Name: Evaluación funcional de las vías olfatorias en los renacuajos de Xenopus de vida (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Aprende a evaluar las vías olfatorias en renacuajos de Xenopus mediante técnicas de imagen in vivo y análisis conductual. Este método permite estudiar el procesamiento de información olfativa y la función de terminales presinápticas en neurobiología.

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Este trabajo fue financiado por becas del Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO; SAF2015-63568-R) cofinanciado por Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER), con premios de investigación competitiva de la M. G. F. Fuortes Memorial Fellowship, del fondo de becas de Stephen W. Kuffler, Laura y Arturo Colwin verano investigación beca Fondo , la beca de Fischbach y el gran fondo de generación del laboratorio biológico marino y el nacional Xenopus recursos RRID:SCR_013731 (Woods Hole, MA) donde se llevó a cabo una parte de este trabajo. También agradecemos a CERCA programa / Generalitat de Catalunya para apoyo institucional. A.L. es Serra Húnter.

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Los autores no tienen nada que revelar.

Este documento describe técnicas que son útiles para investigar la funcionalidad de las vías olfatorias en la vida de los renacuajos de Xenopus . El protocolo actual es particularmente útil para aquellos laboratorios que trabajan o tienen acceso a Xenopus; sin embargo, también es interesante para aquellos investigadores que estudian las bases celulares y moleculares de la regeneración neuronal y reparación. Resultados obtenidos en Xenopus pueden combinarse con datos recogidos en otros modelos v...

Los renacuajos de Xenopus constituyen un excelente modelo animal para estudiar la función normal del sistema nervioso. Transparencia, un genoma completamente secuenciado1,2y accesibilidad a las técnicas quirúrgicas, electrofisiológicos y de imagenológicos son propiedades únicas de las larvas de Xenopus que permiten investigar las funciones neuronales in vivo3 . Algunas de las múltiples posibilidades experimentales de este modelo animal son ilustrados por los estudios cuidadosos en renacuajo sistemas sensorial y motor4,5,6. Un circuito neuronal particularmente bien adaptado para el estudio de muchos aspectos de procesamiento a nivel de las sinapsis de información es el de sistema olfativo de renacuajo Xenopus 7. En primer lugar, su conectividad sináptica está bien definido: neuronas receptoras olfatorias (ORNs) proyecto para el bulbo olfatorio y establecen contactos sinápticos con las dendritas de células mitrales/tufted dentro de glomérulos para generar mapas de olor. En segundo lugar, sus ORNs continuamente se generan por la neurogénesis durante toda la vida para mantener la funcionalidad de vías olfatorias8. Y en tercer lugar, porque el sistema olfativo muestra una gran capacidad regenerativa, los renacuajos de Xenopus son capaces de reformar completamente su bulbo olfatorio después de ablación9.
En este papel, describimos los enfoques que combinan la proyección de imagen de glomérulos olfativos en los renacuajos vivos con experimentos conductuales para el estudio de la funcionalidad de las vías olfatorias. Los métodos detallados aquí fueron usados para el estudio de la recuperación funcional de conectividad glomerular del bulbo olfatorio de transección del nervio olfatorio10. Datos obtenidos en los renacuajos de Xenopus son representativas de vertebrados desde procesamiento olfativo es evolutivo conservado.
Los métodos descritos se ejemplifican mediante X. tropicalis pero puede implementarse fácilmente en X. laevis. A pesar del tamaño más grande de adultos X. laevis, ambas especies son notablemente similares durante etapas de renacuajo. Las principales diferencias residen en el nivel genomic. X. laevis muestra pobre maleabilidad genética, determinada sobre todo por su genoma tetraploide y tiempo de generación largo (aproximadamente 1 año). En cambio, x. tropicalis es más susceptible a modificaciones genéticas debido a su corto tiempo de generación (5 – 8 meses) y el genoma diploide. Los experimentos representativos se ilustran para animales de tipo silvestre y tres líneas transgénicas: Hb9:GFP (X. tropicalis), NBT:GFP (X. tropicalis) y tubb2:GFP (X. laevis).
Las metodologías descritas en el presente trabajo deben considerarse junto con los avances genéticos en el campo de Xenopus . La simplicidad y fácil aplicación de las técnicas presentadas los hace particularmente útiles para evaluar ya descrito mutantes11, así como líneas de Xenopus generadas por CRISPR Cas9 tecnología12. También describimos un procedimiento quirúrgico que se utiliza para nervios olfativos que puede implementarse en cualquier laboratorio de tener acceso a los renacuajos de Xenopus de transectos. Los enfoques utilizan para evaluar las respuestas de calcio presinápticos y comportamiento olfativo guiadas requieren equipamiento específico, aunque en un coste moderado. Metodologías se presentan en una forma simple para promover su uso en grupos de investigación y podrían sentar las bases de análisis más complejos mediante la implementación de mejoras o de la asociación a otras técnicas, es decir,, histológicos o genéticos enfoques.

<table><tbody><tr><td>Sales para acuarios (Instant Ocean Salt)</td><td>Tecniplast</td><td>XPSIO25R</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine (Etil 3-aminobenzoato metanosulfonato)</td><td>Pinzas Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>#5 (punta 0,025 x 0,005 mm)</td><td>World Precision Instruments</td><td>501985</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras Vannas (punta 0,015 x 0,015)</td><td>World Precision Instruments</td><td>501778</td><td></td></tr><tr><td>Whatman papel de filtro cualitativo</td><td>Fisher Scientific</td><td>WH3030917</td><td></td></tr><tr><td>X. laevis tubb2-GFP</td><td>National Xenopus Resource (NXR), RRID:SCR_013731</td><td>NXR_0.0035</td><td></td></tr><tr><td>X.tropicalis NBT-GFP</td><td>Centro Europeo de Recursos de Xenopus (EXRC) RRID:SCR_007164</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellTracker CM-DiI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C-7001</td><td></td></tr><tr><td>Calcio Verde Dextrano, Sal de Potasio, 10.000 MW, Aniónico</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C-3713</td><td></td></tr><tr><td>Capilares de borosilicato para microinyección</td><td>Instrumento Sutter</td><td>B100-75-10</td><td>O.D.=1,0 mm., D.I.=0,75 mm.</td></tr><tr><td>Extractor</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Microinyector</td><td>Parker Instruments</td><td>Picospritzer III</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard-184</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>761028-5EA</td><td></td></tr><tr><td>Micropipetas Microfil</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF28G-5</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio vertical</td><td>Zeiss</td><td>AxioImager-A1</td><td></td></tr><tr><td>Master-8 estimulador</td><td>A.M.P.I.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cámara CCD</td><td>Hamamatsu</td><td>Image EM</td><td></td></tr><tr><td>Electroválvulas</td><td>Warner Instruments</td><td>VC-6 Sistema</td><td></td>de seis canales</tr><tr><td>Dow Corning Grasa de alto vacío</td><td>VWR Scientific</td><td>636082B</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de tubocurarina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2379</td><td></td></tr><tr><td>Cámara CCD</td><td>Zeiss</td><td>MRC-5</td><td>Cámara controlada por Zen software</td></tr><tr><td>lente</td><td>de cámara Thorlabs MVL8ML3</td><td></td><td>Existen múltiples posibilidades que deben adaptarse al modelo de cámara utilizado Resina</td></tr><tr><td>epoxi</td> Colector de <td>componentes</td><td></td><td></td>RS</tr><tr><td>Colector</td><td></td><td>de perfusión Warner Instruments MP-6</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador para la entrega local de soluciones</td><td>Narishige</td><td>MN-153</td><td></td></tr><tr><td>Mini pinzas magnéticas</td><td>Warner Instruments</td><td>MAG-7, MAG-6</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de polietileno</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0755</td><td>O.D.=1,57 mm., D.I.=1,14 mm.</td></tr></tbody></table>

evaluación funcional de las vías olfatorias en los renacuajos de xenopus de vida

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Los renacuajos de Xenopus ofrecen una plataforma única para investigar la función del sistema nervioso. Proporcionan múltiples ventajas experimentales, tales como accesibilidad a numerosos métodos de proyección de imagen, técnicas electrofisiológicas y ensayos de comportamiento. El sistema olfativo del renacuajo Xenopus es particularmente idóneo para investigar la función de sinapsis establecidas durante el desarrollo normal o reformado después de la lesión. Aquí, describimos las metodologías para evaluar el procesamiento de la información olfativa en la vida de las larvas de Xenopus . Esbozamos una combinación de medidas en vivo de las respuestas de calcio presinápticos en glomérulos del bulbo olfativo con ensayos de comportamiento olfativo guiado. Métodos pueden combinarse con la transección de nervios olfativos para el estudio de la configuración de la conectividad sináptica. Los experimentos se presentan animales de tipo salvaje y genéticamente modificados expresando reporteros GFP en células del sistema nervioso central. Aplicación de los enfoques descritos a los renacuajos genéticamente modificados puede ser útil para desentrañar las bases moleculares que definen comportamiento vertebrado.

En este trabajo presentamos una combinación de dos enfoques complementarios para realizar el estudio en vivo de la funcionalidad del sistema olfativo renacuajo Xenopus : i) un método para la proyección de imagen presináptica Ca2 + cambios en los glomérulos de la vida los renacuajos con un indicador fluorescente de calcio y ii) un olor guiado ensayo conductual que puede utilizarse para investigar la respuesta a olores específicos de transmitidas por el agua. Pu...

Los renacuajos de Xenopus ofrecen una plataforma única para investigar la función del sistema nervioso en vivo. Se describen metodologías para evaluar el procesamiento de la información olfativa en la vida de Xenopus larvas en condiciones normales de cría o después de la lesión.

Evaluación funcional de las vías olfatorias en los renacuajos de Xenopus de vida

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system. They provide multiple experimental advantages, such as ...

Este método puede ser útil para responder preguntas clave en campos de neurobiología como cómo funcionan los terminales presinápticos in vivo. La principal ventaja de este conjunto de técnicas es que mostramos enfoques complementarios para evaluar la función de las vías olfativas utilizando renacuajos Xenopus como modelo animal. Demostrando este procedimiento seremos yo, Beatrice Terni y Paolo Pacciolla.Comience el procedimiento de transección humedeciendo dos trozos de papel de filtro cualitativo de celulosa en una solución anestésica 0,02%MS2 22 y colocándolas bajo el ámbito de disección. A continuación, elija un renacuajo del tanque y sumerja en un plato de solución anestésica. El renacuajo debe dejar de nadar en un plazo de dos a cuatro minutos.Compruebe la anestesia adecuada por la ausencia de una reacción a los estímulos mecánicos aplicados a nivel de cola utilizando pinzas. Coloque el renacuajo anestesiado en el papel de filtro debajo del visor. Coloque el animal con su lado dorsal mirando hacia arriba para que las estructuras cerebrales puedan ser visualizadas.Para experimentos conductuales, usa tijeras veni para transeccar ambos nervios y suprimir toda la información de ol

functional-evaluation-of-olfactory-pathways-in-living-xenopus-tadpoles

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Demostramos variaciones de la técnica de grabación extracelular de múltiples unidades para caracterizar el mal olor respuestas evocadas en las tres primeras etapas de la vía olfativa invertebrado. Estas técnicas se pueden adaptar fácilmente para examinar la actividad conjunto en otros sistemas neurales también.

Varias unidades Métodos de grabación para caracterizar la actividad neuronal en el Locust (<em&gt; Schistocerca americana</em&gt;) Circuitos olfativas

Xenopus laevis renacuajos prefieren nadar en la parte blanca de un / tanque blanco negro. Este comportamiento es guiado por su visión. Sobre la base de este comportamiento, se presenta un ensayo simple para probar la función visual de los renacuajos.

Un ensayo de comportamiento simple para Pruebas de función visual en<em&gt; Xenopus laevis</em

El bulbo olfativo accesorio ratón (AOB) ha sido difícil de estudiar en el contexto de la codificación sensorial. Este sentido, demuestran una disección que produce un vivo preparación ex en el que las neuronas AOB permanecen funcionalmente conectados a sus entradas de periferia, facilitando la investigación sobre el procesamiento de información de las feromonas del ratón y kairomones.

Ex vivo la Producción de la Bombilla órgano vomeronasal y accesorios olfativa Intacto

Describimos un protocolo para el marcaje in vivo de neuronas sensoriales olfativas mediante electroporación y posterior escaneo láser confocal o microscopía multifotónica para visualizar la morfología neuronal y su desarrollo a lo largo del tiempo.

El sistema olfativo como un modelo para estudiar los patrones de crecimiento axonal y Morfología En Vivo

El análisis de las propiedades fisiológicas de las neuronas sensoriales olfativas aún enfrenta limitaciones técnicas. Aquí los registramos a través de una pinza de parche perforada en una preparación intacta del epitelio olfativo en ratones dirigidos a genes. Esta técnica permite la caracterización de las propiedades de la membrana y las respuestas a ligandos específicos de neuronas que expresan receptores olfativos definidos.

Perforado grabación de patch-clamp de ratón neuronas sensoriales olfativas en neuroepitelio Intacto: Análisis funcional de las neuronas que expresan un odorante del receptor Identificado

Aquí describimos un protocolo para medir y analizar las respuestas de temperatura en el bulbo olfatorio de Xenopus laevis. Las neuronas receptoras olfativas y las células mitrales se tiñen diferencialmente, después de lo cual se registran los cambios en el calcio, lo que refleja una sensibilidad de algunas redes neuronales en el bulbo a las caídas de temperatura inducidas en la nariz.

Grabación de la actividad neuronal inducida por temperatura a través de la supervisión de cambios de calcio en el bulbo olfatorio de<em&gt; Xenopus laevis</em

Este protocolo analiza comportamiento navegación de larva de Drosophila en respuesta a la estimulación simultánea de la optogenetic de sus neuronas olfativas. Luz de longitud de onda de 630 nm se usa para activar las neuronas olfativas individuales expresando una rodopsina canal rojo-cambiado de puesto. Movimiento de larvas al mismo tiempo se realiza un seguimiento grabado digitalmente y analizados utilizando el software de medida.

Seguimiento de comportamiento larvario de Drosophila en respuesta a la estimulación de la Optogenetic de las neuronas olfatorias

Este protocolo tiene como objetivo demostrar cómo microinyectar una mezcla de ADN/DOTAP en los auriculares de embriones Xenopus laevis de un día de edad, y cómo imagen y reconstrucción de proteínafluorescentes verdes individuales (GFP) expresando árboles axonales ópticos en intactos, los renacuajos vivos de Xenopus.

Microinyección de ADN en los oculares en embriones de Xenopus laevis e imágenes de gFP que expresan los árboles axonales ópticos en los renacuajos de Xenopus vivos

Este protocolo describe el procedimiento de disección, la condición de cultivo y las imágenes en vivo de un sistema de explante antena-cerebro para el estudio del ensamblaje del circuito olfativo.

Un sistema de explante para estudios de imágenes de lapso de tiempo del ensamblaje de circuitos olfativos en Drosophila

Describimos aquí los métodos para inducir y analizar la remodelación dependiente de la experiencia olfativa de los glomérulos sinápticos del lóbulo antenal en el cerebro juvenil de Drosophila .

Remodelación dependiente de la experiencia de la conectividad sináptica de las neuronas sensoriales olfativas del cerebro juvenil en un período crítico de la vida temprana

Aprende a evaluar las vías olfatorias en renacuajos de Xenopus mediante técnicas de imagen in vivo y análisis conductual. Este método permite estudiar el procesamiento de información olfativa y la función de terminales presinápticas en neurobiología.

Evaluación funcional de las vías olfatorias en los renacuajos de Xenopus de vida

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