Multi-electrodos Grabaciones variedad de epilepsia humana postoperatoria cortical del tejido

El objetivo general de este procedimiento es realizar registros de múltiples electrodos de eventos ex vivo, interictales y similares a convulsiones del tejido cortical epiléptico humano, proporcionando así una forma de abordar los mecanismos básicos que subyacen a las actividades epilépticas, la iniciación, la propagación y los efectos de los fármacos antiepilépticos tanto a nivel celular como de red. Esto se logra primero resecando cuidadosamente el tejido cortical humano de pacientes con epilepsia farmacorresistente durante la cirugía. El segundo paso es eliminar los coágulos de sangre, los vasos y las meninges y el exceso de materia blanca antes de cortar.

A continuación, corta el bloque de tejido en rodajas de 400 micras. El paso final es mantener las lonchas en condiciones de interfase de alta oxigenación y temperatura controlada con perfusión lenta. En última instancia, la técnica de matriz de electrodos múltiples se utiliza para registrar la actividad interictal espontánea y los eventos ictales evocados.

Nuestro laboratorio investiga el papel de las interacciones neurogliales en la fisiopatología cerebral para estudiar cómo las células neuronales pueden generar actividad patológica de red en humanos. Recientemente hemos establecido registros de matriz de electrodos múltiples de tejido cortical postoperatorio epiléptico humano en colaboración con hospitales de cuidado del cuello y Petri faldo. Hoy, Thomas Blo, neurocirujano del Neck Care Hospital, junto con Feld, epileptólogo e investigador del Lapis Hospital, y Elena DOI, postdoc en mi laboratorio, te demostrarán cómo realizar y hacer un buen uso de estas técnicas.

Desde la recolección de tejido epiléptico humano hasta las grabaciones de MEA ex vivo, el uso de la TEC de tejido cortical humano para curar pacientes epilépticos permite la exploración directa de las neuronas epilépticas humanas y las células gliales mantenidas funcionalmente, que están interconectadas en redes específicas. En las investigaciones in vitro, un tejido humano da acceso a células individuales y a actividades de red, mecanismos basados en iónicos, que no se pueden abordar completamente in vivo. El registro MEA del tejido cortical humano puede ayudar a responder una pregunta clave en el campo de la epilepsia, como los mecanismos celulares que subyacen a la exogénesis y a la propagación de las convulsiones.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la epilepsia lesional y su tratamiento, ya que permite comprender los mecanismos de la farmacorresistencia y el efecto del fármaco antiepiléptico sobre el evento convulsivo registrado en los cortes corticales humanos. In vitro. La principal ventaja de las electromatrices multidireccionales sobre los métodos existentes como e, e, g, o los microelectrodos in vivo, es que permiten la estimulación y el registro simultáneos y no invasivos de los potenciales de campo y la actividad de varias unidades desde varios lados del tejido.

Para comenzar el procedimiento, prepare la cámara de interfaz llenando primero la sección inferior con agua destilada. A continuación, conecte la cámara a una fuente de carbógeno. A continuación, corte un trozo de papel de lente para que quepa en el área plana de la cámara de corte.

Colóquelo junto al tubo de entrada para permitir que las burbujas escapen de la línea de entrada antes de llegar a las rebanadas. Después de eso, corta dos trozos de hilo de algodón trenzado con la misma longitud que el trozo de tejido de la lente. Colóquelos a los lados del área plana de la cámara, ajuste el caudal de la bomba peristáltica a un mililitro por minuto.

A continuación, encienda la oxigenación del agua en la parte inferior de la cámara. Luego configure el controlador de temperatura a 37 grados Celsius. Cubra la parte superior de la cámara de interfaz con un trozo de paraforma y espere al menos 30 minutos para que la temperatura aumente y se estabilice.

Ahora, prepara las herramientas de disección, que incluyen dos pinzas finas, una espátula, una cuchara pequeña y una cuchilla, dos placas de Petri de vidrio, dos pinceles y el pegamento de cianoacrilato. A continuación, prepare el vibrato configurando los parámetros para el corte. En este procedimiento, retire el CSF A a base de sacarosa preparado del congelador a menos 80 grados Celsius y tritúrelo hasta convertirlo en granizado.

Oxigenarlo con cárgeno. Luego, transfiera 250 mililitros de granizado de líquido cefalorraquídeo A a una botella de vidrio y manténgala en una botella llena de hielo para la recolección de tejido en la sala de cirugía. Bajo anestesia general estándar, utilice un sistema de neuronavegación para permitir una localización precisa de la corteza.

Después, haz una incisión en la piel, luego crea un agujero en el hueso, seguido de una craneotomía. A continuación, eleve suavemente el colgajo de hueso y abra la duramadre con unas tijeras. Posteriormente realizar la resección en bloque de la corteza epiléptica y evitar la coagulación extensa.

Corta un bloque cortical de un centímetro de grosor y colócalo en el líquido cefalorraquídeo A a base de sacarosa oxigenada congelada. Posteriormente, transfiera el tejido en un líquido cefalorraquídeo A congelado a base de sacarosa al laboratorio lo más rápido posible, pero evitando choques mecánicos. Ahora, llene una placa de Petri y la bandeja tampón de vibrato con el granizado de LCR A oxigenado a base de sacarosa y continúe oxigenando el granizado de LCR A con carbógeno.

Luego, saque con cuidado el pañuelo de la botella con una cuchara y colóquelo en la placa de Petri. Con las pinzas, retire con cuidado los coágulos de sangre, los vasos sanguíneos y las meninges para evitar resistencia durante el corte. Corte el lado del tejido con una cuchilla para obtener una superficie plana lo más paralela posible al lado opuesto del tejido.

A continuación, pegue el tejido en la placa de muestra de vibrato para preparar cortes corticales transversales. Posteriormente, colócalo en la bandeja tampón y corta rodajas de 400 micras de grosor a baja velocidad. A continuación, corte algunos trozos de tejido de la lente con una espátula y un pincel.

Transfiera estos trozos de tejido del cristalino a la cámara de interfaz. Incubarlos a 37 grados centígrados durante al menos una hora antes de grabarlos. En este procedimiento, conecte el sistema de perfusión a una bomba peristáltica y el sistema MEA a una computadora.

A continuación, coloque un chip MEA vacío dentro del amplificador. A continuación, configure el controlador de temperatura para calentar el elemento de la cánula en la cámara MEA a 37 grados centígrados. Iniciar la perfusión del líquido cefalorraquídeo A oxigenado a cinco o seis mililitros por minuto.

Después de eso, abra el software de grabación. Asegúrese de que todos los electrodos MEA estén bien conectados y que no haya ruido debido a la perfusión. Ahora vierta un poco de CSF de grabación caliente en una placa de Petri de vidrio.

Transfiera un corte de la cámara de interfaz a la placa de Petri agarrando el tejido de la lente. A continuación, separe con cuidado la rodaja del tejido sumergiéndola en la solución, o utilice un cepillo pequeño para facilitar el desprendimiento. A continuación, llene el chip MEA con un poco de CSF A.

Transfiera la rebanada al chip MEA con una espátula con una pipeta de plástico. Retire suavemente la solución para que la rebanada se adhiera al área del electrodo y manténgala en su lugar con un anclaje de platino. Después de eso, agregue un mililitro de grabación de un CSF al chip MEA y colóquelo en el amplificador.

Luego inicie la perfusión a cinco o seis mililitros por minuto. A continuación, compruebe la posición del corte en el área de grabación MEA. Mediante el uso del software del monitor MEA, ajústelo si es necesario.

Para grabar desde las capas corticales y tomar una foto, inicie la grabación. Se trata de una traza representativa de la actividad del corte cortical humano registrada por un electrodo MEA. En el LCR A normal, es posible observar una actividad interictal espontánea 15 minutos después de la perfusión con LCR de potasio A de seis milimolares libres de magnesio.

Aparece la primera convulsión y es seguida por otros eventos a intervalos de dos a tres minutos. El trazo azul ilustra la actividad ampliada. Este panel muestra los datos de paso alto filtrados a 250 hercios, lo que revela la actividad de múltiples unidades cuando se amplía aquí hay una grabación representativa de una convulsión de todos los electrodos MEA sin magnesio.

Seis milimolares de potasio A en LCR. Cada cuadrado representa un electrodo de 12 por 12 MEA y muestra una ventana de tiempo número 82. La línea punteada indica la posición de la superficie cortical en relación con la matriz MEA.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo transportar de manera segura el tejido cortical humano, preparar y almacenar la psoriasis cortical viable y realizar registros de MEA de actividades epilépticas espontáneas e inducidas Al intentar este procedimiento, es importante tener una estrecha colaboración entre el equipo clínico del hospital y los investigadores en el laboratorio. Nunca olvide que trabajar con tejido humano puede ser peligroso, y siempre se debe tomar protección, como el uso de guantes para evitar cualquier posible enfermedad infecciosa después de este procedimiento. Otras técnicas, como las imágenes de fluorescencia, la lámpara de parche, el registro, la clasificación de picos y el análisis histológico, se pueden acoplar a los registros de EMA para correlacionar las propiedades sinápticas, el comportamiento de una sola célula, la dinámica iónica y las anomalías celulares y moleculares con las actividades de la población.

La realización de registros de MEA de tejidos epilépticos humanos puede allanar el camino para que los investigadores exploren las epilepsias lesionales con el fin de aclarar los mecanismos subyacentes a la exogénesis y la resistencia a los fármacos, así como el papel de la interacción neuroglial en este fenómeno. Gracias por mirar y buena suerte con tu experimento.