Células vivas, imágenes y análisis cuantitativo de las células epiteliales embrionarias en Xenopus laevis

El objetivo general de este procedimiento es demostrar la obtención de imágenes en vivo y métodos sencillos de cuantificación para analizar la morfología de las células epiteliales embrionarias. Esto se logra preparando primero todas las herramientas y aparatos. El segundo paso del procedimiento consiste en extirpar X explan de embriones de rana y alojarlos en cámaras para su cultivo a largo plazo.

El tercer paso del procedimiento es recopilar imágenes de alta resolución de las células epiteliales en tiempo real. El paso final del procedimiento es cuantificar los detalles morfológicos de las células epiteliales utilizando la Imagen J. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran las áreas celulares rastreadas y las intensidades de membrana a través de la microscopía confocal de alta resolución. Hola, soy Sagar Joshi del Laboratorio Davidson en el Departamento de Bioingeniería de la Universidad de Pittsburgh.

Hoy te mostraremos un procedimiento para la obtención de imágenes de células vivas y el análisis cuantitativo de células epiteliales embrionarias de Xenos lavia. Utilizamos este procedimiento para estudiar los cambios en el citoesqueleto celular en tiempo real. Así que comencemos.

Para preparar las cámaras para el cultivo de tapas de animales, use grasa de silicona para sellar una cámara acrílica personalizada o una arandela de nailon pequeña en una cubierta de vidrio grande de 45 por 50 milímetros. Agregue un mililitro de 1%BSA en un tercio XMBS a la cámara. Cubra los pequeños fragmentos de cubreobjetos con la misma solución en incubación durante dos a cuatro horas a temperatura ambiente o toda la noche a cuatro grados centígrados.

Para reducir la adherencia del explan X al vidrio, enjuague y llene la cámara con medio DFA hasta que justo antes de transferir en el xs, enjuague los fragmentos de cubreobjetos de la misma manera. A continuación, sumérjalos en una placa de embriones de cultivo DFA que se microinyectaron en la etapa de una a cuatro células con la RM NA deseada hasta la etapa deseada en un tercio XMBS. Utilice una pipeta de transferencia con una abertura inclinada para transferir los embriones a una placa de DFA bajo un microscopio estereoscópico de disección.

Use fórceps para extraer los embriones y extirpar una planta CapEx animal. Use un lazo para el cabello para sostener un embrión en una posición. Use un cuchillo de pelo para hacer una pequeña incisión en el poste del animal.

Realice cortes suaves y repetidos para extender la incisión y quitar el ectodermo de la tapa. Impuestos especiales tres o cuatro x explique de la misma manera. Y use una pipeta de transferencia para moverlos a la cámara de cultivo preparada.

Usando el lazo para el cabello, coloque cada X explan de modo que el epitelio mire hacia el fondo de la cámara. Uso de fórceps. Sostenga un fragmento de cubreobjetos en su centro.

Sumerge los extremos en grasa de silicona. Coloque un fragmento sobre cada X explicación. Fije ligeramente cada fragmento en su lugar con pequeños toques de grasa de silicona.

Teniendo cuidado de no romper completamente el modelo X con fuerza excesiva. Llene la cámara con DFA, cubra los bordes superiores de la cámara con grasa de silicona. A continuación, selle la parte superior con un cubreobjetos de 24 x 40 milímetros.

Ajuste el nivel del DFA dentro de la cámara para reducir las burbujas de aire y use un pañuelo de papel para secar cualquier desbordamiento. Las plantas X ahora se pueden cultivar a largo plazo en la cámara sellada durante un día a temperatura ambiente, mover el objetivo 20 x de un microscopio confocal en su lugar. Coloque la cámara que contiene el explan X en la platina del microscopio y coloque pequeños pesos de equilibrio en la cámara para mantenerla en posición bajo campo claro.

Ajuste el enfoque y utilice la posición del curso para visualizar los extremos apicales de las células superficiales. Cambie a fluorescencia y a un objetivo de mayor potencia. Para recopilar imágenes individuales o vídeos time-lapse del epitelio explan, ajuste la adquisición para obtener la mejor imagen posible.

Consulte la parte escrita de este protocolo para obtener consejos sobre el ajuste y la creación de imágenes. Mantener la potencia del láser lo más baja posible. Captura imágenes o vídeos time-lapse del epitelio x explan.

Consulte la parte escrita del protocolo para obtener sugerencias sobre la recopilación de datos. Los archivos de imagen confocal se pueden extraer datos de varias maneras. Aquí hay dos ejemplos de cómo analizar archivos de datos usando el software de análisis Image J con el complemento de formatos de biografía.

Para medir el área de celda de una célula epitelial, despliega el menú Analizar y haz clic en Establecer mediciones. Seleccione la herramienta de selección de la barra de herramientas y delinee la celda en el menú de análisis, seleccione herramientas y, a continuación, administrador de ROI. Para abrir el administrador de regiones de interés, presione control t.

Para agregar el contorno al administrador de ROI, seleccione y agregue tantos contornos como desee de la imagen. A continuación, haga clic en Guardar para guardar el conjunto de ROI en el Administrador de ROI. Haga clic en Medir.

La ventana de resultados ahora mostrará las áreas medidas de cada ROI. Para medir la intensidad de una membrana celular, seleccione la herramienta de línea recta de la barra de herramientas de la imagen J. Dibuja una línea perpendicular a través de la membrana.

Presione CTRL T como en el ejemplo anterior. Para agregar la selección al administrador de ROI, despliega el menú de análisis y haz clic en trazar perfil para generar un gráfico de intensidades relativas a lo largo de la línea. Para guardar el gráfico como una imagen, haga clic en guardar en la nueva ventana de trazado que aparece.

Despliega el menú de lista para archivar y, a continuación, guárdalo como Acabamos de mostrarte cómo obtener imágenes en vivo y cuantificar células epiteliales embrionarias a partir de CapEx de animales extirpados. Al realizar este procedimiento, es importante recordar agregar antibiótico y antibiótico al DFA. Para desalentar el crecimiento de bacterias y hongos, tenga especial cuidado al presionar los explantes debajo de los cubreobjetos porque una presión mayor de la requerida puede romper el explan.

También es importante recordar que debe tener una configuración óptima en el microscopio confocal para obtener datos de imagen de máxima calidad. Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.