Name: Análisis de los cambios de expresión génica en la Rata Hippocampus Después de la estimulación cerebral profunda del tálamo anterior Núcleo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Aprende a realizar estimulación cerebral profunda del núcleo talámico anterior en ratas Wistar y analizar cambios de expresión génica en el hipocampo mediante RT-PCR cuantitativa. Este método permite estudiar los mecanismos moleculares de la DBS.

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Declaración de Ética: NOTA: Todos los procedimientos discutidos en este manuscrito son de acuerdo con las directrices del NIH para la Investigación Animal (Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio) y son aprobados por el Comité CICUAL Escuela de Medicina de Harvard. Preparación 1. Pre-quirúrgico <ol><li> Asegúrese de que todos los instrumentos quirúrgicos se esterilizan mediante autoclave o bien mediante la limpieza con solución y / o etanol antiséptico según sea necesario. Siempre que sea posible, utilizar equipo desechable estéril tal como bisturís, agujas y jeringas. </li><li> Cubra la mesa de trabajo con paños quirúrgicos y asegúrese de que hay una eliminación de residuos de riesgo biológico disponible. </li><li> Pese la rata y el cálculo de la dosis de anestesia. Use una mezcla / xilazina ketamina (ketamina 75 mg / kg y xilazina 10 mg / kg) para anestesiar a las ratas. NOTA: Entre 200-250 g es el peso óptimo para la fijación adecuada del animal en el marco estereotáxico, así como para la orientación precisa de la ATN. Isoflurane también se puede utilizar como el agente anestésico. </li><li> Monte y dos electrodos estériles seguras (esterilizados en autoclave o con óxido de etileno) en el soporte de electrodo (Figura 2) de un bastidor quirúrgico estereotáctica y con la ayuda de un microscopio (magnificación 10-40x), inspeccionan las puntas del electrodo adecuado para alineación. Asegure los dos electrodos 3,0 mm de diferencia. NOTA: Tenga cuidado de no dañar la punta del electrodo tocando en superficies duras. </li></ol> 2. DBS Cirugía <ol><li> Inyectar la ketamina / xilazina mezclar intraperitoneal al animal y confirme que el animal ha alcanzado un plano quirúrgico de anestesia (comprobando el reflejo toe-pinch, la frecuencia respiratoria y la profundidad y la regularidad de la respiración). Quitar el pelo de la región del cuero cabelludo que se realiza una incisión y desinfectar el cuero cabelludo con 3 friega alternantes cada una de betadine y alcohol o solución salina estéril. Asegure y coloque el animal en el fram estereotácticae. </li><li> Utilice circulan pastillas de agua caliente para mantener la temperatura corporal del animal a un nivel óptimo. Aplicar lubricante ocular para los ojos del animal para protegerlo de un secado excesivo. </li><li> Utilice las siguientes coordenadas estereotácticas para dirigir la ATN (anterior núcleo talámico): anterioposterior -1,6 mm, mediolateral 1,5 mm y 5,2 mm dorsoventral 1. NOTA: Las coordenadas estereotáxica se basan en el Paxinos y Watson (6ª edición) rata cerebro atlas 36. </li><li> Hacer una incisión en el cuero cabelludo sagital para revelar el cráneo. El uso de un par de retractores asegurar el cuero cabelludo incisión para exponer el cráneo. Use una solución salina estéril para limpiar la incisión. Si la incisión es demasiado húmedo, utilizar hisopos de algodón estériles que se seque. Busque el bregma y marcar con un marcador negro. Para guiar la posición de los orificios de trepanación, hacen dos marcas más a aproximadamente 1,5 mm mediolateral en ambos lados de la sutura sagital y 1,6 mm posterior a la coronal sutura. </li><li> Use un taladro de mano para hacer los agujeros de trépano. Asegúrese de que la punta del orificio de trépano es estéril mediante la esterilización con etanol. Sostenga el taladro aproximadamente a un ángulo de 45 ° a la superficie del cráneo durante la perforación. Cambiar con frecuencia entre los dos agujeros de trépano para evitar el calor excesivo en el lugar de cualquier trepanación. </li><li> Continúa la perforación hasta que se vea la duramadre. Usando una aguja con su punta doblada asemeja la forma de una &quot;L&quot;, retire los trozos rotos de hueso que pudieran obstruir la inserción del electrodo. Tenga cuidado de no dañar la duramadre y / o tejido cerebral subyacente mientras se quita fragmentos de hueso con la aguja doblada. NOTA: El uso de una aguja roma o fórceps romos finas es también una opción. </li><li> Fijar el conjunto de electrodo dual a la empuñadura giratoria del marco estereotáxico y fijar el mango en un ángulo de 90 °. El uso de los ajustes en el marco estereotáxico, coloque el electrodo izquierdo exactamente encima del bregma. </li><li> Usando el equipo de músicaajustes táctica para posicionamiento mediolateral, se mueven con precisión el electrodo izquierdo 1,5 mm hacia el lado izquierdo de bregma de tal manera que ahora hay dos electrodos perfectamente alineadas a lo largo de la sutura coronal, pero separados en 1,5 mm mediolateral desde el bregma. </li><li> Usando los ajustes estereotácticas anterioposterior, mover los electrodos 1,6 mm posterior a la sutura coronal. </li><li> Utilice los ajustes dorsoventrales para bajar los electrodos a primera verificación si los agujeros de trépano se han hecho en el lugar adecuado de tal manera que los electrodos pueden insertarse con facilidad, sin tocar los bordes ásperos de las trepanaciones. Si es así, insertar los electrodos a una profundidad de 5,2 mm desde la superficie del cráneo. </li><li> Conectar los electrodos a través de cables a un estimulador fijado en 130 Hz, 2,5 V y 90 microsegundos pulsewidth 1. </li><li> Entregar la estimulación de alta frecuencia durante una hora (o durante un período de tiempo deseado según la configuración experimental). Durante el transcurso de la estimulación, recordar para asegurar pprofundidad de la anestesia Roper regularmente mediante la comprobación de la ausencia de retirada de la pata en respuesta a una pizca dedo del pie. Complementar la anestesia con aproximadamente la mitad de la dosis inicial utilizada para inducir la anestesia. Evite la contaminación de los guantes estériles al comprobar la profundidad anestésica y cambiarlos si es necesario. Realice la estimulación unilateral o bilateral basada en las necesidades experimentales de uno. Incluir controles tales como la estimulación de baja frecuencia (por ej., 10 Hz) y animales (sin estimular la inserción de electrodos sin estimulación posterior). </li><li> Después de la estimulación se realiza, retire los electrodos con cuidado y suturar la incisión con 3-0 suturas o con grapas quirúrgicas estériles. </li><li> Administrar buprenorfina (0,05 mg / kg) por vía subcutánea como analgesia. Monitorear el animal hasta que vuelve a la actividad normal y luego regresar a su centro de vivienda. </li><li> Después de un período de tiempo basado en el diseño experimental (por ejemplo, 0, 3, 6 o 12 horas después de la cirugía de DBS), Sacrificar al animal con sobredosis de anestesia. Después de confirmar la ausencia de signos vitales, decapitar al animal. </li><li> Diseccionar el cerebro eliminando primero la piel con unas tijeras. Cortar el hueso largo de la sutura sagital con unas tijeras de disección. Hacer dos incisiones más (alrededor de una pulgada cada una) a través del hueso en ambos lados laterales. El uso de pinzas, levante la pieza cortada parcialmente de hueso de la parte superior del cráneo para exponer el cerebro. </li><li> Con unas tijeras o pinzas finas, desalojar el cerebro del cráneo y transferir a una placa de Petri con PBS frío en hielo. NOTA: Tenga cuidado de evitar daños en el cerebro, mientras que hacer las incisiones a través del hueso. </li></ol> 3. Hippocampus Aislamiento NOTA: Realice todos los pasos posteriores de esta sección en el hielo. <ol><li> Coloque el cerebro en una matriz de cerebro de acrílico pre-enfriado en hielo. Utilizando una hoja de afeitar, cortar el cerebro coronal en aproximadamente 7-8 mm de la anterior-más edge del cerebro. Hacer un segundo corte coronal y posterior a la primera corte de manera que un corte de cerebro de aproximadamente 5 mm de espesor podría ser eliminado. </li><li> Transferir el corte de cerebro a una placa Petri con PBS enfriado con hielo. El uso de hoja de afeitar, cortar las dos secciones semiesféricas y cuidar señalar que hemisferio corresponde a los lados izquierdo y derecho respectivamente. Esto es especialmente importante en el desempeño de estimulaciones unilaterales. </li><li> Utilizando pinzas finas y tijeras eliminar el hipocampo cuidadosamente. </li><li> Flash congelar el tejido del hipocampo en hielo seco y tienda en congelador a -20ºC hasta el momento de las etapas de extracción de ARN posteriores. NOTA: Para el almacenamiento a largo plazo, es recomendable almacenar tejido en un congelador a -80ºC. </li></ol> 4. La extracción de RNA y PCR cuantitativa <ol><li> Asegúrese de que el tejido se mantiene congelada en hielo seco hasta que esté listo para la homogeneización. </li><li> NOTA: Realice este paso en la campana. <ol><li> Añadir 1 ml de reactivo Tri a hippocampal tejido en un tubo de centrífuga de 1,5 ml y homogeneizar por primera pipeteado varias veces hasta que el tejido se rompe en trozos más pequeños. Además homogeneizar el tejido pasando a través de una jeringa con una aguja de 25 G hasta que no haya tejido ininterrumpida visible. Realice los pasos de homogeneización en el hielo. </li><li> Después de homogeneizar el tejido, permite la suspensión de células en reposo a temperatura ambiente durante 5 min para permitir la lisis celular. NOTA: Después de este punto, la suspensión de células puede ser rápido congelado y almacenado en -70 ° C hasta su posterior procesamiento. </li></ol></li><li> Añadir 0,2 ml de cloroformo y se mezcla mediante agitación con vórtex durante 20 segundos y dejar el resto solución a temperatura ambiente durante 15 min. </li><li> Centrifugar las muestras a 12.000 xg durante 15 min a 4 ° C. Después de la centrifugación, quite los tubos cuidadosamente sin molestar a las tres capas separadas que serán visibles. NOTA: La fase inferior (rojo) contiene proteínas, fase nublado media contiene ADN y la fase clara superior contiene RN / A. </li><li> Transferir la fase clara superior (ARN) en un tubo de centrífuga de 1,5 ml fresca (típicamente se obtienen 500 l de ARN que contiene la fase). Para este complemento 0,5 ml de isopropanol y mezclar mediante agitación. Para este complemento 2/3 l de glucógeno (20 mg / ml) como transportista por la ARN. Permita que la muestra para descansar sobre la mesa a temperatura ambiente durante 10 min. </li><li> Centrifugar la muestra a 12.000 xg durante 1 hora a 4 ° C. Asegúrese de que el sedimento de ARN es visible en la parte inferior del tubo. </li><li> Descartar el sobrenadante y lavar el sedimento de ARN mediante la adición de 1 ml de etanol al 75% (hecho con agua libre de nucleasa). Invertir la muestra varias veces hasta que el pellet se desplaza desde el fondo del tubo y flota en la solución. Centrifugar la solución a 12.000 xg durante 10 min a 4 ° C. NOTA: El sedimento en etanol al 75% se puede almacenar a -20 ° C hasta su posterior pasos. </li><li> Permitir que el sedimento de ARN se seque al aire dejando los tubos abierta durante 5 min a temperatura ambiente. Tome precauciones para evitar over secar el pellet ya que esto podría afectar a su disolución en agua en la etapa subsiguiente. </li></ol> 5. Extracción de ADN de la preparación de ARN <ol><li> Añadir 9 l de agua libre de nucleasa al sedimento de ARN y asegúrese de que el sedimento se disuelve antes de proceder suavemente vórtex el tubo. Para esta añada 1 l de 10x ADNasa I Buffer y 1 l de DNasa recombinante (del kit DNasa I), mezclar suavemente con un movimiento rápido de los tubos, brevemente girar los tubos e incubar a 37 ° C en un baño de agua durante 30 minutos. </li><li> Añadir 2 l de reactivo de inactivación de ADNasa (del kit de DNasa I) a la muestra e incubar a temperatura ambiente durante 2 min y se mezcla a menudo por agitando suavemente el tubo. Centrifugar a 12000 xg durante 10 min y la transferencia de aproximadamente 10 l del sobrenadante claro a un tubo de centrífuga de 1,5 ml frescos. </li><li> Medir la concentración de ARN usando un espectrofotómetro NanoDrop o. </li></ol> 6. Hacer ADNc a partir de ARN <ol><li> Añadir º volumen requeridoen contiene 1 g de ARN y llevar el volumen total a 8 l mediante la adición de agua libre de nucleasa. Para este complemento mM dNTP 1 l 10 mezclar y 1 l de hexámeros aleatorios del kit Superíndice primer capítulo de síntesis. Mezclar suavemente y se incuba a 65 ° C durante 5 minutos, ya sea en un baño de agua o en un termociclador preprogramado. </li><li> Hacer una premezcla que contiene los siguientes reactivos: 2 l de 10x tampón de RT, 4 l de 25 M de MgCl 2, 2 l de 0,1 M DTT y 1 l de ARNasa OUT (40 U / l). NOTA: Los volúmenes dados son por reacción, el usuario tendría que aumentar la escala de acuerdo a las necesidades experimentales de uno. </li><li> Después de eliminar el ARN que contiene la muestra de 65 ° C, colocar el tubo a temperatura ambiente durante un minuto. Añadir la solución de premezcla 9 l e incubar a temperatura ambiente durante 2 min. Añadir 1 l de Superscript II enzima transcriptasa inversa (50 U / l) y luego se incuba a temperatura ambiente durante 10 min. </li><li> Incubar las muestras a 42 ° C durante 50min para la transcripción inversa que se produzca. </li><li> Incubar las muestras a 70 ° C durante 15 min para terminar la reacción. </li><li> Colocar las muestras en hielo brevemente y añadir 1 l RNAseH (2 U / l) y se incuba a 37 ° C durante 20 minutos. </li><li> Brevemente centrifugar los tubos a 3000 xg para centrifugar el líquido condensado. NOTA: Este es el cDNA que se utilizará para la PCR cuantitativa. cDNA puede ser almacenado en congelador a -20ºC hasta que la instalación PCR. ADNc también se puede diluir con agua libre de nucleasa antes de proceder a PCR. </li></ol> 7. PCR cuantitativa <ol><li> Hacer una mezcla maestra que contiene los siguientes reactivos (volúmenes dados son por reacción): 6,3 l de 2x SYBR Green Mix, 0,6 l de Forward Primer (10 M), 0,6 l de cebador inverso (10 M) y 0,5 l de nucleasa agua libre . NOTA: Primer diseño se realizó utilizando la opción en la página secuencia de nucleótidos de NCBI &#39;Primers Pick&#39; para el gen de interés. </li><li> Añadir 10 l de mezcla maestra a cada pocillo de una placa de 96 PCR bien. Añadir 2,5 l de cDNA hechas anteriormente al pozo que contiene la mezcla maestra. Asegúrese de configurar las reacciones de PCR por triplicado para cada muestra. </li><li> Después de completar la adición de mezcla maestra y de ADNc, cubrir la placa de PCR usando una lámina adhesiva óptica para sellar los pocillos. Se centrifuga la placa brevemente durante 5 min a 500 xg en una centrífuga de mesa para resolver todo el líquido a la parte inferior del pozo. </li><li> Cargar la placa de PCR en una máquina RT-PCR pre-programado. Utilice los parámetros de PCR proporcionados en la Tabla 1. </li><li> Análisis de datos: Utilice los valores C t desde la salida qPCR para otros cálculos. Junto con el gen de la prueba, configurar las reacciones de PCR para los genes de control interno, 18S rRNA (para garantizar la igualdad de entrada) y β-actina (control negativo). Calcular cambios veces basadas en el método ΔΔCt 37. </li></ol>

Los autores no tienen divulgaciones.

Siguiendo el trabajo de la señal por Benabid et al., En el uso de la estimulación cerebral profunda para tratar la enfermedad de Parkinson y temblor esencial, la técnica quirúrgica DBS ha sido investigado con mucho interés en la última década para tratar muchos trastornos neurológicos 6,10,43. Estudios DBS dirigidas a las distintas regiones neuro-anatómico de los circuitos cerebrales se realizan actualmente por muchos grupos para hacer frente a las principales enfermedades neuronales y se encuentran ...

La historia detrás del desarrollo de la estimulación cerebral profunda como técnica neuroquirúrgica se remonta a la década de 1870 cuando la posibilidad de la estimulación eléctrica de los circuitos cerebrales se exploró 2. El uso de estimulación de alta frecuencia crónica como tratamiento para trastornos neuronales se inició en la década de 1960 3. Más tarde, en la década de 1990 con el advenimiento de la implantación crónica de DBS electrodos 4-6, el número de trastornos neuronales que fueron tratados por DBS siguió aumentando. La estimulación cerebral profunda se utilizó por primera vez en los Estados Unidos como un tratamiento para el temblor esencial 6. Hoy en día la cirugía se utiliza ampliamente para el tratamiento de trastornos neuronales que están actualmente intratables por la intervención farmacológica. DBS se utiliza actualmente para tratar los trastornos del movimiento de la enfermedad de Parkinson y la distonía 7-9. Demencia de tipo Alzheimer, la enfermedad, la epilepsia, el dolor y enfermedades neuropsiquiátricas como la depresión de Huntington, OCD, Tourette7; síndrome de adicción y s son algunas de las condiciones susceptibles de tratamiento por DBS 10-12. Si bien la cirugía DBS está aprobado por la FDA para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson, distonía y el temblor esencial, el uso de DBS para tratar otras condiciones mencionadas anteriormente están en diversas etapas de laboratorio y los estudios clínicos que ofrecen una gran promesa a los pacientes 13,14. Clínicamente, la cirugía de DBS se realiza en dos etapas. La primera etapa consiste en la colocación de los electrodos quirúrgicamente DBS en la ubicación anatómica objetivo utilizando una combinación de posicionamiento radiológica, CT, MRI, así como lecturas de microelectrodos para mejorar la precisión. La segunda etapa consiste en la implantación de un generador de impulsos en la parte superior del pecho del paciente y la extensión de instalar conduce desde el cuero cabelludo para el generador de impulsos. Sobre la base de la condición neurológica, los esquemas de programación varios para el generador de impulsos se han estandarizado y se pueden usar para suministrar la tensión deseada. El volumen final deTage se alcanza de una manera gradual a fin de recibir la mejor respuesta clínica con un mínimo de voltaje 15. Sin embargo, en nuestros estudios, a diferencia de los implantes crónicas DBS utilizado clínicamente, en aras de la simplicidad, hemos recurrido a estudiar una estimulación de alta frecuencia de una sola vez (durante 1 hora) en nuestros modelos animales. Parte de la investigación de nuestro grupo se centra en investigar el uso de la cirugía de DBS para la epilepsia refractaria al tratamiento. Abordajes quirúrgicos estereotácticos utilizando la estimulación de alta frecuencia ha sido explorado por muchos otros como una opción eficaz para tratar la epilepsia médicamente refractaria que constituye alrededor del 30% de todas las incidencias de la epilepsia 10,16,17. Estimulación cerebelosa la orientación de la superficie cortical, así como los núcleos cerebelares profundos se han utilizado en el pasado como dianas para tratar la epilepsia 10,18,19. Además, la estimulación del hipocampo también se ha intentado, pero con resultados mixtos 20,21. Algunos de los otros investigaronObjetivos de DBS para epilepsia incluyen la corteza cerebral, el tálamo, núcleo subtalámico y el nervio vago 8. Sin embargo, a raíz de los resultados de varios estudios en los últimos años, el núcleo talámico anterior (ATN) se ha convertido en el objetivo DBS más común para el tratamiento de la epilepsia 10,22. Sobre la base de conocimiento acerca de los circuitos neuroanatómicos y los resultados de los modelos animales, varios estudios se han centrado en el efecto terapéutico de la estimulación cerebral profunda de la ATN en el tratamiento de la epilepsia 23-26. El ATN es parte del circuito límbico y se encuentra en la región del cerebro que afecta a la frecuencia de convulsiones. Los estudios realizados por Hamani et al., Han puesto a prueba la eficacia de ATN-DBS en un modelo de epilepsia inducida por pilocarpina y encontró que la estimulación bilateral ATN latencias para las convulsiones inducidas por pilocarpina y el estado epiléptico 24 prolonga. Por otra parte, se encontró la estimulación de alta frecuencia de la ATN para reducir la frecuencia de convulsiones en un modelo pentilentetrazol (PTZ) de epilepsy 25,27-29. Lee et al., Han informado de una reducción media en la frecuencia de las convulsiones en aproximadamente un 75% a la crónica estimulación cerebral profunda de la ATN en el tratamiento de la epilepsia parcial refractaria 30. Un estudio clínico reciente sobre la epilepsia refractaria al tratamiento ha mostrado resultados prometedores después de la cirugía de DBS dirigidas al núcleo talámico anterior (ATN) 22. Un ensayo clínico aleatorio multicéntrico con 110 pacientes sometidos a estimulación cerebral profunda bilateral del ATN para el tratamiento de la epilepsia refractaria (ensayo SANTE) indica una caída en la frecuencia de las convulsiones en aproximadamente un 40% 31. Los resultados de este estudio también dio a entender en un efecto antiepiléptico óptima retraso observado a los 2-3 meses después de la cirugía. Posteriores estudios de Toda et al., Corroboradas con estos hallazgos en la que demostraron neurogénesis ocurre en un puesto de tiempo después de DBS (días 3-5) en modelos animales 1. Además, Encinas et al., Han informado neurógena del hipocamposis en el ratón adulto giro dentado después de la estimulación de alta frecuencia de la ATN 32. Estudios previos han informado de la disminución de 33 a 35 neurogénesis del hipocampo, en algunos casos de epilepsia como la epilepsia del lóbulo temporal, crónica y una asociación con déficit de aprendizaje, trastornos de la memoria y espontáneos recurrentes crisis motoras. Además, hubo una reducción de los factores de células madre progenitoras neurales tales como FGF2 y IGF-1 en el hipocampo crónicamente epiléptico en modelos animales 33. Teniendo en cuenta esto, las estrategias intervencionistas como la DBS que muestran un aumento de la neurogénesis en el giro dentado son vías interesantes para la investigación. Estos resultados nos han animado a explorar más profundamente en el mecanismo subyacente tratamiento neurogénesis post-DBS para la epilepsia. Hemos apuntado a la ATN tanto unilaterales (datos no informados), así como de forma bilateral (en los resultados representativos) y visto neurotrofina elevada (BDNF) expresión en el giro dentado de ratas. Nuestra chipótesis urrent es que la expresión de BDNF inicia una cascada de expresión génica que culmina en la neurogénesis que se traduce en el efecto antiepiléptico de la cirugía de DBS. En este trabajo, presentamos nuestros métodos para la cirugía de DBS focalización del ATN en ratas, seguido de análisis de expresión génica como un enfoque atractivo para estudiar el mecanismo que subyace a los beneficios de la DBS.

<table><tbody><tr><td>Cirugía de Estimulación Cerebral</td> Profunda <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Marco estereotáctico</td><td>Kopf Instruments</td><td>Modelo 900</td><td></td></tr><tr><td>Drill&nbsp;</td><td>Dremmel</td><td>7700, bisturí de 7.2 V</td><td></td></tr><tr><td></td><td>BD</td><td>372610</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Patterson Veterinaria</td><td>07-803-6637</td><td>Lista III Sustancia controlada, adquisición, uso y almacenamiento de acuerdo con las normas institucionales</td></tr><tr><td>Xilacina</td><td>Patterson Veterinaria</td><td>07-808-1947</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>Patterson Veterinaria</td><td>07-850-2280</td><td>Anexo III Sustancias controladas, adquisición, uso y almacenamiento de acuerdo con las normas</td></tr><tr><td>institucionales Grapas quirúrgicas</td><td>ConMed Corporation</td><td>8035</td><td></td></tr><tr><td>Suturas (3-0)&nbsp;</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-3333</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa (1 ml, 29 1/2 G)</td><td>BD</td><td>329464</td><td>Estéril, uso para la administración de anestesia intraperitoneal</td></tr><tr><td>Jeringa (3 ml, 25 G)</td><td>BD</td><td>309570</td><td>Estéril, uso para la administración de analgesia por vía subcutánea</td></tr><tr><td>Agujas</td><td>BD</td><td>305761</td><td>Estéril, uso para limpiar piezas de hueso rotas de los orificios de las rebabas</td></tr><tr><td></td><td>Etanol Fisher Uso</td><td>de S25309B</td> científico <td>para la esterilización general&nbsp;</td></tr><tr><td>Lubricante ocular</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-898-350</td><td></td></tr><tr><td>Estimulador</td><td>Medtronic</td><td>Modelo 3628</td><td></td></tr><tr><td>DBS electrodos</td><td>Rhodes Medical Instruments, CA</td><td>SNEX100x-100 mm</td><td>Los electrodos son de platino, concéntricos y bipolares</td></tr><tr><td>Betadine (Povidona-Yodo)&nbsp;</td><td>PDI</td><td>S23125</td><td>Hisopos de un solo uso, uso para esterilizar el cuero cabelludo antes de hacer la incisión&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp; Disección del cerebro y aislamiento</td><td></td><td></td><td></td>del tejido del hipocampo</tr><tr><td>Matriz de cerebro de roedor acrílico</td><td>Ciencias de la microscopía electrónica 175-300</td><td></td><td>www.emsdiasum.com</td></tr><tr><td>Hoja de afeitar</td><td>V W R</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de guillotina</td><td>Clauss</td><td>18039</td><td>Para la decapitación, asegúrese de que estas tijeras se mantengan limpias y en condiciones de funcionamiento</td></tr><tr><td>Tijeras</td><td>Codman Clásico</td><td>34-4098</td><td>Uso para extraer el cerebro del cráneo</td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>Microscopía Electrónica Ciencias</td><td>72957-06</td><td>Uso para extraer el cerebro del cráneo y para manipular durante la disección</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato&nbsp;</td><td>Boston Bioproductos</td><td>BM-220</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Extracción de ARN y preparación de ADNc Tri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reactivo</td><td>Sigma</td><td>T9424</td><td>Úselo siempre en una campana extractora y use gafas protectoras mientras lo manipula; evite el contacto con la piel</td></tr><tr><td>Jeringa (3 ml, 25 G)</td><td>BD</td><td>309570</td><td>Uso para la homogeneización de tejidos</td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1145-1</td><td>Úselo siempre en una campana extractora y use gafas protectoras mientras manipula; evite el contacto con piel</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A416-1</td><td></td></tr><tr><td>Glucógeno</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0561</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1906</td><td></td></tr><tr><td>Superíndice Kit de síntesis de primera hebra</td><td>Invitrogen</td><td>11904-018</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga de sobremesa</td><td>Eppendorf</td><td>5415D</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; PCR cuantitativa</td><td>; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green PCR Kit</td><td>Qiagen</td><td>204143</td><td></td></tr><tr><td>Oligos Personalizados</td><td>Invitrogen</td><td>10668051</td><td></td></tr><tr><td>Placas de PCR (96 pocillos)</td><td>Denville Scientific</td><td>C18080-10</td><td></td></tr><tr><td>Láminas adhesivas ópticas</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB1170</td><td></td></tr><tr><td>Agua libre de nucleasas</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30538-02</td><td></td></tr><tr><td>Real Máquina de PCR de tiempo</td><td>Applied Biosystems</td><td>7500</td><td></td></tr></tbody></table>

análisis de los cambios de expresión génica en la rata hippocampus después de la estimulación cerebral profunda del tálamo anterior núcleo

Analysis of Gene Expression Changes in the Rat Hippocampus After Deep Brain Stimulation of the Anterior Thalamic Nucleus

La estimulación cerebral profunda (DBS), la cirugía, apuntando a diferentes regiones del cerebro, como los ganglios basales, el tálamo y regiones subtalámico, es un tratamiento efectivo para varios trastornos del movimiento que no han respondido a la medicación. Los recientes progresos en el campo de la cirugía de DBS ha comenzado a extender la aplicación de esta técnica quirúrgica para otras condiciones tan diversas como la obesidad mórbida, la depresión y el trastorno obsesivo compulsivo. A pesar de estas indicaciones en expansión, se sabe poco sobre los mecanismos fisiológicos subyacentes que facilitan los efectos beneficiosos de la cirugía de DBS. Un enfoque a esta pregunta es para llevar a cabo análisis de expresión génica en las neuronas que reciben la estimulación eléctrica. Estudios anteriores han demostrado que la neurogénesis en el giro dentado de la rata se provoca en DBS focalización del núcleo anterior del tálamo 1. Cirugía de DBS focalización del ATN se utiliza ampliamente para el tratamiento de la epilepsia refractaria. Por tanto, es de mucho interest para nosotros para explorar los cambios transcripcional inducidos por la estimulación eléctrica de la ATN. En este manuscrito, describimos nuestras metodologías para estereotáctica guiada por cirugía de DBS focalización del ATN en ratas Wistar macho adultas. También se discuten los pasos subsiguientes para la disección de tejidos, el aislamiento de ARN, la preparación de ADNc y RT-PCR cuantitativa para medir los cambios de expresión génica. Este método podría aplicarse y modificarse para estimular los ganglios basales y en otras regiones del cerebro comúnmente clínicamente dirigida. El estudio de la expresión génica se describe aquí asume un enfoque objetivo de genes candidato para descubrir jugadores moleculares que podrían dirigir el mecanismo para DBS.

Figuras 1A y 1B muestran la expresión relativa de BDNF y GABRD en relación con el gen de control de β-actina. BDNF, una neurotrofina se asocia a menudo con efectos neuroprotectores en muchas enfermedades neuronales 38-41. Por tanto, es interesante analizar el perfil de expresión de BDNF en respuesta a la estimulación de la ATN que produce beneficios terapéuticos a pacientes epilépticos. En la Figura 1A que muestra el perfil de expresión génica de BDNF a travé...

El mecanismo subyacente a los efectos terapéuticos de la cirugía de Estimulación Cerebral Profunda (DBS) necesita investigación. Los métodos presentados en este manuscrito describen un enfoque experimental para examinar los eventos celulares desencadenados por la ECP mediante el análisis del perfil de expresión génica de los genes candidatos que pueden facilitar la neurogénesis después de la cirugía de ECP.

Análisis de los cambios de expresión génica en la Rata Hippocampus Después de la estimulación cerebral profunda del tálamo anterior Núcleo

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective ...

El objetivo general de este procedimiento es realizar una estimulación cerebral profunda del núcleo anterior del tálamo y estudiar los cambios en la expresión génica en el hipocampo de la rata. Esto se logra primero anestesiando al animal. A continuación, se prepara al animal para la cirugía.Se realiza una incisión en el cuero cabelludo y se expone el cráneo. Luego, en la posición derecha con respecto al bgma, se hacen los orificios de trepanación. Se insertan los electrodos de estimulación cerebral profunda y se lleva a cabo la estimulación.Finalmente, el animal es sacrificado y se disecciona el cerebro. Para extraer el hipocampo, el tejido se procesa para la extracción de ARN y se realiza la preparación de ADNc y la PCR cuantitativa. En última instancia, los resultados demuestran que la estimulación cerebral profunda influye en la expresión génica en el hipocampo de la rata.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la cirugía de estimulación cerebral profunda, como por ejemplo cuáles son los mecanismos moleculares que subyacen al efecto terapéutico de esta cirugía. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el tratamiento no solo de la epilepsia, sino también de otras afecciones neuronales como la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer y la distonía. Dado que la DPS está emergiendo como un enfoque quirúrgico para tratar muchos trastornos neuronales, para prepararse para la cirugía, use almohadillas quirúrgicas para cubrir la superficie de trabajo y asegúrese de que haya disponible un sistema de eliminación de desechos biopeligrosos.Pese la rata y calcule la dosis de anestesia según el protocolo descrito en el texto. Monte y asegure dos electrodos en el soporte de electrodos de un marco quirúrgico estereotáctico, y con un microscopio, revise las puntas de los electrodos para verificar su alineación adecuada. Asegure los electrodos a tres milímetros de distancia entre sí, teniendo cuidado de no tocar las puntas de los electrodos sobre superficies duras. Inyecte la ketamina y el xilacina.Administre intraperitonealmente al animal y confirme que ha alcanzado un plano quirúrgico de anestesia verificando el reflejo de pellizco en el dedo del pie, la frecuencia respiratoria y la profundidad y regularidad de la respiración. Sujete y coloque al animal en el marco estereotáctico. Aplique un lubricante ocular a los ojos del animal para protegerlos de la desecación excesiva y desinfecte el cuero cabelludo con tres frotaciones alternadas, cada una con Betadine y alcohol o solución salina estéril.Coloque el animal sobre una placa de agua tibia circulante o utilice lámparas de calor para mantener la temperatura corporal del animal a un nivel óptimo. Según el atlas del cerebro de rata de Paxinos y Watson, utilice las siguientes coordenadas estereotácticas para dirigirse al núcleo talámico anterior o un NT anteroposterior negativo 1,6 milímetros. Mediales 1,5 milímetros y dorsoventrales 5,2 milímetros.A continuación, realice una incisión en el cuero cabelludo en sentido sagital para exponer el cráneo. Con un par de retractores, sujete el cuero cabelludo incisionado para exponer el cráneo. Luego, con torundas estériles sumergidas en etanol, limpie la región incisionada para exponer claramente las suturas. Localice el bgma y utilice un marcador negro para marcar y guiar la posición de los orificios de trépano.Realice otras dos marcas a aproximadamente 1,5 milímetros de distancia lateralmente a ambos lados de la sutura sagital y 1,6 milímetros por detrás de la sutura coronal. Para hacer los dos orificios con el trépano, utilice etanol para desinfectar la punta de la broca.Utilizando un taladro sostenido en un ángulo de 45 grados, realice los orificios con la fresa alternando frecuentemente entre los dos orificios para evitar un exceso de calor en el centro de cualquiera de ellos. Continúe taladrando hasta exponer la duramadre. Con una aguja cuya punta esté doblada en forma de L, retire cualquier fragmento óseo suelto que pudiera obstaculizar la inserción del electrodo.Tenga cuidado para evitar dañar la duramadre subyacente y/o el tejido cerebral al retirar los fragmentos óseos. Fije el ensamblaje de electrodo dual al mango giratorio del marco estereotáctico y coloque el mango en un ángulo de 90 grados. Utilizando los ajustes del marco estereotáctico, coloque el electrodo izquierdo exactamente encima del bgma.Uso de los ajustes estereotácticos para el medio. El posicionamiento lateral movió con precisión el electrodo izquierdo 1,5 milímetros hacia el lado izquierdo del bgma, de modo que ahora hay dos electrodos perfectamente alineados a lo largo de la sutura coronal, pero separados. 1,5 milímetros del medio lateralmente desde el bgma.Luego, con los ajustes estereotácticos anterior-posterior, mueva los electrodos 1,6 milímetros hacia posterior respecto a la sutura coronal. A continuación, con los ajustes dorsal-ventral, baje los electrodos para verificar primero si se han realizado los orificios de trepanación en la ubicación correcta, de modo que los electrodos puedan insertarse fácilmente sin tocar los bordes ásperos de los orificios. En tal caso, inserte los electrodos hasta una profundidad de 5,2 milímetros desde la superficie del cráneo.Conecte los electrodos mediante cables a un estimulador ajustado a 130 hercios, 2,5 voltios y una duración del pulso de 90 microsegundos. Aplique estimulación de alta frecuencia durante un período de tiempo deseado. Realice estimulación unilateral o bilateral.Una vez finalizada la estimulación, retire cuidadosamente los electrodos y cierre la incisión con tres puntos de sutura de cero o grapas quirúrgicas estériles, administre buprenorfina por vía subcutánea y supervise al animal hasta que recupere una actividad normal, luego devuélvalo al centro de alojamiento. Coloque el cerebro sobre una matriz acrílica previamente enfriada sobre hielo utilizando una hoja de afeitar. Corte el cerebro en sentido coronal aproximadamente entre siete y ocho milímetros desde el borde más anterior del cerebro.Realice un segundo corte coronal y posterior al primer corte de manera que se pueda extraer una sección cerebral de aproximadamente cinco milímetros de grosor. Transfiera la sección cerebral a una placa de Petri con PBS frío con hielo utilizando una hoja de afeitar, separe las dos secciones hemisféricas y tenga cuidado de anotar cuál sección corresponde al lado izquierdo y al derecho, respectivamente. Utilizando pinzas finas y tijeras, retire cuidadosamente el tejido del hipocampo, congele el tejido en hielo seco y almacénelo a menos 20 grados Celsius hasta que esté listo para los pasos subsiguientes de ARN realizados según el protocolo descrito aquí, que muestra los niveles relativos de expresión de BDNF en comparación con el gen control beta actina a lo largo de los puntos de tiempo indicados.Estimulación posterior a la EEC. Se observa una regulación positiva del BDNF inmediatamente después de la cirugía de EEC, junto con una expresión máxima a las tres horas posteriores a la estimulación. Esta observación sugiere que un aumento en la expresión de BDNF y la neuroprotección resultante podrían contribuir al beneficio terapéutico de la EEC en pacientes epilépticos.Este panel ilustra la expresión del receptor de GABA, G-A-B-R-D, que muestra una expresión aumentada en los animales estimulados en comparación con los controles no estimulados a las tres horas posteriores a la EEC. Dado que los agonistas de GABA se utilizan como supresores eficaces de las convulsiones, es interesante observar el aumento de la expresión de G-A-B-R-D tras la EEC, lo que sugiere un posible papel del GABA en el efecto antiictal de la EEC. Tras seguir este procedimiento.Se pueden realizar otros métodos como la transferencia western, la inmunoprecipitación de cromatina y muchos otros ensayos moleculares biológicos estándar. Esto ayuda a responder preguntas relacionadas con cambios en la expresión proteica, modificaciones postraduccionales, la ocupación de factores de transcripción en regiones promotoras génicas específicas, etc. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar cirugía de estimulación cerebral profunda en ratas.Aislar el tejido del hipocampo y analizarlo en busca de cambios en la expresión génica.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Fuente: Casquero-Veiga, M. et al. Tomografía por emisión de positrones in vivo para revelar patrones de actividad inducidos por estimulación cerebral profunda en ratas. J. Vis. Exp. (2022).Este video demuestra los efectos metabólicos de la estimulación cerebral profunda (DBS) utilizando imágenes FDG-PET en un modelo de rata. Describe los pasos involucrados en la administración de FDG, la aplicación de DBS y las imágenes PET / CT para mapear regiones cerebrales con actividad metabólica aumentada...

Evaluación de la neuromodulación metabólica inducida por estimulación cerebral profunda aguda en ratas mediante FDG-PET in vivo

Fuente: Selvakumar, T., et al., Análisis de los cambios en la expresión génica en el hipocampo de la rata después de la estimulación cerebral profunda del núcleo talámico anterior. J. Vis. Exp. (2015)Este video demuestra el procedimiento para implantar electrodos en el cerebro de rata para aplicar estimulación cerebral profunda (DBS), que modula la actividad neuronal y mejora la comunicación con el hipocampo, apoyando la supervivencia neuronal y la neurogénesis.

Efectos de la estimulación cerebral profunda en la actividad neuronal del hipocampo en un modelo de rata

Este video demuestra la detección de la síntesis de ARN del receptor de serotonina utilizando sondas de oligonucleótidos en tejido cerebral de rata afectado por el síndrome de serotonina. El protocolo incluye pretratamiento de tejidos, hibridación de sondas y detección enzimática para visualizar y cuantificar la expresión del ARN del receptor de serotonina bajo un microscopio.

Hibridación in situ mediante sondas de oligonucleótidos para estudiar la expresión de ARN en secciones de cerebro de rata

Se describe cómo utilizar la microdisección de captura por láser (LCM) para obtener poblaciones enriquecidas de las neuronas del hipocampo o neuronas individuales de las secciones congeladas del cerebro de rata lesionado para el posterior análisis de expresión génica usando PCR en tiempo real cuantitativa y / o microarrays de todo el genoma.

Captura de microdisección láser poblaciones enriquecidas de neuronas o neuronas individuales para análisis de expresión génica después de una lesión cerebral traumática

Este protocolo describe un método estándar para imágenes de resonancia magnética funcional simultánea y la estimulación cerebral profunda en el roedor. El uso combinado de estas herramientas experimentales permite la exploración de la actividad aguas abajo mundial en respuesta a la estimulación eléctrica a prácticamente cualquier destino cerebro.

La estimulación cerebral profunda con simultánea fMRI en roedores

Se describe un método para implantar electrodos en el núcleo subtalámico (STN) de ratas. Se logró una mejor localización del STN mediante el uso de un sistema de micrograbación. Además, se presenta una configuración de estimulación que se caracteriza por conexiones duraderas entre la cabeza del animal y el estimulador.

Microelectrodos guiada implantación de electrodos en el Subtalámico Núcleo de ratas de largo plazo estimulación cerebral profunda

La estimulación cerebral profunda (DBS) es una opción de tratamiento eficaz para la enfermedad de Parkinson. Establecimos un diseño de estudio para evaluar nuevos paradigmas de estimulación en ratas. El protocolo describe el uso de la prueba de escalera y la prueba de cilindro para la evaluación de los resultados motores en ratas hemiparkinsonianas tratadas con DBS.

Un nuevo enfoque para evaluar el resultado de motor de Estimulación Cerebral Profunda Efectos en la rata hemiparkinsonianas: Escalera y cilindro de prueba

Aplicamos estimulación magnética transcraneal repetitiva (EMTr) al hemisferio unilateral del cerebro de rata, colocando una bobina en forma de 8 de 25 mm a 1 cm lateral al vértice en la línea biauricular y angulando la bobina 45°. Se utilizó un sistema interno de refrigeración por agua para la EMTr durante más de 20 minutos.

La estimulación magnética transcraneal repetitiva en el Hemisferio unilateral de cerebro de rata

Este protocolo muestra cómo establecer un método confiable de HFS en ratones. Las neuronas en el hipocampo giro dentado son estimuladas eléctricamente por HFS directamente e indirectamente en vivo. La actividad neuronal y señalización molecular son examinados por c-fos y coloración inmunofluorescente de Notch1, respectivamente; la neurogénesis se cuantifica por bromodeoxiuridina etiquetado ensayo.

Un método invasivo para la activación de la convolución del cerebro dentada de ratón por el estímulo de alta frecuencia

Estimulación por corriente directa transcraneal (tDCS) es una técnica terapéutica que se propone para el tratamiento de enfermedades psiquiátricas. Un modelo animal es esencial para la comprensión de las alteraciones biológicas específicas evocadas por pinza. Este protocolo describe un modelo de ratón de pinza que usa un electrodo implantado crónico.

Estimulación por corriente directa transcraneal (tDCS) en ratones

Describimos un método experimental preclínico para evaluar la neuromodulación metabólica inducida por la estimulación cerebral profunda aguda con FDG-PET in vivo . Este manuscrito incluye todos los pasos experimentales, desde la cirugía estereotáxica hasta la aplicación del tratamiento de estimulación y la adquisición, procesamiento y análisis de imágenes PET.

In vivo Tomografía por emisión de positrones para revelar patrones de actividad inducida por estimulación cerebral profunda en ratas

Aprende a realizar estimulación cerebral profunda del núcleo talámico anterior en ratas Wistar y analizar cambios de expresión génica en el hipocampo mediante RT-PCR cuantitativa. Este método permite estudiar los mecanismos moleculares de la DBS.

Análisis de los cambios de expresión génica en la Rata Hippocampus Después de la estimulación cerebral profunda del tálamo anterior Núcleo (Video) | JoVE Journal

Análisis de los cambios de expresión génica en la Rata Hippocampus Después de la estimulación cerebral profunda del tálamo anterior Núcleo

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