Células vivas, imágenes y análisis cuantitativo de las células epiteliales embrionarias en Xenopus laevis

El objetivo general de este procedimiento es demostrar métodos de imagen en vivo y cuantificación sencilla para analizar la morfología de células epiteliales embrionarias. Esto se logra primero preparando todas las herramientas y aparatos necesarios. El segundo paso del procedimiento consiste en extraer X explan de embriones de rana y alojarlos en cámaras para cultivo a largo plazo.

El tercer paso del procedimiento consiste en obtener imágenes de alta resolución de células epiteliales en tiempo real. El paso final del procedimiento es cuantificar los detalles morfológicos de las células epiteliales utilizando ImageJ. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran áreas celulares rastreadas e intensidades de membrana mediante microscopía confocal de alta resolución. Hola, soy Sagar Joshi del Laboratorio Davidson en el Departamento de Bioingeniería de la Universidad de Pittsburgh.

Hoy les mostraremos un procedimiento para el análisis cuantitativo e imagen de células epiteliales embrionarias de Xenos lavia en células vivas. Utilizamos este procedimiento para estudiar cambios en tiempo real del citoesqueleto celular. Así que comencemos.

Para preparar cámaras para el cultivo de casquetes de blastoporo, use grasa de silicona para sellar una cámara acrílica personalizada o una arandela de nylon pequeña a un cubreobjetos grande de 45 por 50 milímetros. Añada un mililitro de BSA al 1 % en un tercio de XMBS a la cámara. Recubra fragmentos pequeños de cubreobjetos con la misma solución e incube durante dos a cuatro horas a temperatura ambiente o durante la noche a cuatro grados Celsius.

Para reducir la adhesión del explante X al vidrio, enjuague y llene la cámara con medio DFA hasta justo antes de transferir los X, enjuague los fragmentos de cubreobjetos de la misma manera. Luego, sumérjalos en un recipiente con embriones en cultivo DFA que hayan sido microinyectados en la etapa de una a cuatro células con el ARN mensajero deseado hasta la etapa deseada en un tercio de XMBS. Utilice una pipeta de transferencia con una abertura inclinada para transferir los embriones a un recipiente con DFA bajo un microscopio estereoscópico de disección.

Utilice pinzas para aislar los embriones y extirpar una planta CapEx animal. Utilice un lazo de cabello para sostener un embrión en una posición. Utilice un cuchillo de cabello para hacer una pequeña incisión en el polo animal.

Realice cortes suaves y repetidos con el fórceps para ampliar la incisión y retirar el ectodermo del capuchón. Excise tres o cuatro x explantes de la misma manera. Luego, utilice una pipeta de transferencia para trasladarlos a la cámara de cultivo preparada.

Utilizando el lazo de cabello, coloque cada X explan de manera que el epitelio quede orientado hacia el fondo de la cámara. Con pinzas, sostenga un fragmento de cubreobjetos por su centro.

Sumerja los extremos en grasa de silicona. Coloque un fragmento sobre cada explicación X. Fije ligeramente cada fragmento en su lugar con pequeñas cantidades de grasa de silicona.

Teniendo cuidado de no aplastar completamente el X explan con una fuerza excesiva. Llene la cámara con DFA y cubra los bordes superiores de la cámara con grasa de silicona. Luego selle la parte superior con una lámina de cubierta de 24 x 40 milímetros.

Ajuste el nivel del DFA dentro de la cámara para reducir las burbujas de aire y utilice un tejido para absorber cualquier exceso. Ahora las plantas X pueden cultivarse a largo plazo en la cámara sellada durante un día a temperatura ambiente; coloque el objetivo de 20 x de un microscopio confocal en su posición. Coloque la cámara que contiene el explante X sobre la platina del microscopio y coloque pequeños pesos de equilibrio sobre la cámara para mantenerla en posición bajo campo brillante.

Ajuste el enfoque y utilice el posicionamiento grueso para visualizar los extremos apicales de las células superficiales. Cambie a fluorescencia y a un objetivo de mayor potencia. Para obtener imágenes individuales o películas de lapso de tiempo del epitelio del explante, ajuste la adquisición para lograr la mejor imagen posible.

Consulte la parte escrita de este protocolo para obtener consejos sobre el ajuste y la adquisición de imágenes. Mantenga la potencia del láser tan baja como sea posible. Capture imágenes o películas de lapso de tiempo del epitelio x.

Consulte la sección escrita del protocolo para obtener sugerencias sobre la recopilación de datos. Los archivos de imágenes confocales pueden utilizarse para extraer datos de diversas maneras. A continuación se presentan dos ejemplos de cómo analizar archivos de datos utilizando el software de análisis Image J con el complemento bio formats.

Para medir el área celular de una célula epitelial, despliegue el menú analizar y haga clic en establecer mediciones. Seleccione la herramienta de selección en la barra de herramientas y trace el contorno de la célula en el menú analizar, seleccione herramientas y luego el administrador de ROI. Para abrir el administrador de regiones de interés, presione control t.

Para agregar el contorno al administrador de ROI, seleccione y agregue tantos contornos como desee desde la imagen. Luego, haga clic en guardar para almacenar el conjunto de ROI en el administrador de ROI. Haga clic en medir.

La ventana de resultados mostrará ahora las áreas medidas de cada ROI. Para medir la intensidad de una membrana celular, seleccione la herramienta de línea recta de la barra de herramientas de ImageJ. Dibuje una línea perpendicular a través de la membrana.

Pulse CTRL T como en el ejemplo anterior. Para agregar la selección al administrador de ROI, despliegue el menú analizar y haga clic en perfil de trazado para generar un gráfico de intensidades relativas a lo largo de la línea. Para guardar el gráfico como una imagen, haga clic en guardar en la nueva ventana de trazado que aparece.

Despliegue el menú desplegable en Archivo y luego guarde como. Acabamos de mostrarle cómo obtener imágenes en vivo y cuantificar células epiteliales embrionarias a partir de explantes de CapEx animales extirpados. Durante este procedimiento, es importante recordar añadir antibiótico y antibiótico al DFA. Para desalentar el crecimiento bacteriano y fúngico, tenga especial cuidado al presionar los explantes bajo las laminillas, ya que una presión mayor de la necesaria puede aplastar el explante.

También es importante recordar configurar de forma óptima el microscopio confocal para obtener datos de imágenes de calidad máxima. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.