bits, el rango de tensión de entrada y ancho de banda ajustable vía software) a través de un software específico (MC_Rack). NOTA: El cabezal de la platina MEA2100 está dotado de una placa de metal para la fijación de un elemento que se puede calentar la perfusión a través de soportes magnéticos, para perfundir continuamente las rodajas a lo largo de la sesión de grabación. </li><li> Mantenga el tejido hacia abajo en el MEA por una pequeña ancla de platino hecho en casa, lo que asegura un buen acoplamiento eléctrico entre la rebanada y los electrodos. </li></ol></li></ol> 4. Preparación de la Cámara de interfaz y herramientas para la disección y rebanar <ol><li> Cámara de interfaz <ol><li> Llene la sección inferior de la cámara de interfaz con agua destilada. Asegúrese de que el nivel de agua se sumerge por completo la resistencia y es de 2 a 4 mm por debajo de la unión entre la parte inferior y superior de la cámara. Compruebe este nivel todos los días antes de encender la calefacción,con el fin de evitar daños del elemento de calentamiento. </li><li> Conectar la cámara a una fuente de carbógeno, dotado de un regulador de flujo secundario para ajustes finos de la presión del gas. </li><li> Cortar una hoja de papel para lentes con el fin de adaptarse a la zona plana de la cámara de corte, y colocarlo cerca de los tubos de entrada de la solución, para que nadie se escape de la burbuja de la línea de entrada antes de llegar a las rebanadas. </li><li> Cortar dos piezas de hilo de algodón trenzado, siempre y cuando la pieza de tejido del cristalino, y la posición a lo largo de los lados principales de la zona plana de la cámara. NOTA: Esto ayuda a aumentar ligeramente el nivel de la solución de perfusión en la cámara. </li><li> Ajuste el caudal de la bomba peristáltica a 1 ml / min y activar la bomba. </li><li> Iniciar la oxigenación del agua en la parte inferior de la cámara. </li><li> Ajuste la temperatura del controlador de temperatura a 37 ° C y vuelva a encenderlo. Cubra la parte superior de la cámara de interfaz con un trozo de Parafilm y espere al menos 30 minutos para la temperatUre para aumentar y estabilizar. </li></ol></li><li> Herramientas para la disección y corte en rodajas <ol><li> Prepare un kit de disección que consta de dos pinzas finas, una espátula, una cuchara pequeña y una hoja; dos placas de Petri de vidrio, dos cepillos, así como pegamento de cianoacrilato. </li><li> Establezca los parámetros de la vibratome: espesor, 400 m; frecuencia, 70 a 90 Hz; amplitud, 0,9 a 1 mm, velocidad: 0,1 mm / seg. </li></ol></li></ol> 5. cortical humano Preparación de la rebanada <ol><li> Retire la ACSF a base de sacarosa a partir de -80 ° C congelador y se mezcla para obtener una especie de aguanieve. Oxigenar con carbógeno, poner ~ 250 ml en una botella de vidrio y guárdelo en un frasco Dewar lleno de hielo, mientras que ir a la sala de cirugía del hospital para obtener el tejido. Mientras tanto, mantener el resto a -20 ° C. NOTA: Durante la cirugía, el neurocirujano disecciona un pequeño bloque de tejido cortical. Inmediatamente colocar la muestra en el helado sacarosa ACSF para la transferencia al laboratorio. </li><li> Mantenga el tiempo necesario para la transferencia del hospital al laboratorio a un máximo de 30 min. En el laboratorio, tomar la ACSF oxigenada a base de sacarosa de -20 ° C congelador, mezclar tener un granizado, llenar una placa de Petri y la bandeja tampón vibratome y empezar a oxigenar tanto con carbógeno. Tomar con cuidado la pieza de tejido humano de la botella con una cuchara y lo puso en la placa de Petri (Figura 2D). </li><li> Usando las pinzas, retire con cuidado los coágulos de sangre, los vasos y las meninges para evitar la resistencia durante el rebanado. Retire las meninges, que consiste en pia-materia, a partir de los lados del bloque de tejido, prestando atención a no dañar la superficie cortical. Con una cuchilla, corte un lado del tejido para obtener una superficie plana, que se pega en la placa de muestra de vibratome. NOTA: Las meninges, que consisten en pia-materia, se eliminan a partir de los lados del bloque de tejido, prestando atención a no dañar la superficie cortical. </li><li> Si el bloque de tiN ú mero es más grande que la cámara de MEA, cortar un trozo de dimensiones apropiadas antes de pegar en el plato de muestras (Figura 2E). </li><li> Pegue el tejido con el fin de obtener rebanadas corticales transversales, ponerlo en el baño tampón y cortar rodajas gruesas de 400 micras a baja velocidad (0,1 mm / seg) (Figura 2F). </li><li> Cortar trozos de papel para lentes con dimensiones de sector; con una espátula y un cepillo, transferir las rebanadas en estos tejidos del cristalino y se incuba en la cámara de interfaz a 37 ° C durante al menos 1 hora antes de iniciar las grabaciones (Figura 2G - I). Almacenar continuamente los cortes en las mismas condiciones hasta su uso. NOTA: Colocar las rebanadas en el papel de la lente es un paso importante para facilitar tanto la perfusión del lado inferior de las rebanadas y la eliminación de las rebanadas de la cámara de interfaz antes de la grabación. <ol><li> Si bien la transferencia de las rebanadas en el tejido del cristalino, administrarlos con mucho cuidado, evitando tocar el área de la capa cortical conel cepillo. </li><li> Preparar las rodajas de uno a la vez y transferir inmediatamente cada uno de ellos a la cámara de interfaz, a fin de garantizar el suministro de oxígeno adecuado y la temperatura; cortar el bloque de tejido resecado lo más rápidamente posible. </li></ol></li></ol> 6. Preparación de la instalación de MEA para Grabaciones <ol><li> Enchufe el sistema de perfusión a una bomba peristáltica y el sistema de MEA a un ordenador. Oxigenar la ACSF grabación. Publicar un chip de MEA vacío en el interior del amplificador. </li><li> Ajuste el controlador de temperatura para la calefacción elemento de cánula para llegar a 37 ° C en la cámara de MEA y empezar la perfusión a 5-6 ml / min. NOTA: Por lo general, es necesario establecer la temperatura de 3-4 ° C más alta que la deseada, dependiendo de la temperatura ambiente y la velocidad de flujo. <ol><li> Compruebe la temperatura en la cámara de MEA con una multa termómetro, colocándola lo más cerca posible del centro, sin tocar el área del electrodo. </li></ol></li><li> Inicie la grabación softwarcorreo y comprobar que todos los electrodos MEA están bien conectados y que no hay ruido debido a la perfusión. </li><li> Iniciar MEA_Monitor para comprobar el funcionamiento de la mesa de la cámara. </li></ol> 7. Transferencia de una rebanada de la cámara Interfaz para MEA chip para la grabación <ol><li> Vierta un poco calentado grabación ACSF en una placa de Petri de vidrio; con unas pinzas, tomar una rebanada de la cámara de la interfaz, por el acaparamiento de él a través del tejido de la lente, y lo puso en la placa de Petri. Separar cuidadosamente la rebanada del tejido. Si el nivel de la solución en la cámara de interfaz se ajusta cuidadosamente durante el tiempo de incubación, la rebanada se separará del tejido de la lente sólo sumergiéndolo en la solución; de lo contrario, utilice un cepillo pequeño para facilitar el desprendimiento. </li><li> Llenar un chip de MEA con un poco de ACSF y con una espátula, transferir la rebanada en ella. Con una pipeta Pasteur de plástico, retire suavemente la solución para hacer el corte se adhieren sobre la superficie del electrodo y mantenerla en su lugar con un anch platinoo. Añadir 1 ml de ACSF grabación, colocar el chip de MEA en el amplificador y empezar la perfusión en 5-6 ml / min (Figura 2J - L). </li><li> Compruebe la posición de la rebanada en el área de grabación MEA utilizando MEA_Monitor, ajustar si es necesario con el fin de grabar desde las capas corticales y tomar una fotografía. Inicie la grabación. </li></ol>

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</ol>

Se proporcionó patrocinio por sistemas multicanal para la producción de la publicación de vídeo y de acceso abierto.

Epilepsia farmacorresistente es una enfermedad poco frecuente, que se puede explorar en el tejido humano in vitro. Esto permite el estudio de la corteza humana epiléptico, que muestra los defectos específicos que están sólo parcialmente reproducidas en modelos animales. El método aquí descrito permite la preparación y la grabación de los tejidos postoperatorias humanos ex vivo con la viabilidad y las redes de modo que espontáneamente producen actividades epilépticos celular conservado. Retener a actividades similares a las registradas en vivo es fundamental para estudiar los mecanismos de génesis de actividades patológicas. Además, tales métodos permiten la exploración de tejidos humanos y evitar modelos animales no perfectos de la enfermedad. Sin embargo, el estudio de los tejidos humanos requiere la sincronización entre neurocirujanos y el laboratorio experimental. Transporte de tejidos requiere cuidados específicos para no ser traumático. Además, tanto la cantidad de la muestra y el tejido es limitado. Por último, el acceso a los tejidos de control adecuadas es la main preocupación. Con esta preparación, los tejidos post operatorios producen espontáneamente descargas de interictales como en ACSF normal de 7,8. Eventos-ictales como también pueden ser provocados en modificado, ACSF proconvulsivantes para que los mecanismos de iniciación de convulsiones y la transición desde el estado interictal a las convulsiones pueden ser investigados. Tejido humano puede mantenerse viable durante un máximo de 10 horas en condiciones de interfaz. Las rebanadas se consideraron viable cuando se observaron de forma espontánea de varias unidades de actividad o en el campo potenciales y cuando dichas actividades fueron evocados por el aumento de la excitabilidad a través de aumentos de potasio extracelular y / o disminución de magnesio. A pesar de la variabilidad en la actividad se produce, probablemente refleja las diferencias en las patologías y las áreas corticales, hemos explorado las características epileptogénicas de un tejido sólo en rodajas saludables que muestran interictal espontáneo y evocado descargas ictales. A fin de conservar la vitalidad y actividad del tejido, una cámara de interfaz se utiliza para almacenar tque rebana a 36-37 ° C para la recuperación antes de grabar con el sistema MEA. De hecho, varios grupos han demostrado claramente las ventajas de la interfaz de sistema de almacenamiento basado comparación con el almacenamiento vaso de precipitados estándar y la importancia de la temperatura para la preservación de la actividad de la red tales como onda ondas agudas espontánea o inducida oscilaciones colinérgicos-9,10. Interfaz de almacenamiento de las rebanadas se ha utilizado anteriormente para registrar la actividad epiléptica de hipocampo humano y rodajas subicular 1,11. Con la técnica actual MEA, después del período de recuperación de rebanar en condiciones de interfaz, la actividad de la red se registra en condiciones sumergidas, en presencia de alta velocidad de flujo (5-6 ml / min) a 37 ° C, con el sistema de MEA. El diámetro reducido (1,8 cm) de chip de MEA, que delimita una cámara de volumen pequeño (&lt;1,5 ml), junto con el aumento de la tasa de flujo, aumenta el suministro de oxígeno de la rebanada, que se ha demostrado ser un factor crítico para espontánea y pharmacologically inducida por las actividades de la red 9,10. Además, la cantidad reducida de ACSF que circula facilita la prueba farmacológica. El procedimiento de corte es sin embargo un traumatismo de los tejidos 12. Tanto la arquitectura neuronal y cloruro de homeostasis parecen estar perturbado en la superficie del tejido (50 micras). El origen de las actividades registradas por los chips de los AMUMA, que muestra el tejido superficial en su mayoría sin penetración profunda, puede surgir de las zonas traumatizadas. Sin embargo, nuestros datos muestran que los potenciales de campo extracelulares localmente detectados se registran en la mayoría de los electrodos de los AMUMA y anterior ir a la obra que se integran en una distancia de 100 a 200 micras desde el sitio de grabación 13, lo que sugiere que las incautaciones registradas en nuestra preparación es improbable que sean producida por áreas traumatizadas. Además, en estudios realizados con electrodos de tungsteno que permite la penetración profunda, las actividades epilépticos registrados en los tejidos humanos son similaresa los observados en pacientes epilépticos 1,7,8. Otro límite de grabación ex vivo de tejidos es la interrupción de las conexiones entre las diferentes áreas del cerebro, restringiendo así neuromodulations dinámicos. Esto puede explicar por qué en tal tejido ningún caso-ictal como se registra de manera espontánea, sino que requiere que se activará por la manipulación farmacológica iónico o la mejora de la estimulación de la excitabilidad. Por consiguiente, en este protocolo, eventos que parecen convulsiones se inducen mediante la combinación de un cambio en K + extracelular del 3 al 6 mM y una reducción de Mg 2 + externo de 1,3 mM a Mg 2 + libre ACSF, a fin de aumentar la excitabilidad del tejido y quitar Mg bloque receptor NMDA dependiente de 2+. De hecho, se ha demostrado previamente que la actividad epileptiforme inducida en rodajas neocorticales y del hipocampo humanos utilizando Mg 2 + libre ACSF se asemeja a las crisis electroencefalográficas grabadas in vivo 14. Además,se ha demostrado que las descargas epileptiformes obtenidos en rebanadas del lóbulo temporal se vuelven resistentes a los anticonvulsivos utilizados clínicamente después de la exposición prolongada a Mg 2 + libre ACSF 15,16, proporcionando así un modelo para investigar los acontecimientos parecen convulsiones farmacorresistentes in vitro. AAM permiten la grabación de ambos, los potenciales de campo y actividades de unidades múltiples que consisten en los potenciales de acción neuronales ex vivo. Por lo tanto, los acuerdos ambientales multilaterales son una poderosa herramienta electrofisiológico en comparación con EEG, que exploran los potenciales de campo generados por las actividades síncronas de conjuntos neuronales in vivo, pero no dan acceso a la única neurona comportamientos 17. Aunque microelectrodos más recientes se pueden grabar en vivo las actividades de unidades múltiples que consisten en los potenciales de acción neuronales, que son invasivas, por lo que su uso se restringe sobre todo a propósito de la investigación durante las grabaciones intracraneales. En particular, las grabaciones AMUMA representan una técnica de elecciónpara estudiar los patrones espacio-temporales de eventos epilépticos, los mecanismos que controlan la aparición de convulsiones y la propagación y la acción de los fármacos antiepilépticos clásicos y nuevos. Cabe destacar que, para desentrañar los tipos de células y la base de señalización de las descargas epilépticas, Spike técnicas de clasificación y los ensayos farmacológicos debe ser combinado con las técnicas de los AMUMA. A pesar de los acuerdos ambientales multilaterales pueden dar acceso a los picos individuales, que no proporcionan información sobre las propiedades sinápticas y biofísicos. En el futuro, otras técnicas deben estar acoplados a las grabaciones de los AMUMA con el fin de mejorar el comportamiento de la muestra celular, actividades de la red y la señalización sináptica. Por ejemplo, imágenes de fluorescencia para desentrañar neuronas o células gliales comportamiento, así como la dinámica de iones, se puede combinar con MEA grabaciones. Además el análisis histológico post hoc también puede revelar alteraciones específicas de tipos de células, proteínas o receptores de modo que la ubicación de las actividades epilépticos se puede correlacionar con reordenamientos específicos de laestructura nerviosa. El sistema de los acuerdos ambientales multilaterales también puede ser embebido en un patch-clamp set-up para correlacionar las células individuales o conductancias con las actividades de población. En el futuro, herramientas optogenética también podrían utilizarse, siempre que las rebanadas humanos pueden cultivarse en el largo plazo, tal como se realizó para rebanadas organotípicos, por lo que la transfección o infección de tipos de células específicas se pueden realizar.

La epilepsia es un trastorno crónico en el que los ataques epilépticos, que son vertidos estampadas intermitentes que duran varios segundos a decenas de segundos en (EEG) electroencefalográficos asociados con manifestaciones clínicas, interrumpen un estado interictal, caracterizado por la presencia de descargas neuronales síncronos decenas de milisegundos de duración y llamó eventos interictales 1. Afecta aproximadamente al 1% de la población del mundo y aunque las convulsiones se controlan en la mayoría de los pacientes, aproximadamente un tercio de las personas con epilepsia no muestran respuesta adecuada a los fármacos antiepilépticos 2. En esta condición, llamada epilepsia farmacorresistente y cuyos mecanismos todavía tienen que ser claramente identificado, la resección quirúrgica de la parte específica del cerebro identificada como la zona de crisis de inicio sigue siendo el único tratamiento alternativo que ofrezca un resultado positivo para los pacientes. De este modo, las piezas resecadas de cirugía ceden la oportunidad de estudiar los mecanismos de descargas interictales y la generación y propagación de convulsiones, así como farmacorresistencia en el tejido nervioso central humano viable ex vivo. Multi-electrodo matrices (AAM), que consiste en un arreglo de microelectrodos distribuidos espacialmente, permite la estimulación simultánea y registro de la actividad electrofisiológica de varios sitios de los tejidos, proporcionando así un enfoque excelente para estudiar los patrones espacio-temporales de la actividad espontánea y evocada . Esta técnica, primero aplica para supervisar los cambios en el desarrollo de la actividad de cultivo celular neuronal 3 y luego adaptado para cerebral aguda y organotípicos de médula espinal y las rodajas de 4 - 6, que se considera actualmente una valiosa herramienta de electrofisiológico. El protocolo actual se describe cómo preparar rebanadas corticales humanas de tejido resecado quirúrgicamente y para grabar con los acuerdos ambientales multilaterales fiable ex vivo interictal y eventos que parecen convulsiones de estas rebanadas. Por tanto, esta técnica proporciona una manera de abordar los mecanismos básicos subyacentes actividades epilépticos iniciación, propagación y los efectos de los fármacos antiepilépticos, tanto a nivel celular y de la red. Todos los procedimientos utilizados para obtener, preparar, mantener y registrar rebanadas humanos se describen en detalle aquí.

<table><tbody><tr><td>Cámara de corte de cerebro-2: Interfaz</td><td>AutoMate Scientific, Inc.</td><td>S-BSC2</td><td>Requiere un controlador de temperatura separado</td></tr><tr><td>Controlador de temperatura de 2 canales Sistemas</td><td>multicanal, Alemania</td><td>TC02</td><td>Permite conectar y usar 2 cámaras de interfaz.</td></tr><tr><td>Cable especial para la conexión de TC01 a S-BSC2 con referencia externa PT100</td><td>Multichannel Systems, Alemania</td><td>CA3</td><td>La referencia PT100 se coloca cerca de las rebanadas&nbsp;</td></tr><tr><td>Conector de enchufe de 6 pines con sistemas multicanal PT100</td><td>, Alemania</td><td>TS-PT100</td><td>Referencia externa para cable CA3</td></tr><tr><td>Estación de trabajo MEA para el registro de datos de MEAs de 120 electrodos</td><td>Sistemas multicanal de 120 electrodos, Alemania</td><td>MEA2100-120</td><td>Incluye MEA2100-120 headstage y MEA2100 placa de interfaz. www.multichannelsystems.com</td></tr><tr><td>Mazo de microelectrodos para sistemas multicanal MEA2100-120</td><td>, Alemania</td><td>120MEA200/30</td><td>Distancia entre electrodos: 200 y micro; m; diámetro del electrodo: 30 y micro; m; Anillo de vidrio: 6 mm de altura. Diferentes configuraciones (espaciado, diámetro, anillo) posibles.</td></tr><tr><td>Mesa de microscopio de vídeo</td><td>Multichannel Systems, Alemania</td><td>MEA-VMT-1</td><td>Mesa con un microscopio de vídeo debajo para obtener imágenes del campo de electrodos de los MEAs en un amplificador colocado encima de la mesa y transferir la imagen a un ordenador.</td></tr><tr><td>Cánula de perfusión</td><td>Multichannel Systems, Alemania</td><td>PH01</td><td>Cánula de perfusión calefactable con sensor de temperatura; la temperatura se puede programar con el controlador TC02</td></tr><tr><td>MC_Rack</td><td>Multichannel Systems, Alemania</td><td></td><td>Software para la adquisición y el registro de datos</td></tr><tr><td>Soporte de perfusión magnética</td><td>Sistemas multicanal, Alemania</td><td>MPH</td><td>Soporte de perfusión magnética para el elemento PH01 para fijar la cánula de perfusión y conectar el sistema de perfusión a la tierra del amplificador</td></tr><tr><td>Neuroexplorer</td><td>Nex Technologies</td><td></td><td>Software para el análisis de datos; info@neuroexplorer.com</td></tr><tr><td>Bomba peristáltica (unidad de accionamiento)</td><td>Gilson</td><td>F155001</td><td>0,01 a 48 rp</td></tr><tr><td>Bomba peristáltica (cabezal de bomba)</td><td>Gilson</td><td>F117800</td><td>R2 de dos canales</td></tr><tr><td>Aspirador ultrasónico</td><td>Integra Life sciences, EE. UU.</td><td>Cusa Excel +</td><td>Permite la disección subpial roma de la corteza</td></tr><tr><td>Neuronavegación</td><td>Isis Solutions, Francia</td><td>Surgiscope</td><td>Permite la identificación en tiempo real de la estructura cerebral en la resonancia magnética preoperatoria</td></tr><tr><td>Vibratome HM 650 V</td><td>Microm</td><td></td><td>Block cortado en 400 &mu; m de rodajas gruesas</td></tr></tbody></table>

multi-electrodos grabaciones variedad de epilepsia humana postoperatoria cortical del tejido

Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue

Epilepsia, afecta a alrededor del 1% de la población, comprende un grupo de trastornos neurológicos caracterizados por la aparición periódica de convulsiones, que alteran la función normal del cerebro. A pesar del tratamiento con fármacos antiepilépticos disponibles actualmente dirigido funciones neuronales, un tercio de los pacientes con epilepsia farmacorresistente son. En esta condición, la resección quirúrgica de la zona del cerebro generando convulsiones sigue siendo el único tratamiento alternativo. El estudio de los tejidos epilépticos humanos ha contribuido a entender los nuevos mecanismos epileptogénicas durante los últimos 10 años. De hecho, estos tejidos generan descargas epilépticas interictales espontáneos, así como eventos ictales inducida farmacológicamente-que se pueden grabar con técnicas de electrofisiología clásicos. Sorprendentemente, las matrices de múltiples electrodos (MEA), que son dispositivos microfabricados incrustación de una matriz de microelectrodos espacialmente dispuestas, ofrecen la oportunidad única de estimular simultáneamente y registro pote campontials, así como los potenciales de acción de múltiples neuronas de diferentes áreas del tejido. Así AMUMA grabaciones ofrecen un excelente enfoque para estudiar los patrones espacio-temporales de interictal espontánea y eventos que parecen convulsiones evocados y los mecanismos que subyacen a la aparición de convulsiones y la propagación. Aquí se describe cómo preparar rebanadas corticales humanas de tejido resecado quirúrgicamente y para grabar con los acuerdos ambientales multilaterales y interictales-ictales como eventos ex vivo.

El registro de la actividad rebanada cortical humano comienza mientras que la perfusión del tejido con ACSF grabación normal (como se describió previamente) 7,8. En esta condición, cuando el tejido está bien conservado durante la cirugía y más tarde durante la transferencia de tejido de la preparación hospital y rebanada, se puede observar la actividad espontánea, en la forma de pequeños eventos-interictales similares, detectados a partir de pequeños grupos de electrodos MEA. Descargas de interictales como consistieron en un potencial de campo, por lo general bifásica, que comprende una desviación negativa agudo inicial, llegando a decenas de microvoltios, seguido de un frente de onda más larga duración de varias decenas de milisegundos. Actividades de unidades múltiples Fast son generalmente incrustadas en el potencial de campo principalmente en la parte inicial. Un ejemplo representativo de la actividad interictal como se ilustra en la Figura 3Aii, donde se muestra la traza registrada por un electrodo MEA. Para grabar las crisis epilépticas de envitro rodajas corticales humanos, es necesario para perfundir con un ACSF "epileptógena", en el que Mg 2+ está ausente y K + se eleva a 6 mM, para aumentar la excitabilidad del tejido 1 (el aumento de K + del 3 al 6 mM por sí sola no es suficiente para inducir convulsiones; datos no presentados). Una vez que la perfusión con 0 Mg 2+ 6 mM K + ACSF ha comenzado, la actividad de las rebanadas corticales aumenta gradualmente y la primera convulsión aparece dentro de 15 a 20 min (15,4 ± 1,7 min, n = 10, a partir de 5 pacientes; la Figura 3 Ai ). Evocamos actividad ictal similares, como se muestra en la Figura 3, en el 75% de los pacientes probados y en el 66,7% de todas las rebanadas grabados. Actividades epilépticas se registran a partir de electrodos adyacentes del chip de MEA, y la comparación de la dinámica de aparición de eventos potenciales de campo permite el estudio de su sitio de génesis y propagación. Una convulsión representante registrado de una rebanada de zumbidouna corteza cerebral con el sistema de MEA se muestra en la Figura 3B (una traza representante de una convulsión registrada por un solo electrodo MEA se muestra en mayor resolución temporal en la Figura 3 AIII). Tenga en cuenta que la toma se graba desde casi todos los electrodos del chip MEA, lo que indica que es capaz de propagar a una gran área cortical. Además, mirando a las trazas individuales registradas de cada electrodo, es posible observar la propagación progresiva de la toma a través del tejido: de hecho, comienza primero en la zona cortical que cubre la mitad derecha de la matriz de electrodos, y se propaga gradualmente a el área que cubre la mitad izquierda (.. i e, comparar los rastros de L6 electrodo y B6; Figura 3B). <img alt="Figura 1" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51870/51870fig1highres.jpg" width="300"> Figura 1: A una displasia cortical. d su extirpación quirúrgica de tipo A Taylor displasia cortical focal (flecha blanca) incrustado en un surco lóbulo frontal izquierdo se visualiza en la resonancia magnética preoperatoria (A), y más tarde confirmado por examen histológico etiquetado quinasa (B) MAP; barra de escala: 200 micras) que muestra una dyslamination cortical, las neuronas anormales y una pista en las neuronas con una migración incompleta en la sustancia blanca inferior. Durante la cirugía, la displasia se localiza de acuerdo con los datos de resonancia magnética con un sistema de neuronavegación (C). Visualización de la circunvolución que contienen la displasia durante la cirugía (D). <img alt="Figura 2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51870/51870fig2highres.jpg" width="400"> Figura 2:. Equipo y procedimiento para la preparación rebanada cortical humana Una cámara de interfaz se utiliza para mantener las rebanadas corticales humanas ex vivo (A); el resto rebanadas en una hoja de tejido del cristalino en el área plana en la parte superior de la cámara (B), donde un sensor de temperatura (C, izquierda), conectado a un controlador de temperatura (C, derecha, arriba) a través de un doble cable de composición (C, derecha, abajo), se coloca para mantener 37 ° C durante todo el tiempo de incubación rebanada. Una vez obtenido, colocar el bloque de tejido resecado en una placa de Petri llena de helado ACSF base de sacarosa (D) y eliminar los coágulos sanguíneos, los vasos y meninges, para facilitar el corte en lonchas. Si el bloque de tejido es más grande que las cámaras de los AMUMA, aislar una pieza de dimensiones adecuadas con una cuchilla (E) y pegarla en la placa muestra vibratome (F). Cortar rodajas gruesas 400 micras y con la ayuda de una espátula (G) transferirlos en pedazos de tejido del cristalino (H) e incubar en la cámara de interfaz (I). Antes de grabar, remove el tejido de la lente sumergiendo la rebanada en una placa de Petri llena de ACSF y transferirlo a un chip de MEA ACSF lleno con una espátula (J). Retire la solución para que el corte se adhieren sobre la MEA (K) y mantenerlo en posición mediante el uso de un ancla de platino. Coloque el MEA en el amplificador (L), iniciar la perfusión y la grabación. <img alt="Figura 3" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51870/51870fig3highres.jpg" width="300"> Figura 3: MEA grabaciones de las crisis epilépticas en rebanadas corticales humanos (A) Un representante rastro de la actividad cortical rebanada humana registrada por un electrodo MEA se muestra en el panel i.. En presencia de ACSF normal, es posible observar la actividad-interictal como espontánea (pequeño rectángulo gris, ampliada en el panel ii); luego, cuando se ha iniciado la perfusión con 0 Mg 2 + 6 mM de K + ACSF, la primera seizure aparece después de un minuto de retraso ~ 15 y es seguido por otros eventos en 2-3 intervalo min. Panel III muestra la incautación en el gran rectángulo gris en el panel i con una escala ampliada. El trazo azul ilustra un zoom de la actividad, tal como se indica por la línea azul y la flecha. Panel IV) muestra los datos ilustrados en Panel III) de paso alto filtradas a 250 Hz, que revelan la actividad de varias unidades con un zoom (traza azul). (B) de grabación Representante de una convulsión en presencia de Mg 2 + 0 6 mM de K + ACSF de todos los electrodos MEA. Cada cuadro representa un electrodo de 12 x 12 matriz de MEA y muestra una ventana de tiempo de 80 seg; la línea de puntos indica la posición de la superficie cortical relativamente al conjunto MEA.

Estamos aquí describimos cómo realizar múltiples grabaciones de electrodos de matriz de tejido cortical humano epiléptico. Resección del tejido epiléptico, preparación rebanada y matriz de electrodos múltiples grabaciones de eventos interictales y ictales se demuestran en detalle.

Multi-electrodos Grabaciones variedad de epilepsia humana postoperatoria cortical del tejido

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which ...

El objetivo general de este procedimiento es realizar registros de múltiples electrodos de eventos ex vivo, interictales y similares a convulsiones del tejido cortical epiléptico humano, proporcionando así una forma de abordar los mecanismos básicos que subyacen a las actividades epilépticas, la iniciación, la propagación y los efectos de los fármacos antiepilépticos tanto a nivel celular como de red. Esto se logra primero resecando cuidadosamente el tejido cortical humano de pacientes con epilepsia farmacorresistente durante la cirugía. El segundo paso es eliminar los coágulos de sangre, los vasos y las meninges y el exceso de materia blanca antes de cortar.A continuación, corta el bloque de tejido en rodajas de 400 micras. El paso final es mantener las lonchas en condiciones de interfase de alta oxigenación y temperatura controlada con perfusión lenta. En última instancia, la técnica de matriz de electrodos múltiples se utiliza para registrar la actividad interictal espontánea y los eventos ictales evocados.Nuestro laboratorio investiga el papel de las interacciones neurogliales en la fisiopatología cerebral para estudiar cómo las células neuronales pueden generar actividad patológica de red en humanos. Recientemente hemos establecido registros de matriz de electrodos múltiples de tejido cortical postoperatorio epiléptico humano en colaboración con hospitales de cuidado del cuello y Petri faldo. Hoy, Thomas Blo, neurocirujano del Neck Care Hospital, junto con Feld, epileptólogo e investigador del Lapis Hospital, y Elena DOI, postdoc en mi laboratorio, te demostrarán cómo realizar y hacer un buen uso de estas técnicas.Desde la recolección de tejido epiléptico humano hasta las grabaciones de MEA ex vivo, el uso de la TEC de tejido cortical humano para curar pacientes epilépticos permite la exploración directa de las neuronas epilépticas humanas y las células gliales mantenidas funcionalmente, que están interconectadas en redes específicas. En las investigaciones in vitro, un tejido humano da acceso a células individuales y a actividades de red, mecanismos basados en iónicos, que no se pueden abordar completamente in vivo. El registro MEA del tejido cortical humano puede ayudar a responder una pregunta clave en el campo de la epilepsia, como los mecanismos celulares que subyacen a la exogénesis y a la propagación de las convulsiones.Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la epilepsia lesional y su tratamiento, ya que permite comprender los mecanismos de la farmacorresistencia y el efecto del fármaco antiepiléptico sobre el evento convulsivo registrado en los cortes corticales humanos. In vitro. La principal ventaja de las electromatrices multidireccionales sobre los métodos existentes como e, e, g, o los microelectrodos in vivo, es que permiten la estimulación y el registro simultáneos y no invasivos de los potenciales de campo y la actividad de varias unidades desde varios lados del tejido.Para comenzar el procedimiento, prepare la cámara de interfaz llenando primero la sección inferior con agua destilada. A continuación, conecte la cámara a una fuente de carbógeno. A continuación, corte un trozo de papel de lente para que quepa en el área plana de la cámara de corte.Colóquelo junto al tubo de entrada para permitir que las burbujas escapen de la línea de entrada antes de llegar a las rebanadas. Después de eso, corta dos trozos de hilo de algodón trenzado con la misma longitud que el trozo de tejido de la lente. Colóquelos a los lados del área plana de la cámara, ajuste el caudal de la bomba peristáltica a un mililitro por minuto.A continuación, encienda la oxigenación del agua en la parte inferior de la cámara. Luego configure el controlador de temperatura a 37 grados Celsius. Cubra la parte superior de la cámara de interfaz con un trozo de paraforma y espere al menos 30 minutos para que la temperatura aumente y se estabilice.Ahora, prepara las herramientas de disección, que incluyen dos pinzas finas, una espátula, una cuchara pequeña y una cuchilla, dos placas de Petri de vidrio, dos pinceles y el pegamento de cianoacrilato. A continuación, prepare el vibrato configurando los parámetros para el corte. En este procedimiento, retire el CSF A a base de sacarosa preparado del congelador a menos 80 grados Celsius y tritúrelo hasta convertirlo en granizado.Oxigenarlo con cárgeno. Luego, transfiera 250 mililitros de granizado de líquido cefalorraquídeo A a una botella de vidrio y manténgala en una botella llena de hielo para la recolección de tejido en la sala de cirugía. Bajo anestesia general estándar, utilice un sistema de neuronavegación para permitir una localización precisa de la corteza.Después, haz una incisión en la piel, luego crea un agujero en el hueso, seguido de una craneotomía. A continuación, eleve suavemente el colgajo de hueso y abra la duramadre con unas tijeras. Posteriormente realizar la resección en bloque de la corteza epiléptica y evitar la coagulación extensa.Corta un bloque cortical de un centímetro de grosor y colócalo en el líquido cefalorraquídeo A a base de sacarosa oxigenada congelada. Posteriormente, transfiera el tejido en un líquido cefalorraquídeo A congelado a base de sacarosa al laboratorio lo más rápido posible, pero evitando choques mecánicos. Ahora, llene una placa de Petri y la bandeja tampón de vibrato con el granizado de LCR A oxigenado a base de sacarosa y continúe oxigenando el granizado de LCR A con carbógeno.Luego, saque con cuidado el pañuelo de la botella con una cuchara y colóquelo en la placa de Petri. Con las pinzas, retire con cuidado los coágulos de sangre, los vasos sanguíneos y las meninges para evitar resistencia durante el corte. Corte el lado del tejido con una cuchilla para obtener una superficie plana lo más paralela posible al lado opuesto del tejido.A continuación, pegue el tejido en la placa de muestra de vibrato para preparar cortes corticales transversales. Posteriormente, colócalo en la bandeja tampón y corta rodajas de 400 micras de grosor a baja velocidad. A continuación, corte algunos trozos de tejido de la lente con una espátula y un pincel.Transfiera estos trozos de tejido del cristalino a la cámara de interfaz. Incubarlos a 37 grados centígrados durante al menos una hora antes de grabarlos. En este procedimiento, conecte el sistema de perfusión a una bomba peristáltica y el sistema MEA a una computadora.A continuación, coloque un chip MEA vacío dentro del amplificador. A continuación, configure el controlador de temperatura para calentar el elemento de la cánula en la cámara MEA a 37 grados centígrados. Iniciar la perfusión del líquido cefalorraquídeo A oxigenado a cinco o seis mililitros por minuto.Después de eso, abra el software de grabación. Asegúrese de que todos los electrodos MEA estén bien conectados y que no haya ruido debido a la perfusión. Ahora vierta un poco de CSF de grabación caliente en una placa de Petri de vidrio.Transfiera un corte de la cámara de interfaz a la placa de Petri agarrando el tejido de la lente. A continuación, separe con cuidado la rodaja del tejido sumergiéndola en la solución, o utilice un cepillo pequeño para facilitar el desprendimiento. A continuación, llene el chip MEA con un poco de CSF A.Transfiera la rebanada al chip MEA con una espátula con una pipeta de plástico. Retire suavemente la solución para que la rebanada se adhiera al área del electrodo y manténgala en su lugar con un anclaje de platino. Después de eso, agregue un mililitro de grabación de un CSF al chip MEA y colóquelo en el amplificador.Luego inicie la perfusión a cinco o seis mililitros por minuto. A continuación, compruebe la posición del corte en el área de grabación MEA. Mediante el uso del software del monitor MEA, ajústelo si es necesario.Para grabar desde las capas corticales y tomar una foto, inicie la grabación. Se trata de una traza representativa de la actividad del corte cortical humano registrada por un electrodo MEA. En el LCR A normal, es posible observar una actividad interictal espontánea 15 minutos después de la perfusión con LCR de potasio A de seis milimolares libres de magnesio.Aparece la primera convulsión y es seguida por otros eventos a intervalos de dos a tres minutos. El trazo azul ilustra la actividad ampliada. Este panel muestra los datos de paso alto filtrados a 250 hercios, lo que revela la actividad de múltiples unidades cuando se amplía aquí hay una grabación representativa de una convulsión de todos los electrodos MEA sin magnesio.Seis milimolares de potasio A en LCR. Cada cuadrado representa un electrodo de 12 por 12 MEA y muestra una ventana de tiempo número 82. La línea punteada indica la posición de la superficie cortical en relación con la matriz MEA.Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo transportar de manera segura el tejido cortical humano, preparar y almacenar la psoriasis cortical viable y realizar registros de MEA de actividades epilépticas espontáneas e inducidas Al intentar este procedimiento, es importante tener una estrecha colaboración entre el equipo clínico del hospital y los investigadores en el laboratorio. Nunca olvide que trabajar con tejido humano puede ser peligroso, y siempre se debe tomar protección, como el uso de guantes para evitar cualquier posible enfermedad infecciosa después de este procedimiento. Otras técnicas, como las imágenes de fluorescencia, la lámpara de parche, el registro, la clasificación de picos y el análisis histológico, se pueden acoplar a los registros de EMA para correlacionar las propiedades sinápticas, el comportamiento de una sola célula, la dinámica iónica y las anomalías celulares y moleculares con las actividades de la población.La realización de registros de MEA de tejidos epilépticos humanos puede allanar el camino para que los investigadores exploren las epilepsias lesionales con el fin de aclarar los mecanismos subyacentes a la exogénesis y la resistencia a los fármacos, así como el papel de la interacción neuroglial en este fenómeno. Gracias por mirar y buena suerte con tu experimento.

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