Análisis de los cambios de expresión génica en la Rata Hippocampus Después de la estimulación cerebral profunda del tálamo anterior Núcleo

El objetivo general de este procedimiento es realizar una estimulación cerebral profunda del núcleo talámico anterior y estudiar los cambios en la expresión génica en el hipocampo de la rata. Esto se logra anestesiando primero al animal. A continuación, se prepara al animal para la cirugía.

Se hace una incisión en el cuero cabelludo y se expone el cráneo. Luego, en la posición correcta en relación con el bgma, se hacen los agujeros de fresa. Se insertan los electrodos DBS y se lleva a cabo la estimulación.

Finalmente, se sacrifica al animal y se disecciona el cerebro. Para eliminar el hipocampo, el tejido se procesa para la extracción de ARN y se lleva a cabo la preparación de CDNA y QPCR. En última instancia, los resultados demuestran que la estimulación cerebral profunda influye en la expresión génica en el hipocampo de la rata.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la cirugía de estimulación cerebral profunda, como ¿cuáles son los mecanismos moleculares que subyacen al efecto terapéutico de la cirugía de estimulación cerebral profunda? Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el tratamiento no solo de la epilepsia, sino también de otras afecciones neuronales como la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer y la distonía. Debido a que el DPS está emergiendo como un enfoque quirúrgico para tratar muchos trastornos neuronales Para prepararse para la cirugía, use almohadillas quirúrgicas para cubrir el banco de trabajo y asegúrese de que haya una eliminación de desechos de riesgo biológico disponible.

Pese la rata y calcule la dosis de anestesia de acuerdo con el protocolo de texto montura y asegure dos electrodos en el portaelectrodos de un marco quirúrgico estereotáctico y, con un microscopio, inspeccione las puntas del electrodo para verificar que estén correctamente alineadas. Asegure los electrodos a tres milímetros de distancia, teniendo cuidado de no tocar la punta del electrodo en superficies duras. Inyecta la ketamina xilacina.

Mezclar intraperitoneal al animal y confirmar que el animal ha alcanzado un plano quirúrgico de anestesia comprobando el reflejo de pinzamiento del dedo del pie, la frecuencia respiratoria y la profundidad y regularidad de la respiración. Asegure y coloque al animal en el marco estereotáctico. Aplique lubricante ocular a los ojos del animal para protegerlos de la sequedad excesiva y desinfecte el cuero cabelludo con tres exfoliantes alternos, cada uno de Betadine y alcohol o solución salina estéril.

Coloque al animal sobre una almohadilla de agua tibia circulante o use lámparas de calefacción para mantener la temperatura corporal del animal en un nivel óptimo. Sobre la base del atlas cerebral de ratas de Paxos y Watson, utilice las siguientes coordenadas estereotácticas para dirigirse al núcleo talámico anterior o a un NT anterior posterior negativo de 1,6 milímetros. Media lateral 1,5 milímetros y dorso ventral 5,2 milímetros.

A continuación, haga una incisión en el cuero cabelludo sagital para revelar el cráneo Con un par de retractores, asegure el cuero cabelludo inciso para exponer el cráneo. Luego, con hisopos estériles humedecidos en etanol, limpie la región incisa para exponer las suturas con claridad. Ubique el bgma y use un marcador negro para comercializar para guiar la posición de los orificios de las fresas.

Haz dos marcas más a aproximadamente 1,5 milímetros. Media lateralmente a ambos lados de la sutura sagital y 1,6 milímetros posterior a la sutura coronal. Ahora, para hacer los dos orificios, use etanol para desinfectar la punta del taladro.

Usando un taladro sostenido en un ángulo de 45 grados, perfore los orificios de la fresa cambiando con frecuencia entre los dos orificios para evitar el calor excesivo en el centro de cualquiera de los orificios de la fresa. Continúe perforando hasta que la duramadre quede expuesta. Con una aguja con la punta doblada en forma de L, retire cualquier trozo de hueso roto que obstruya la inserción del electrodo.

Tenga cuidado de evitar dañar la duramadre subyacente o el tejido cerebral mientras extrae los fragmentos de hueso. Fije el conjunto de electrodo doble al mango giratorio del marco estereotáctico y fije el mango en un ángulo de 90 grados. Usando los ajustes en el marco estereotáctico, coloque el electrodo izquierdo exactamente por encima del bgma.

Uso de los ajustes estereotácticos para los medios. El posicionamiento lateral movió con precisión el electrodo izquierdo 1,5 milímetros hacia el lado izquierdo de bgma, de modo que ahora hay dos electrodos perfectamente alineados a lo largo de la sutura coronal, pero espaciados. Media de 1,5 milímetros lateralmente desde el BGMA.

Luego, con los ajustes estereotácticos anteroposterior, mueva los electrodos 1,6 milímetros detrás de la sutura coronal. Luego, con los ajustes de la ventral dorsal, baje los electrodos para verificar primero si los orificios de la fresa se han hecho en la ubicación correcta, de modo que los electrodos se puedan insertar con facilidad sin tocar los bordes ásperos de los orificios de la fresa. Si es así, inserte los electrodos a una profundidad de 5,2 milímetros de la superficie del cráneo.

Conecte los electrodos a través de cables a un estimulador configurado a 130 hercios, 2,5 voltios y 90 microsegundos de ancho de pulso. Proporcionar estimulación de alta frecuencia durante un período de tiempo deseado. Realización de estimulación unilateral o bilateral.

Una vez realizada la estimulación, retire cuidadosamente los electrodos y, con tres suturas cero o grapas quirúrgicas estériles, suture la incisión, administre buprenorfina por vía subcutánea y controle al animal hasta que vuelva a su actividad normal, y luego devuélvalo al alojamiento. Coloque el cerebro en una matriz cerebral acrílica preenfriada sobre hielo con una cuchilla de afeitar. Corta el cerebro en el corly a aproximadamente siete u ocho milímetros del borde más anterior del cerebro.

Haga un segundo corte corly y posterior al primer corte para que se pueda quitar una rebanada de cerebro de aproximadamente cinco milímetros de grosor. Transfiera la rebanada de cerebro a una placa de Petri con PBS helada con una cuchilla de afeitar, corte las dos secciones semiesféricas y tenga cuidado de anotar qué sección corresponde a los lados izquierdo y derecho respectivamente. Con pinzas finas y tijeras, retire con cuidado el destello del hipocampo, congele el tejido en hielo seco y almacene a menos 20 grados centígrados hasta que esté listo para los siguientes pasos de ARN realizados de acuerdo con el protocolo de texto que se muestra aquí es los niveles relativos de expresión de BDNF en comparación con el gen de control beta actina en los puntos de tiempo indicados.

Estimulación posterior a la DBS. La regulación positiva del BDNF se observa inmediatamente después de la cirugía de DBS, junto con la expresión máxima a las tres horas después de la estimulación. Esta observación sugiere que una mayor expresión de BDNF y la neuroprotección resultante podrían contribuir al beneficio terapéutico de la ECP para los pacientes epilépticos.

Este panel ilustra la expresión del receptor GABA, G-A-B-R-D, que muestra una mayor expresión en los animales estimulados en comparación con los controles no estimulados a las tres horas después de la DBS. Teniendo en cuenta que los agonistas del GABA se utilizan como supresores eficaces de las convulsiones, es interesante observar una mayor expresión de G-A-B-R-D después de la ECP, lo que implica un posible papel del GABA y el efecto antiepiléptico de la ECP. Siguiendo este procedimiento.

Se pueden realizar otros métodos como el bloqueo occidental, la inmunoprecipitación de cromatina y muchos otros ensayos biológicos moleculares estándar. Esto ayuda a responder preguntas relacionadas con cambios en la expresión de proteínas, modificaciones postraduccionales, ocupación de factores de transcripción en regiones específicas de promotores de genes, etcétera. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar una cirugía de estimulación cerebral profunda en ratas.

Aísle el tejido del hipocampo y analícelo en busca de cambios en la expresión génica.