Xenopus laevis como modelo para identificar Traducción Deterioro

El objetivo general de este procedimiento es evaluar las primeras consecuencias de las mutaciones en los factores de iniciación de la traducción sin interferencia del ARNm recién transcrito o de los problemas de eficiencia de la transfección que a menudo ocurren con los estudios de células eucariotas. Esto se logra sintetizando primero el tipo salvaje mutante y el control, o ARNm GFP a partir de los plásmidos correspondientes. A continuación, el ARN sintetizado se microinyecta en los citos XUS Lavis en la etapa seis, y su maduración se estimula con progesterona.

A continuación, se evalúa la maduración de los citos mediante la visualización de la ruptura de las vesículas germinales y se analizan algunos de los componentes de la cascada de quinasas MA, cuya activación depende de la expresión de la proteína musgo, mediante Western blot. Por último, se estudia la poliadenilación de ARNm de musgo y otros ARNm necesarios para la recuperación de la miosis de los citos XPO. En última instancia, maduración cinética de los citos.

Los análisis de Western blot y poliadenilación se utilizan para mostrar un impacto potencial de la expresión de proteínas cuando un factor de iniciación de la traducción está mutado. La principal ventaja de esta técnica frente a nuestros métodos existentes o sistema celular reconstituido extraído a partir de igual a igual que el germen o el reticulocito de conejo, es que los efectos de una mutación introducida en una RM. NA será rápidamente observable y fácilmente estudiado en varias levas xop. Cytes en general.

Este modelo tiene las ventajas de la simplicidad con sus células gigantes individuales, y su uso conduce a una cantidad considerable de material para experimentos bioquímicos. Este proceso también es eficiente en el tiempo en comparación con la generación de líneas celulares estables. Este miso puede ayudar a responder preguntas clave en los estudios de traducción, como para comprender mejor el papel de dominios específicos de los factores de ación o para estudiar el empalme de estos factores.

Primero añadimos la idea de este método cuando queríamos estudiar el impacto de un factor de iniciación de la traducción mutado en la síntesis de proteínas sin interferencia de la transcripción. De esta manera, evitamos posibles bucles de retroalimentación entre estos dos mecanismos. De hecho, las transcripciones del material se almacenan y se colocan.

La traducción se puede desencadenar con progesterona Después de defecar, xus lavos citos y preparar CRN de acuerdo con el protocolo de texto, use 10 x trapeadores y 6.6% de formaldehído para lanzar un gel 1.5%AROS. Prepare las muestras en un tubo de 0,2 mililitros con 8,8 % de formaldehído, 60 por ciento para AMIDA 0,1 volúmenes de 10 x mopas y un microlitro de CRNA incubar a 70 grados centígrados durante tres minutos y poner los tubos en hielo durante 10 minutos. Centrifugar las muestras a 5.000 veces G durante unos segundos antes de añadir dos microlitros de tampón de carga de gel.

Ejecute las muestras a 90 voltios durante 20 minutos para desdeñar el gel. Sumérjalo en agua libre de nucleasas durante la noche. A continuación, analícelo para comprobar la calidad del CNA.

Utilice un espectrofotómetro para determinar la concentración de CNA y almacene las muestras a menos 80 grados Celsius para llevar a cabo la microinyección de ARN. Use el medio ND 96 para llenar una placa de Petri raspada una o dos horas después de la defoliación. Coloque los cites a lo largo de un carril raspado en el plato.

A continuación, utilizando una micropipeta capilar con una punta rota colocada en un ángulo de 45 grados. Inserte la punta capilar a una profundidad de 150 a 200 micras en la zona ecuatorial por debajo del área animal pigmentada. Inyectar 30 nanogramos de CRNA en 60 nanolitros en el primer ovocito.

A continuación, espere de cinco a 10 segundos antes de retirar la punta capilar para evitar que la muestra se escape. Para inyectar el siguiente citar Mueva manualmente la antena. Transfiera los citos inyectados a placas de cultivo de 24 pocillos llenas con tres mililitros de medio ND 96 y condúltelos a 19 grados centígrados para desencadenar la maduración mitótica.

Incubar los ovocitos en ND 96 con dos microgramos por mililitro de progesterona o PG a 19 grados centígrados durante 15 horas. Pruebe el efecto de traducción de los CRNA EIF 4G one de tipo salvaje en el fenotipo mutante de acuerdo con el protocolo de texto. Determinar el grado de descomposición de las vesículas germinales bajo un microscopio estereoscópico.

Cuente el número de citos maduros después de la estimulación de PG por la presencia de una mancha blanca en el polo negro del animal. Repita el conteo cada hora hasta la hora 24 para realizar el análisis de sangre occidental. Utilice los movimientos hacia adelante y hacia atrás de la punta de una micropipeta a cuatro grados centígrados para homogeneizar 10 citos en 200 microlitros del tampón que se muestra aquí.

Centrifugar las muestras a 10.000 veces G durante 15 minutos para extraer la fracción citoplasmática en el medio. Fase de la fracción superior correspondiente a los lípidos y la inferior a los residuos celulares. Recoja la fracción citoplasmática y almacene una alícuota para determinar la concentración de proteína.

Combine el resto en una proporción de uno a uno con el búfer de muestra de Biss o de baja densidad antes de ejecutar la página SDS y la transferencia occidental. De acuerdo con el protocolo de texto. Para llevar a cabo un ensayo de ventilación polifónica, coloque cinco citaciones por condición en tubos de micro fuga de 1,5 mililitros con un mililitro de nucleasa libre de un lavado XPBS de los citos.

Luego, debajo de la campana extractora, use un kit de extracción de ARN de acuerdo con las instrucciones del fabricante para aislar el ARN. Después de verificar la integridad del ARN y determinar la concentración, prepare dos mezclas de ligadura por condición de ARNC con los siguientes reactivos a la primera mezcla. Añadir el ARN de los citos no estimulados con pg y a la segunda mezcla.

Añadir ARN de ovocitos estimulados por PG. Incubar a 37 grados centígrados durante una hora y luego a 65 grados centígrados durante 20 minutos. Para inactivar la enzima utilizando un kit de transcripción inversa CD NA.

Para cada muestra, prepare la mezcla RT que se indica aquí. Añadir 10 microlitros de la reacción de ligadura previamente preparada y realizar la RT según las instrucciones del fabricante después de realizar la PCR, utilizando la siguiente mezcla de reacción y condiciones para cada reacción a cuatro microlitros de tampón de carga y correr 10 microlitros de cada muestra en un gel de 3%agros a 110 tornillos. Finalmente, analice el gel después de 10 y 20 minutos para observar un cambio de tamaño que refleja la longitud de la cola de poliA y, por lo tanto, la maduración del ARN, que es un requisito previo para su traducción.

Como se muestra aquí, la maduración cinética de los ovocitos microinyectados en condiciones de control es similar a la del tipo salvaje, con números similares sometidos a GVBD a las 12 y 24 horas después de la estimulación con PG, 24 horas después de la estimulación con PG. El porcentaje de ovocitos que alcanzan la maduración es similar para los controles de tipo salvaje, así como para los controles inyectados con agua y GFP, lo que indica que la microinyección con agua o CRNA de control o EIF 4G one tuvo poco efecto sobre la miosis de los ovocitos. La microinyección de miosis de ovocitos con el EIF 4G negativo dominante, sin embargo, resultó en una disminución dramática de GVBD incluso después de la estimulación con PG. Esta figura muestra que el defecto de maduración se puede restaurar en el CRNA de tipo salvaje a medida que aumenta la proporción de tipo salvaje a EIF negativo dominante 4G un CRNA.

Lo mismo ocurre con el porcentaje de citos que se someten a la maduración esperada. No se detecta expresión endógena de musgo en ausencia de estimulación de PG y la sobreexpresión de EIF 4G, un negativo dominante tiene poco impacto sobre el musgo endógeno, de acuerdo con los resultados previos. Además, Aurora AEEG two, que actúa aguas arriba de la inducción del musgo, no muestra evidencia de desregulación de proteínas o de su forma fosforilada inducida después de la estimulación de PG.

Por el contrario, la fosforilación de irk two, que es inducida por el musgo, se inhibe en presencia del EIF negativo dominante 4G uno. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en cinco días si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que no debe exceder los 120 nanolitros de CNA con una concentración inferior a ciertos nanogramos después de este procedimiento.

Aunque se pueden realizar métodos como el análisis de perfiles de polisomas para responder a preguntas adicionales como definir qué ARN podría estar mal o muy traducido.