Name: Un sistema simplificado para la evaluación de la célula Mechanosensing y Durotaxis In Vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Aprende a evaluar la durotaxis celular in vitro utilizando sustratos de PDMS con rigidez definida. Este método simplificado permite estudiar la migración de células hacia superficies más rígidas mediante microscopía de células vivas.

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Este trabajo es apoyado por el NIH R01 GM47607, CA163296 y NSF 1.334.493 de CET. Damos las gracias a los miembros del laboratorio Turner para la lectura crítica del manuscrito. Todos los datos que se muestran en este informe fueron reproducidas con permiso de Wormer et al. 2014 11.

1. Preparación de Durotaxis Cámaras <ol><li> Para preparar un solo 6 pocillos placa de cultivo de tejidos, tarar la balanza con un tubo cónico de 50 ml. Pesar aproximadamente 10 g de la solución de base de PDMS en el tubo de 50 ml (la solución es bastante viscoso). </li><li> Para un 90: 1 sustrato (Cumplimiento de ~ 1 kPa), se divide el peso medido de la solución de base de PDMS en el tubo por 90 para determinar la cantidad correcta de solución de agente de reticulación necesario. Añadir la cantidad calculada de la solución reticulante PDMS al mismo tubo. Ejemplo: 10 g / 90 = 0,11 g. Añadir 0,11 g de la solución de agente de reticulación PDMS a la solución base de PDMS. NOTA: La base y reticulantes soluciones son a la vez proporcionan en el kit de PDMS. </li><li> Mezclar vigorosamente la mezcla base / reticulante PDMS durante 5 min a RT usando una espátula pequeña. En esta etapa la mezcla contendrá un gran número de burbujas de aire. </li><li> Centrifugar el sustrato PDMS en una centrífuga de mesa durante 5 min a 50 xg a temperatura ambiente para eliminar el bubbles. Aún si hay burbujas después del 5 min, se centrifuga de nuevo. </li><li> Pipeta 1 ml de 90: 1 PDMS sustrato en cada pocillo del cultivo de tejidos tratados placa de 6 pocillos. Cualquier burbuja de aire restantes presentes en los PDMS pueden ser eliminados en esta etapa haciendo estallar ellos usando una aguja de 21 G. Permitir que el PDMS se extiendan durante 30 minutos en el pozo. </li><li> Hervir 12 mm de vidrio # 1 cubreobjetos en agua destilada durante 5 min. Repetir dos veces y almacenar los cubreobjetos en agua destilada. </li><li> Coloque uno, cubreobjetos se secó en cada pocillo de la placa de cultivo de tejidos tocando suavemente un lado del cubreobjetos en la solución de PDMS a continuación, colocar el cubreobjetos sobre los PDMS. A medida que el cubreobjetos se asienta, los PDMS comenzarán a invadir lo largo de los bordes del cubreobjetos, pero no cubren completamente. Esto generará una interfaz entre el PDMS y el vidrio después del curado (ver la Figura 1A, B). </li><li> Incubar la placa a 70 ° C en un horno durante 16 horas para curar (se endurecen) el PDMS. Coloque el plate en una campana de cultivo celular y UV esterilizar durante 10 minutos. NOTA: Lo mejor es hacer las placas en un par de días de uso. Sin embargo, las placas pueden ser envueltos en Parafilm sin ningún tipo de tampón y se almacenaron a 4 ° C durante un máximo de 2 semanas sin ninguna disminución notable en la calidad. </li></ol> 2. Celular Chapado NOTA: Si el estudio del efecto de la caída siRNA mediada, realice la caída con las instrucciones del fabricante o el protocolo optimizado para el tipo de célula de elección. <ol><li> Escudo durotaxis cada cámara con 1 ml de 10 mg / ml de fibronectina en PBS sin calcio y magnesio durante 1 hora a 37 ° C. Alternativamente, la fibronectina se puede aplicar el día antes del análisis mediante la incubación de los PDMS con 10 mg / ml de fibronectina en PBS durante 16 horas a 4 ° C. Asegúrese de que toda la superficie se sumerge en el fibronectina en solución PBS. </li><li> Preparar desnaturalizado por calor 1% de BSA. Pesar 0,5 g de BSA y se disuelven en 50 ml de PBS.Filtrar esterilizar la solución a través de un filtro y el calor de 0,22 micras a 80 ° C durante 12 min. Nota: Prepare esta solución el día antes de la célula de recubrimiento y se almacena a 4 ° C. </li><li> Aspirar la solución de fibronectina y lavar 3 veces con PBS. Añadir 1 ml de BSA desnaturalizado calor en PBS a cada pocillo e incubar durante 30 min a TA. </li><li> Trypsinize y contar las células de elección, mientras que las cámaras de durotaxis están bloqueando con la BSA desnaturalizado por calor. </li><li> Plate 1 x 10 5 células en un volumen de 2 ml en cada pocillo de la cámara durotaxis, utilizando los medios necesarios para el tipo de célula particular de elección. Permitir que las células se adhieran y se extendieron sobre el sustrato durante 4 horas en un incubador humidificado a 37 ° C con 5% de CO 2. NOTA: las células U2OS se mantienen rutinariamente en DMEM con 10% FBS, complementado con 2 mM L-glutamina, piruvato de sodio 1 mM, y 10 IU / ml de penicilina, 10 mg / ml de estreptomicina. NOTA: El número de células utilizado en este ejemplo está optimizado paraCélulas U2OS. Se puede requerir optimización para otros tipos de células. Esta densidad de las células da suficiente espacio para migrar sin interacciones significativas con otras células. </li></ol> Imaging 3. Células vivas <ol><li> Realizar imágenes de células vivas en un microscopio invertido, con contraste de fase con un objetivo de 10X. El microscopio debe estar equipado con una, cámara húmeda del medio ambiente cerrado, lo que permite el control de la temperatura a 37 ° C y 5% de CO 2 durante la exploración a largo plazo. </li><li> Después de que las células se han extendido durante aproximadamente 3,5 horas, montar la placa en la cámara microscopio. Permitir que la muestra (s) se equilibre en la cámara durante 30 min. </li><li> Establecer automatizado, multi-punto de visita en el microscopio si está disponible. Centrarse en la interfaz entre las 90: 1 PDMS y el cubreobjetos de vidrio y elegir los puntos a la imagen en todo el interfaz con un promedio de 40 puntos por durotaxis cámara. Imagen de las células cada 10 min durante un máximo de 16 horas. NOTA: La reregión de interés aparecerá como dos líneas, con la línea externa correspondiente al borde del cubreobjetos y la línea interior correspondiente a la interfaz real entre el PDMS y el cubreobjetos. Ver Figura 1B. </li></ol> Análisis 4. Datos <ol><li> Generar una hoja de cálculo como en la Tabla 1. </li><li> Cuente el número de eventos de cruce de los PDMS a la superficie de vidrio y viceversa de cada película generada. Anote el número de eventos de cruce en la columna correspondiente en la hoja de cálculo Excel. NOTA: Un evento de cruce se define como el núcleo de la célula que pasa sobre el límite entre el PDMS y productos de vidrio en cualquier dirección. </li><li> Para cuantificar múltiples cruces, contar el número de veces que el celular cruzó la interfaz. Ese número se debe registrar en la columna de excel correspondiente al sustrato sobre el que la célula se encuentra en el extremo de la película. Repita el análisis de todas las células que atraviesa la interfaz en tpelícula que él. Excluir las células que migran fuera del campo de visión durante la exploración. NOTA: También es importante verificar, por recuento de células al inicio del experimento, que las células son capaces de adherirse igual a los PDMS recubiertas de fibronectina y superficies cubreobjetos de vidrio. </li><li> Calcular el porcentaje de células que migró de PDMS a la superficie de vidrio (es decir, se sometió a durotaxis). Añadir el número de cruzar eventos de suave a duro y los múltiples eventos de cruce que terminaron en el disco y se dividen por el número total de eventos de cruce. </li><li> Calcular el porcentaje de múltiples cruces dividiendo el número de cruces de múltiples por el número total de cruces. </li></ol>

<ol><li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126 (4), 677-689 (2006).</li>
<li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).</li>
<li>Levental, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+crosslinking+forces+tumor+progression+by+enhancing+integrin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling.</a> Cell. 139 (5), 891-906 (2009).</li>
<li>Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+movement+is+guided+by+the+rigidity+of+the+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Cell movement is guided by the rigidity of the substrate.</a> Biophysical Journal. 79 (1), 144-152 (2000).</li>
<li>Plotnikov, S. V., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guiding+cell+migration+by+tugging%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Guiding cell migration by tugging.</a> Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 619-626 (2013).</li>
<li>Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+rigidity+causes+strengthening+of+integrin-cytoskeleton+linkages%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin-cytoskeleton linkages.</a> Cell. 88 (1), 39-48 (1997).</li>
<li>Balaban, N. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+and+focal+adhesion+assembly%3A+a+close+relationship+studied+using+elastic+micropatterned+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Force and focal adhesion assembly: a close relationship studied using elastic micropatterned substrates.</a> Nature Cell Biology. 3 (5), 466-472 (2001).</li>
<li>Provenzano, P. P., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+signaling+through+the+cytoskeleton+regulates+cell+proliferation+by+coordinated+focal+adhesion+and+Rho+GTPase+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanical signaling through the cytoskeleton regulates cell proliferation by coordinated focal adhesion and Rho GTPase signaling.</a> Journal of Cell Science. 124 (8), 1195-1205 (2011).</li>
<li>Wang, Y. L., Pelham, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+a+flexible%2C+porous+polyacrylamide+substrate+for+mechanical+studies+of+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells.</a> Methods in Enzymology. 298, 489-496 (1998).</li>
<li>Prager-Khoutorsky, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+polarization+is+a+matrix-rigidity-dependent+process+controlled+by+focal+adhesion+mechanosensing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fibroblast polarization is a matrix-rigidity-dependent process controlled by focal adhesion mechanosensing.</a> Nature Cell Biology. 13 (12), 1457-1465 (2011).</li>
<li>Wormer, D. B., Davis, K. A., Henderson, J. H., Turner, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+focal+adhesion-localized+CdGAP+regulates+matrix+rigidity+sensing+and+durotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">The focal adhesion-localized CdGAP regulates matrix rigidity sensing and durotaxis.</a> PloS ONE. 9 (3), e91815(2014).</li>
<li>Trichet, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+a+large-scale+mechanosensing+mechanism+for+cellular+adaptation+to+substrate+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Evidence of a large-scale mechanosensing mechanism for cellular adaptation to substrate stiffness.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (18), 6933-6938 (2012).</li>
<li>Eyckmans, J., Boudou, T., Yu, X., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hitchhiker%E2%80%99s+guide+to+mechanobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">A hitchhiker’s guide to mechanobiology.</a> Developmental Cell. 21 (1), 35-47 (2011).</li>
<li>Martinac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensitive+ion+channels%3A+molecules+of+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanosensitive ion channels: molecules of mechanotransduction.</a> Journal of Cell Science. 117 (12), 2449-2460 (2004).</li>
<li>Jafar-Nejad, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sec15%2C+a+component+of+the+exocyst%2C+promotes+notch+signaling+during+the+asymmetric+division+of+Drosophila+sensory+organ+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Sec15, a component of the exocyst, promotes notch signaling during the asymmetric division of Drosophila sensory organ precursors.</a> Developmental Cell. 9 (3), 351-363 (2005).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos que revelar.

Aquí se describe un ensayo simple para estudiar durotaxis en la migración de las células. Una de las principales de este ensayo es la facilidad de preparación de las cámaras durotaxis utilizando PDMS. La rigidez de los sustratos puede ser manipulado fácilmente cambiando la relación de la solución de base de PDMS a reticulante para permitir el estudio de diversas rigideces en el ensayo. Sin embargo, una limitación potencial del sistema es que las células sólo están expuestos a un solo cambio en la rigidez del sustrato en...

La matriz extracelular (ECM) se compone de una serie compleja de proteínas estructurales y de reticulación incluyendo el colágeno, fibronectina y laminina. Aunque está bien establecido que el ECM proporciona importante apoyo estructural a los tejidos celulares, cada vez hay más pruebas que indican que las células responden activamente a los cambios físicos en su entorno de ECM para regular diversos procesos celulares, incluyendo la supervivencia celular, la diferenciación y migración celular. Por ejemplo, las diferencias en la rigidez de la ECM pueden conducir las células madre mesenquimales hacia diferentes linajes, con sustratos blandos (~ 1 kPa) que promueven linajes neurogénicos mientras sustratos rígidos (~ 25 kPa) promueven la diferenciación osteogénica 1. Del mismo modo, un aumento en la rigidez de la matriz estromal ha sido demostrado para promover la tumorigénesis mamaria de las células epiteliales y la invasión en el tejido circundante 2,3. Un aspecto particularmente interesante de este mechanosignresultados de la actividad aling en un proceso conocido como durotaxis, en el que las células migran preferentemente hacia un sustrato más rígido 4,5. Las células constantemente sentido, las características físicas de su entorno extracelular a través de receptor de integrina de unión a la ECM. Esto, a su vez, promueve la acumulación de numerosas proteínas estructurales y de señalización a sus dominios citoplásmicos para impulsar la formación de estructuras adhesivas conocidas como adhesiones focales o contactos focales 6,7. Desde integrinas no tienen actividad enzimática intrínseca, las señales se transmiten desde el ECM a través de estas proteínas accesorias para coordinar la respuesta de la célula a su entorno cambiante 8. En consecuencia, la identificación y caracterización de las proteínas clave que intervienen en la regulación de mechanosignaling y durotaxis es un área importante de investigación. Varios sistemas de modelos se han desarrollado para estudiar durotaxis in vitro, pero la mayoría tienenutilizados sustratos revestidos con colágeno de poliacrilamida 4. Sin embargo, la preparación de los sustratos de poliacrilamida puede ser técnicamente difícil y el colágeno utilizado en estos ensayos debe ser reticulado químicamente al sustrato 9. Sustratos de polidimetilsiloxano (PDMS) se ha demostrado que exhiben propiedades mecánicas comparables a los sustratos de poliacrilamida al 10. Sin embargo, los sustratos de PDMS se preparan por simple mezcla de una proporción de la base a agente reticulante y estos sustratos pueden estar recubiertos con proteínas ECM sin la necesidad de reticulación química, haciendo así más fácil PDMS una herramienta para estudiar los efectos de rigidez en el comportamiento celular. En este documento, se describe cómo preparar una cámara durotaxis simple en el que un sustrato suave PDMS se integra con un cubreobjetos de vidrio rígido. El ensayo, como se indica a continuación, ofrece un método rápido y sencillo para estudiar durotaxis. Para este estudio se utilizaron células de osteosarcoma U2OS humanas combinadas con mediada por siRNAdesmontables de cdGAP para estudiar el papel de esta proteína de adhesión focal en durotaxis 11. Es importante destacar que este protocolo se puede adaptar fácilmente a las necesidades individuales. Otros tipos de células pueden ser sustituidos por las células U2OS y cualquier proteína pueden ser derribados o sobreexpresa para determinar los efectos sobre el comportamiento celular durante durotaxis. Además, este protocolo puede ser adaptado para incorporar proteínas etiquetadas con fluorescencia para analizar su dinámica y el comportamiento utilizando FRAP o FRET enfoques.

<table><tbody><tr><td>Polidimetilsiloxano (PDMS)</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td>Sylgard 184 Kit de elastómero de silicona</td></tr><tr><td>#1 Cubreobjetos 12 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-82</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 6 pocillos</td><td>Celltreat</td><td>229106</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td>15-017-CM</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Cellgro</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>Sodio Piruvato</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP356-100</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>BD Biosciences</td><td>610077</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>21600-044</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de halcón</td><td>Celltreat</td><td>229456</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>células U2OS</td><td>ATCC</td><td>HTB-96</td><td></td></tr></tbody></table>

un sistema simplificado para la evaluación de la célula mechanosensing y durotaxis<em&gt; in vitro</em

A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro

Las propiedades de la composición y mecánicas de la matriz extracelular son muy variables entre los tipos de tejidos. Esta diversidad estroma de tejido conectivo en gran medida el comportamiento celular impactos para regular los procesos normal y patológico incluyendo la proliferación celular, la diferenciación, la señalización de adhesión y migración direccional. En este sentido, la capacidad innata de ciertos tipos de células para migrar hacia un sustrato de matriz más rígida, o menos compatible que se conoce como durotaxis. Este fenómeno juega un papel importante durante el desarrollo embrionario, la reparación de heridas y la invasión de células de cáncer. A continuación, describimos un ensayo sencillo para estudiar durotaxis, in vitro, usando sustratos (PDMS) de polidimetilsiloxano. Preparación del descrito durotaxis cámaras crea una interfaz de rigidez entre el gel PDMS relativamente blando y un cubreobjetos de vidrio rígida. En el ejemplo, hemos utilizado estos durotaxis cámaras para demostrar un papel para el cdc42 / Rac1 GTPasa prote activaciónen, cdGAP, en mechanosensing y durotaxis regulación en células de osteosarcoma U2OS humanas. Este ensayo es fácilmente adaptable a otros tipos de células y / o desmontables de otras proteínas de interés, para explorar sus respectivas funciones en mechanosignaling y durotaxis.

Un diagrama esquemático de la cámara de durotaxis se muestra en la Figura 1A. Sustrato PDMS Soft (a 90: mezcla 1 de la base de PDMS a reticulante soluciones) se extiende en una placa de 6 pocillos y un cubreobjetos de vidrio se coloca en la parte superior de los PDMS, que luego cubre parcialmente la superficie superior del cubreobjetos, creando de este modo una interfaz entre los dos sustratos de diferente cumplimiento. La rigidez del sustrato PDMS blando es ~ 1 kPa, que es comparable con el cumplimient...

Muchas células de mamíferos migran preferentemente hacia una matriz o sustrato más rígido a través de durotaxis. El objetivo de este protocolo es proporcionar un sistema in vitro simple que pueda ser utilizado para estudiar y manipular el comportamiento de la durotaxis celular mediante la incorporación de sustratos de polidimetilsiloxano (PDMS) de rigidez definida, interactuando con cubreobjetos de vidrio.

Un sistema simplificado para la evaluación de la célula Mechanosensing y Durotaxis<em&gt; In Vitro</em

The composition and mechanical properties of the extracellular matrix are highly variable between tissue types. This connective tissue stroma diversity ...

El objetivo general de este procedimiento es proporcionar un sistema simplificado para el análisis de la durex celular, mediante el cual muchas células de mamífero migran preferentemente hacia un sustrato más rígido. Esto se logra primero preparando sustratos de polimetil siloxano o PDMS con rigidez definida. A continuación, el PDMS preparado se vierte en cada pocillo de una placa de seis pocillos y se eliminan las burbujas de aire.Las cámaras Durex se completan entonces colocando un cubreobjetos esterilizado encima del PDMS en cada pocillo para crear una superposición. El paso final consiste en sembrar células en las cámaras Duro taxes con una densidad que les brinde suficiente espacio para migrar sin interacciones significativas con otras células. En última instancia, se utiliza microscopía de células vivas para estudiar el axxis en células migratorias.La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como el poli acrilamida es que existe un único paso entre el PDMS blando y el vidrio rígido, a diferencia de las alternativas con geles en gradiente. Asimismo, el recubrimiento del PDMS con componentes de la matriz extracelular, como la fibronectina, no requiere entrecruzamiento químico, el cual sí es necesario en geles de poli acrilamida. Para preparar una placa de cultivo celular de seis pocillos, primero equilibre con un tubo cónico de 50 mililitros.Pese aproximadamente 10 gramos de la solución base de poli (dimetilsiloxano) o PDMS en un tubo de 50 mililitros. Para una proporción de 90 a 1 del sustrato, divida el peso medido de la solución base de PDMS por 90. Para determinar la cantidad correcta de solución de entrecruzador necesaria, agregue la cantidad calculada de solución de entrecruzador de PDMS al tubo y mezcle vigorosamente la mezcla de base de PDMS y entrecruzador durante cinco minutos a temperatura ambiente.En esta etapa, utilizando una espátula pequeña, la mezcla contendrá una pequeña cantidad de burbujas de aire. Centrifugue el sustrato de PDMS en una centrífuga de banco durante cinco minutos a 50 veces. Añada temperatura ambiente para eliminar las burbujas si aún quedan burbujas.Después de los cinco minutos, centrifugue nuevamente y pipete un mililitro del sustrato PDMS de 90 a 1 en cada pocillo de la placa de seis pocillos tratada para cultivo de tejidos. En esta etapa, se pueden eliminar las burbujas de aire restantes presentes en el PDMS pinchándolas con una aguja de calibre 21.Deje que el PDMS se extienda durante 30 minutos en el pocillo. Luego hierva cubreobjetos de vidrio de 12 milímetros número uno en agua destilada durante cinco minutos, un total de tres veces. Coloque un cubreobjeto seco en cada pocillo de la placa de cultivo celular tocando suavemente un lado del cubreobjeto.Coloque el portaobjetos en la solución de PDMS y luego deje caer el cubreobjetos sobre el PDMS. A medida que el cubreobjetos se asienta, el PDMS comenzará a extenderse por los bordes del cubreobjetos, pero no lo cubrirá completamente. Esto generará una interfase entre el PDMS y el vidrio tras la curación.Incube la placa a 70 grados Celsius en una estufa durante 16 horas para curar el PDMS. Finalmente, coloque la placa en una cabina de cultivo celular y esterilice con luz UV durante 10 minutos. Recubra cada cámara durox con un mililitro de fibronectina en solución salina tamponada con fosfato sin calcio ni magnesio durante una hora a 30 grados Celsius.Asegúrese de que toda la superficie esté sumergida en la solución de fibronectina en PBS. Prepare albúmina sérica bovina o BSA al 1% calentada, pesando 0,5 gramos de BSA y disolviéndola en 50 mililitros de PBS filtrado. Estérilice la solución mediante un filtro de 0,22 micrómetros antes de calentarla a 80 grados Celsius durante 12 minutos.A continuación, aspire la solución de fibronectina y lave las cámaras tres veces con PBS. Añada un mililitro de BSA desnaturalizada por calor en PBS a cada pocillo e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente, mientras trypsiniza las muestras y cuenta las células de interés mientras las cámaras se bloquean con el calor. Aspire la solución de BSA desnaturalizada de las cámaras inmediatamente antes de sembrar las células.Plaquee 10.000 células en un volumen de dos mililitros en cada pocillo de la cámara doax. Utilizando el medio requerido para el tipo celular específico elegido, permita que las células se adhieran y se extiendan sobre el sustrato durante cuatro horas en un incubador humedecido a 37 grados Celsius con 5%CO2. Realice imágenes de células vivas en un microscopio invertido utilizando contraste de fases con un objetivo de 10 x. El microscopio debe estar equipado con una cámara ambiental cerrada y humedecida, que permita el control de la temperatura a 37 grados Celsius y 5%CO2 durante la adquisición de imágenes a largo plazo.Tras aproximadamente 3,5 horas de esparcimiento celular, monte la placa en la cámara del microscopio. Permita que las muestras se equilibren en la cámara durante 30 minutos. Configure un sistema automatizado de visita multipunto en el microscopio si está disponible.Enfóquese en la interfaz entre el PDMS y la cubreobjetivo de vidrio y seleccione puntos para obtener imágenes alrededor de toda la interfaz. Con un promedio de 40 puntos por cámara de Durex, capture imágenes de las células cada 10 minutos durante hasta 16 horas; la región de interés aparecerá como dos líneas, donde la línea exterior corresponde al borde de la cubreobjetivo y la línea interior corresponde a la interfaz real entre el PDMS y la cubreobjetivo. Para analizar los datos, genere una hoja de cálculo como la que se muestra en el protocolo del texto.Cuente el número de eventos de travesía desde el PDMS hasta la superficie de vidrio y viceversa en cada película generada. Un evento de travesía se define como el paso del núcleo celular sobre el límite entre el PDMS y el vidrio en cualquier dirección. Registre el número de eventos de travesía en la columna correspondiente de la hoja de cálculo de Excel para cuantificar múltiples travesías.Contar el número de veces que la célula cruzó la interfaz. Ese número debe registrarse en la columna de Excel correspondiente al sustrato sobre el cual la célula se encontraba al final de la película. Repetir el análisis para cada célula que cruce la interfaz en la película.Excluya las células que migren fuera del campo de visión durante la adquisición de imágenes. Calcule el porcentaje de células que migraron desde el PDMS hasta la superficie de vidrio y, por lo tanto, experimentaron Duro Texas. Para ello.Sumar el número de eventos de cruce de blando a duro y los eventos múltiples de cruce que terminaron en duro, y dividir entre el número total de eventos de cruce. Calcular el porcentaje de cruces múltiples dividiendo el total de cruces múltiples entre el número total de cruces para comenzar a comprender el mecanismo molecular mediante el cual las células responden a las señales mecánicas en su entorno. Se pueden silenciar proteínas específicas utilizando ARNi como se muestra aquí.Aproximadamente el 70 % de las células control tratadas con ARNi exhibieron eje. En un marcado contraste, cuando se redujo la expresión de CD gap mediante ARNi, las células no mostraron preferencia alguna por migrar hacia el sustrato duro o blando. Además, las células con la expresión reducida de CD gap cruzaron el límite múltiples veces.Mientras que las células tratadas con irna de control generalmente cruzan el límite solo una vez, las pistas representativas de células con irna de control muestran que las células suelen migrar a través del límite una sola vez y permanecen preferentemente en la superficie más rígida en comparación con las células tratadas con irna frente a CD gap. Las células tratadas con irna que no demostraron preferencia por ninguna de las rigideces cruzaron el límite múltiples veces.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar los sustratos de PDMS, ensamblar las cámaras duris y cuantificar los impuestos DUR.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

El sistema de ECIS / taxis es un sistema automatizado en tiempo real, análisis que mide la quimiotaxis celular. En este ensayo, las células se mueven por debajo de una capa de agarosa para llegar a un electrodo de destino. Movimiento celular se mide por la aparición de resistencia a 0 corriente alterna.

La medición de la quimiotaxis celular con ECIS / taxis

Con el fin de identificar nuevas mutaciones que afectan a la mecanosensación, diseñamos un ensayo que mide la respuesta conductual a la estimulación táctil de las cerdas de mosca en clones mutantes generados por el método MARCM. La combinación de técnicas permite la identificación de mutaciones mecanosensibles que, de otro modo, serían letales.

Un ensayo de conducta para Mechanosensation de clones en MARCM-basa<em&gt; Drosophila melanogaster</em

adherencias de la superficie celular son fundamentales en mechanotransduction, ya que transmiten la tensión mecánica e inician las vías de señalización implicadas en la homeostasis del tejido y el desarrollo. A continuación, presentamos un protocolo para la disección de las vías bioquímicas que se activan en respuesta a la tensión, utilizando microperlas magnéticas recubiertas con ligando y aplicación de la fuerza a los receptores de adhesión.

El análisis de la superficie celular Adhesión Remodeling en respuesta a la tensión mecánica usando perlas magnéticas

Aquí describimos los métodos para evaluar la respuesta celular al estímulo mecánico agudo. En el análisis de microscopía, examinamos localización de biosensores marcada con fluorescencia Tras estimulación breve con esquileo del flujo. También probamos la activación de diversas proteínas de interés en respuesta a la estimulación mecánica aguda bioquímicamente.

Evaluación de Dictyostelium discoideum respuesta a estimulación mecánica aguda

Nuevas herramientas para la investigación de la mecanobiología se necesitan entender cómo mecánico estrés activa vías bioquímicas y produce respuestas biológicas. Aquí, nos muestra un nuevo método de estimulación mecánica selectiva de animales inmovilizados con una trampa de microfluidos que permite proyección de imagen de alta resolución de las respuestas celulares.

Usando un dispositivo de microfluidos para la estimulación mecánica y alta resolución de imagen de C. elegans

Presentamos una instalación de pinza óptica acoplada a un microscopio de la ficha técnica de iluminación y su aplicación a la punta de prueba mecánica de la célula sin cuentas en el embrión de Drosophila .

Sondeo de la célula mecánica con pinzas ópticas libres de grano en el embrión de Drosophila

Las fuerzas mecánicas son importantes para controlar la migración celular. Este protocolo demuestra el uso de hidrogeles elásticos que se pueden deformar utilizando una micropipeta de vidrio y un micromanipulador para estimular las células con un gradiente de rigidez local para provocar cambios en la estructura celular y la migración.

Ensayo Desafiador durotaxis de una sola célula para evaluar el control mecánico del movimiento celular y los eventos de señalización relacionados

La plataforma Integrative Toolkit to Analyze Cellular Signals (iTACS) automatiza el proceso de medición simultánea de una amplia variedad de señales químicas y mecánicas en células adherentes. iTACS está diseñado para facilitar el desarrollo impulsado por la comunidad y permitir a los investigadores utilizar todas las características de la plataforma, independientemente de su formación académica.

Kit de herramientas integradoras para analizar señales celulares: fuerzas, movimiento, morfología y fluorescencia

Este trabajo presenta un protocolo flexible para utilizar la tecnología de superficies contráctiles elastoméricas marcadas fluorescentemente (FLECS) en formato de micropozos para una cuantificación simplificada y sin intervención de las fuerzas contráctiles de una sola célula basada en desplazamientos visualizados de micropatrones de proteínas fluorescentes.

Análisis simplificado y de alto rendimiento de la contractilidad de una sola célula utilizando elastómeros con micropatrones

El presente protocolo describe el diseño, fabricación y caracterización de un sistema microfluídico capaz de alinear, inmovilizar y comprimir con precisión cientos de embriones de Drosophila melanogaster con una intervención mínima del usuario. Este sistema permite obtener imágenes de alta resolución y recuperar muestras para el análisis posterior a la estimulación y se puede escalar para adaptarse a otros sistemas biológicos multicelulares.

Mecanoestimulación de organismos multicelulares mediante un sistema de compresión microfluídica de alto rendimiento

Aquí se presenta un método para fenotipar mecánicamente células individuales utilizando una plataforma microfluídica basada en electrónica llamada detección mecano-nodo-poro (mecano-NPS). Esta plataforma mantiene un rendimiento moderado de 1-10 células/s mientras mide las propiedades biofísicas elásticas y viscosas de las células.

Detección de poro de nodo mecánico: una plataforma rápida y sin etiquetas para mediciones viscoelásticas unicelulares multiparamétricas

Aprende a evaluar la durotaxis celular in vitro utilizando sustratos de PDMS con rigidez definida. Este método simplificado permite estudiar la migración de células hacia superficies más rígidas mediante microscopía de células vivas.

Un sistema simplificado para la evaluación de la célula Mechanosensing y Durotaxis

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