Name: Células vivas, imágenes y análisis cuantitativo de las células epiteliales embrionarias en Xenopus laevis /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-23T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: Aprende técnicas de imagen en vivo y análisis cuantitativo de células epiteliales embrionarias en Xenopus laevis. Este protocolo utiliza microscopía confocal para estudiar la morfogénesis epitelial en tiempo real.

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Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud (R01-HD044750), una subvención de carrera de la Fundación Nacional de Ciencias, y el apoyo de la Asociación Americana del Corazón (A partir de Grant-in-Aid). Los autores agradecen a los miembros del laboratorio de Davidson: HY Kim, M. y J. von Dassow Zhou (para ayudar en las tareas de laboratorio al día), y Zhang Lin por su ayuda en la biología molecular y la síntesis de ARNm. Reconocemos los esfuerzos experimentales de los laboratorios de la rana (especialmente Ray Keller y Doug DeSimone) que han contribuido a alguna parte de este protocolo, mediante el desarrollo y pruebas de los distintos métodos en los últimos años. Damos las gracias a Richard Harland y Wallingford Juan para sus regalos de tipo de miembros de las buenas prácticas agrarias y los plásmidos moesina-gfp respectivamente.

<ol><li>Ninomiya, H., Winklbauer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+coating+controls+mesenchymal+shape+change+through+tissue-positioning+effects+and+reduction+of+surface-minimizing+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Epithelial coating controls mesenchymal shape change through tissue-positioning effects and reduction of surface-minimizing tension.</a> Nat Cell Biol. 10 (1), 61-61 (2008).</li>
<li>Kay, B. K., Peng, H. B. Xenopus laevis: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. , Academic Press. New York. (1991).</li>
<li>Cross, M. K., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obtaining+eggs+from+Xenopus+laevis+females%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Obtaining eggs from Xenopus laevis females.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Cohen, S., Au, S., Pante, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+Xenopus+laevis+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of Xenopus laevis oocytes.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Tables of Xenopus laevis (Daudin). , Elsevier North-Holland Biomedical Press. Amsterdam. (1967).</li>
<li>Davidson, L. A., Ezin, A. M., Keller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+wound+healing+by+apical+contraction+and+ingression+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Embryonic wound healing by apical contraction and ingression in Xenopus laevis.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 53 (3), 163-163 (2002).</li>
<li>Joshi, S. D., Dassow, M. von, Davidson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+control+of+excitable+embryonic+tissues%3A+three+stimuli+induce+rapid+epithelial+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Experimental control of excitable embryonic tissues: three stimuli induce rapid epithelial contraction.</a> Exp Cell Res. 316 (1), 103-103 (2010).</li>
</ol>

Hemos presentado los protocolos experimentales utilizados regularmente en nuestro laboratorio para la imagen del citoesqueleto cambian dinámicamente en la corteza celular apical y oscilantes las membranas celulares de las células epiteliales en los embriones de Xenopus. Se debe utilizar estos protocolos como punto de partida para la creación de imágenes en vivo de las formas de las células epiteliales, la optimización de este protocolo es esencial, y algunos de los valores cambian en función del tipo de sistema...

células vivas, imágenes y análisis cuantitativo de las células epiteliales embrionarias en xenopus laevis</em

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embrionario las células epiteliales servir como un modelo ideal para estudiar la morfogénesis, donde multicelulares tejidos experimentan cambios en su geometría, tales como cambios en el área de la superficie celular y la altura de la celda, y donde las células sufren mitosis y la migración. Además, las células epiteliales también pueden regular los movimientos morfogenéticos en los tejidos adyacentes<sup&gt; 1</sup&gt;. Un método tradicional para estudiar las células epiteliales y los tejidos implican la fijación química y métodos histológicos para determinar la morfología de las células o la localización de las proteínas de interés. Estos enfoques siguen siendo útiles y proporcionar &quot;instantáneas&quot; de las formas celulares y la arquitectura del tejido, sin embargo, aún queda mucho por comprender acerca de cómo las células adquieren formas específicas, como diversas proteínas se mueven o localizar a los puestos específicos, y lo que las células caminos seguir hacia su destino final destino diferenciado. De alta resolución de imágenes en directo complementa los métodos tradicionales y también permite una investigación más directa en los procesos celulares implicados en la dinámica, la formación, mantenimiento y morfogénesis de las hojas epiteliales multicelulares. Aquí nos demuestran los métodos experimentales de la tapa de aislamiento de los tejidos de los animales de<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embriones de imagen confocal de células epiteliales y métodos sencillos de medición que en conjunto pueden aumentar los estudios moleculares y celulares de la morfogénesis epitelial.

Xenopus epitelios embrionarios son un sistema modelo ideal para estudiar los comportamientos celulares, tales como el desarrollo de la polaridad y cambiar de forma durante la morfogénesis epitelial. Histología tradicional de muestras fijas cada vez se complementa con células vivas de imagen confocal. Aquí se demuestra métodos para aislar los tejidos de rana y visualizar en directo las células epiteliales y su citoesqueleto utilizando células vivas, la microscopía confocal.

Células vivas, imágenes y análisis cuantitativo de las células epiteliales embrionarias en Xenopus laevis</em

Las células epiteliales embrionarias constituyen un modelo ideal para estudiar la morfogénesis, proceso en el cual los tejidos multicelulares experimentan cambios en su geometría, tales como cambios...

El objetivo general de este procedimiento es demostrar métodos de imagen en vivo y cuantificación sencilla para analizar la morfología de células epiteliales embrionarias. Esto se logra primero preparando todas las herramientas y aparatos necesarios. El segundo paso del procedimiento consiste en extraer X explan de embriones de rana y alojarlos en cámaras para cultivo a largo plazo.El tercer paso del procedimiento consiste en obtener imágenes de alta resolución de células epiteliales en tiempo real. El paso final del procedimiento es cuantificar los detalles morfológicos de las células epiteliales utilizando ImageJ. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran áreas celulares rastreadas e intensidades de membrana mediante microscopía confocal de alta resolución. Hola, soy Sagar Joshi del Laboratorio Davidson en el Departamento de Bioingeniería de la Universidad de Pittsburgh.Hoy les mostraremos un procedimiento para el análisis cuantitativo e imagen de células vivas de epitelio embrionario de Xenos lavia. Utilizamos este procedimiento para estudiar cambios en tiempo real del citoesqueleto celular. Así que comencemos.Para preparar cámaras para el cultivo de casquet

live-cell-imaging-quantitative-analysis-embryonic-epithelial-cells

Research

Investigación

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Biology

Biología

Usando la punta fina micropipetas se inyecta el plásmido de ADN en subdominios de somitas pollo o tubos neurales. La concentración del plásmido se ajusta a generar solo las células transfectadas. A continuación, permitir que las células se desarrollan en poblaciones clonales.

Transfección de células individuales en embriones de pollo

Tisular embrionario en tiempo real es un reto durante largos períodos de tiempo. Aquí presentamos un ensayo para el seguimiento de los cambios celulares y subcelulares en la médula espinal de pollo durante largos periodos con alta resolución espacial y temporal. Esta técnica puede ser adaptado para otras regiones del sistema nervioso y embrión en desarrollo.

Imágenes de alta resolución en vivo del comportamiento de las células en el desarrollo de neuroepitelio

Xenopus laevis proporciona un sistema modelo ideal para el estudio de la especificación del destino celular y la función fisiológica de las células individuales de la retina en cultivo de células primarias. Aquí se presenta una técnica para la disección de tejidos retinales y la generación de cultivos de células primarias que se toman imágenes de la actividad del calcio y se analizaron mediante hibridación in situ.

Disección, Cultura y Análisis de<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Tejido de la retina embrionaria

Aquí desarrollamos las herramientas necesarias...

Ex vivo de imágenes en vivo de las divisiones sola celda en ratón neuroepitelio

El manuscrito que aquí ofrece un simple conjunto de métodos para el análisis de la secreción y la difusión de ligandos marcados con fluorescencia en Xenopus. Esto proporciona un contexto para probar la capacidad de otras proteínas para modificar la distribución de ligando y permitir que los experimentos que pueden dar información sobre los mecanismos que regulan los gradientes de morfogenes.

Uso del análisis confocal de<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Encargado de investigar moduladores de Wnt y Shh morfógeno Degradados

Este protocolo demuestra un método basado en la fluorescencia para visualizar la vasculatura y para cuantificar su complejidad en Xenopus tropicalis . Los vasos sanguíneos pueden visualizarse minutos después de la inyección de un colorante fluorescente en el corazón de un embrión después de manipulaciones genéticas y / o farmacológicas para estudiar el desarrollo cardiovascular in vivo .

Visualización y análisis cuantitativo de la angiogénesis embrionaria<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Describimos los pasos que permiten muestreo rápido in situ de una pequeña porción de una célula individual de alta precisión y mínima invasión, mediante micro-muestras basadas en el tubo capilar, para facilitar la caracterización química de una instantánea de la actividad metabólica en embriones vivos utilizando una plataforma de espectrometría de masas y electroforesis capilar célula hecha a la medida.

Microsondeo electrónico capilar electroforesis de espectrometría de masas para unicelular metabolómica en embriones de Rana viva (Xenopus laevis)

Presentamos un protocolo de dos partes que combina imágenes fluorescentes de calcio con hibridación in situ, permitiendo al experimentador correlacionar patrones de actividad de calcio con perfiles de expresión génica a nivel de una sola célula.

Imágenes fluorescentes de calcio y posterior hibridación in situ para la caracterización de precursores neuronales en Xenopus laevis

Describimos un protocolo simple para desarrollar organoides epiteliales mucociliares a partir de células ectoderm profundas aisladas de embriones Xenopus laevis. Los progenitores multipotentes regeneran precursores de células de copa epitelial y permiten el seguimiento en vivo de la iniciación y progresión de las transiciones celulares en la superficie de los organoides.

Organoides epiteliales mucocilios de células embrionarias de Xenopus: generación, cultura e imágenes en vivo de alta resolución

Describimos un método para la preparación y obtención de imágenes en vivo de extractos citoplasmáticos sin diluir de huevos de Xenopus laevis .

Xenopus laevis Preparación de extracto de huevo y métodos de imágenes en vivo para visualizar la organización citoplasmática dinámica

Aquí describimos una caracterización proteómica basada en espectrometría de masas de linajes celulares con destinos tisulares conocidos en el embrión vertebrado de Xenopus laevis .

Proteómica de espectrometría de masas guiada por linaje celular en el embrión en desarrollo (rana)

Aprende técnicas de imagen en vivo y análisis cuantitativo de células epiteliales embrionarias en Xenopus laevis. Este protocolo utiliza microscopía confocal para estudiar la morfogénesis epitelial en tiempo real.

Células vivas, imágenes y análisis cuantitativo de las células epiteliales embrionarias en Xenopus laevis

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