Un sistema simplificado para la evaluación de la célula Mechanosensing y Durotaxis In Vitro

Muchas células de mamíferos migran preferentemente hacia una matriz o sustrato más rígido a través de durotaxis. El objetivo de este protocolo es proporcionar un sistema in vitro simple que pueda ser utilizado para estudiar y manipular el comportamiento de la durotaxis celular mediante la incorporación de sustratos de polidimetilsiloxano (PDMS) de rigidez definida, interactuando con cubreobjetos de vidrio.

El objetivo general de este procedimiento es proporcionar un sistema simplificado para el análisis de la duradura celular a través de la cual muchas células de mamíferos migran preferentemente hacia un sustrato más rígido. Esto se logra preparando primero sustratos de polimetilsuboxano o PDMS de rigidez definida. A continuación, el PDMS preparado se vierte en cada pocillo de una placa de seis pocillos y se eliminan las burbujas de aire.

Luego, las cámaras Durex se completan con la colocación de un cubreobjetos esterilizado en la parte superior del PDMS en cada pozo para crear una superposición. El paso final es sembrar las células en las cámaras de impuestos Duro a una densidad que les dé a las células suficiente espacio para migrar sin interacciones significativas con otras células. En última instancia, la microscopía de células vivas se utiliza para estudiar las axxis en las células migratorias.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la poliacrilamida, es que hay un solo paso entre el PDMS blando y el vidrio rígido en lugar de las alternativas de gel degradado. Además, el recubrimiento de PDMS con matriz extracelular Los componentes como la fibronectina no requieren reticulación química, que es necesaria para los geles de poliacrilamida. Para preparar primero una placa de cultivo de tejidos de seis pocillos, rasgue el resto con un tubo cónico de 50 mililitros.

Pese aproximadamente 10 gramos de la solución base de polidimetil suboxano o PDMS en el tubo de 50 mililitros. Para un sustrato de 90 a uno, divida el peso medido de la solución base de PDMS por 90. Para determinar la cantidad correcta de solución de reticulante necesaria, agregue la cantidad calculada de solución de reticulante PDMS al tubo mezclado vigorosamente con la mezcla de reticulante base A-P-D-M-S durante cinco minutos a temperatura ambiente.

Usando una espátula pequeña en esta etapa, la mezcla contendrá una pequeña cantidad de burbujas de aire. Centrifugar el sustrato PDMS en una centrífuga de sobremesa durante cinco minutos a 50 veces. G.Agregue temperatura ambiente para eliminar las burbujas si todavía hay burbujas.

Después de los cinco minutos, vuelva a pipetear un mililitro del sustrato de PDMS de 90 a 1 en cada pocillo del cultivo de tejidos tratado. Placa de seis pocillos. Cualquier burbuja de aire restante presente en el PDMS se puede eliminar en esta etapa reventándolas con una aguja de calibre 21.

Deje que el PDMS se extienda durante 30 minutos en el pozo. A continuación, hierva el vaso de 12 milímetros Número uno, cubra los trozos en agua destilada durante cinco minutos, un total de tres veces. Coloque un cubreobjetos seco en cada pocillo de la placa de cultivo de tejidos tocando suavemente un lado de la tapa.

Deslícelo en la solución de PDMS y luego deje caer el cubreobjetos sobre el PDMS. A medida que el cubreobjetos se asienta, el PDMS comenzará a invadir los bordes del cubreobjetos, pero no lo cubrirá por completo. Esto generará una interfaz entre el PDMS y el vidrio después del curado.

Incubar la placa a 70 grados centígrados en un horno durante 16 horas para curar el PDMS. Finalmente, coloque la placa en una campana de cultivo celular y esterilice con UV durante 10 minutos. Cubra cada cámara de durox con un mililitro de fibronectina en solución salina tamponada con fosfato sin calcio y magnesio durante una hora a 30 grados centígrados.

Asegúrese de que toda la superficie esté sumergida en la solución de fibronectina en PBS. Prepare la albúmina sérica bovina al 1% o BSA con un peso de 0,5 gramos de BSA y la disuelva en 50 mililitros de filtro PBS. Esterilice una solución a través de un filtro puntual de 22 micras antes de calentar a 80 grados centígrados durante 12 minutos.

A continuación, aspire la solución de fibronectina y lave las cámaras tres veces con PBS. Agregue un mililitro de BSA desnaturalizado por calor en PBS a cada pocillo e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente, con ojos de tripsina y cuente las celdas de elección mientras las cámaras durex se bloquean con el calor. BSA desnaturalizado aspira la solución de BSA de las cámaras justo antes de las celdas de recubrimiento.

Coloque 10.000 células en un volumen de dos mililitros en cada pocillo de la cámara doax. Usando el medio requerido para el tipo de célula particular de elección, permita que las células se adhieran y se extiendan sobre el sustrato durante cuatro horas en una incubadora humidificada a 37 grados Celsius con 5% de CO2, realice imágenes de células vivas en un microscopio invertido utilizando contraste de fase con un objetivo de 10 x. El microscopio debe estar equipado con una cámara humidificada ambiental cerrada, que permita el control de la temperatura a 37 grados Celsius y 5% de CO2 durante la obtención de imágenes a largo plazo.

Después de que las células se hayan diseminado durante aproximadamente 3,5 horas, se ensambla la placa en la cámara del microscopio. Deje que las muestras se equilibren en la cámara durante 30 minutos. Configure visitas multipunto automatizadas en el microscopio si están disponibles.

Concéntrese en la interfaz entre el PDMS y el cubreobjetos de vidrio y elija puntos para obtener imágenes en toda la interfaz. Con un promedio de 40 puntos por imagen de cámara Durex, las celdas cada 10 minutos durante un máximo de 16 horas, la región de interés aparecerá como dos líneas, con la línea exterior correspondiente al borde del cubreobjetos y la línea interior correspondiente a la interfaz real entre el PDMS y el cubreobjetos. Para analizar los datos, genere una hoja de cálculo como la que se muestra en el protocolo de texto.

Cuente el número de eventos de cruce del PDMS a la superficie de vidrio y viceversa de cada película generada. Un evento de cruce se define como el núcleo de la célula que pasa por el límite entre el PDMS y el vidrio en cualquier dirección. Registre el número de eventos de cruce en la columna correspondiente de la hoja de cálculo de Excel para cuantificar varios cruces.

Cuente el número de veces que la celda cruzó la interfaz. Ese número debe registrarse en la columna de Excel correspondiente al sustrato en el que se ubicó la celda al final de la película. Repita el análisis para cada celda que cruce la interfaz en la película.

Excluya las células que migran fuera del campo de visión durante la obtención de imágenes. Calcule el porcentaje de células que migraron de PDMS a la superficie del vidrio y, por lo tanto, se sometieron a Duro Texas. Para ello.

Sume el número de eventos de cruce de suave a duro y los múltiples eventos de cruce que terminaron en duro y divida por el número total de eventos de cruce. Calcule el porcentaje de cruzamientos múltiples dividiendo el total de cruces múltiples por el número total de cruces para comenzar a comprender el mecanismo molecular por el cual las células corresponden a señales mecánicas en su entorno. Proteínas específicas pueden ser eliminadas usando IRNA, como se muestra aquí.

Alrededor del 70% de las células controladas tratadas con irna presentaban axxis. En contraste, cuando la brecha CD se eliminó usando ARNi, las células no tenían preferencia en cuanto a si migrar al sustrato duro o blando. Además, las celdas de derribo de la brecha CD cruzaron el múltiplo del límite.

Mientras que las células tratadas con irna de control generalmente solo cruzan el límite una vez que las pistas de control son representativas. Las células de irna muestran que las células generalmente migran a través del límite una vez y preferentemente permanecen en la superficie más rígida en comparación con el espacio CD. Irna trató células que no demostraron una preferencia por ninguna de las dos rigideces y cruzaron el límite varias veces.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo preparar los sustratos de PDMS, ensamblar las cámaras de duris y cuantificar los impuestos DUR.