Un sistema simplificado para la evaluación de la célula Mechanosensing y Durotaxis

El objetivo general de este procedimiento es proporcionar un sistema simplificado para el análisis de la durex celular, mediante el cual muchas células de mamífero migran preferentemente hacia un sustrato más rígido. Esto se logra primero preparando sustratos de polimetil siloxano o PDMS con rigidez definida. A continuación, el PDMS preparado se vierte en cada pocillo de una placa de seis pocillos y se eliminan las burbujas de aire.

Las cámaras Durex se completan entonces colocando un cubreobjetos esterilizado encima del PDMS en cada pocillo para crear una superposición. El paso final consiste en sembrar células en las cámaras Duro taxes con una densidad que les brinde suficiente espacio para migrar sin interacciones significativas con otras células. En última instancia, se utiliza microscopía de células vivas para estudiar el axxis en células migratorias.

La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como el poli acrilamida es que existe un único paso entre el PDMS blando y el vidrio rígido, a diferencia de las alternativas con geles en gradiente. Asimismo, el recubrimiento del PDMS con componentes de la matriz extracelular, como la fibronectina, no requiere entrecruzamiento químico, el cual sí es necesario en geles de poli acrilamida. Para preparar una placa de cultivo celular de seis pocillos, primero equilibre con un tubo cónico de 50 mililitros.

Pese aproximadamente 10 gramos de la solución base de poli (dimetilsiloxano) o PDMS en un tubo de 50 mililitros. Para una proporción de 90 a 1 del sustrato, divida el peso medido de la solución base de PDMS por 90. Para determinar la cantidad correcta de solución de entrecruzador necesaria, agregue la cantidad calculada de solución de entrecruzador de PDMS al tubo y mezcle vigorosamente la mezcla de base de PDMS y entrecruzador durante cinco minutos a temperatura ambiente.

En esta etapa, utilizando una espátula pequeña, la mezcla contendrá una pequeña cantidad de burbujas de aire. Centrifugue el sustrato de PDMS en una centrífuga de banco durante cinco minutos a 50 veces. Añada temperatura ambiente para eliminar las burbujas si aún quedan burbujas.

Después de los cinco minutos, centrifugue nuevamente y pipete un mililitro del sustrato PDMS de 90 a 1 en cada pocillo de la placa de seis pocillos tratada para cultivo de tejidos. En esta etapa, se pueden eliminar las burbujas de aire restantes presentes en el PDMS pinchándolas con una aguja de calibre 21.

Deje que el PDMS se extienda durante 30 minutos en el pocillo. Luego hierva cubreobjetos de vidrio de 12 milímetros número uno en agua destilada durante cinco minutos, un total de tres veces. Coloque un cubreobjeto seco en cada pocillo de la placa de cultivo celular tocando suavemente un lado del cubreobjeto.

Coloque el portaobjetos en la solución de PDMS y luego deje caer el cubreobjetos sobre el PDMS. A medida que el cubreobjetos se asienta, el PDMS comenzará a extenderse por los bordes del cubreobjetos, pero no lo cubrirá completamente. Esto generará una interfase entre el PDMS y el vidrio tras la curación.

Incube la placa a 70 grados Celsius en una estufa durante 16 horas para curar el PDMS. Finalmente, coloque la placa en una cabina de cultivo celular y esterilice con luz UV durante 10 minutos. Recubra cada cámara durox con un mililitro de fibronectina en solución salina tamponada con fosfato sin calcio ni magnesio durante una hora a 30 grados Celsius.

Asegúrese de que toda la superficie esté sumergida en la solución de fibronectina en PBS. Prepare albúmina sérica bovina o BSA al 1% calentada, pesando 0,5 gramos de BSA y disolviéndola en 50 mililitros de PBS filtrado. Estérilice la solución mediante un filtro de 0,22 micrómetros antes de calentarla a 80 grados Celsius durante 12 minutos.

A continuación, aspire la solución de fibronectina y lave las cámaras tres veces con PBS. Añada un mililitro de BSA desnaturalizada por calor en PBS a cada pocillo e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente, mientras trypsiniza las muestras y cuenta las células de interés mientras las cámaras se bloquean con el calor. Aspire la solución de BSA desnaturalizada de las cámaras inmediatamente antes de sembrar las células.

Plaquee 10.000 células en un volumen de dos mililitros en cada pocillo de la cámara doax. Utilizando el medio requerido para el tipo celular específico elegido, permita que las células se adhieran y se extiendan sobre el sustrato durante cuatro horas en un incubador humedecido a 37 grados Celsius con 5%CO2. Realice imágenes de células vivas en un microscopio invertido utilizando contraste de fases con un objetivo de 10 x. El microscopio debe estar equipado con una cámara ambiental cerrada y humedecida, que permita el control de la temperatura a 37 grados Celsius y 5%CO2 durante la adquisición de imágenes a largo plazo.

Tras aproximadamente 3,5 horas de esparcimiento celular, monte la placa en la cámara del microscopio. Permita que las muestras se equilibren en la cámara durante 30 minutos. Configure un sistema automatizado de visita multipunto en el microscopio si está disponible.

Enfóquese en la interfaz entre el PDMS y la cubreobjetivo de vidrio y seleccione puntos para obtener imágenes alrededor de toda la interfaz. Con un promedio de 40 puntos por cámara de Durex, capture imágenes de las células cada 10 minutos durante hasta 16 horas; la región de interés aparecerá como dos líneas, donde la línea exterior corresponde al borde de la cubreobjetivo y la línea interior corresponde a la interfaz real entre el PDMS y la cubreobjetivo. Para analizar los datos, genere una hoja de cálculo como la que se muestra en el protocolo del texto.

Cuente el número de eventos de travesía desde el PDMS hasta la superficie de vidrio y viceversa en cada película generada. Un evento de travesía se define como el paso del núcleo celular sobre el límite entre el PDMS y el vidrio en cualquier dirección. Registre el número de eventos de travesía en la columna correspondiente de la hoja de cálculo de Excel para cuantificar múltiples travesías.

Contar el número de veces que la célula cruzó la interfaz. Ese número debe registrarse en la columna de Excel correspondiente al sustrato sobre el cual la célula se encontraba al final de la película. Repetir el análisis para cada célula que cruce la interfaz en la película.

Excluya las células que migren fuera del campo de visión durante la adquisición de imágenes. Calcule el porcentaje de células que migraron desde el PDMS hasta la superficie de vidrio y, por lo tanto, experimentaron Duro Texas. Para ello.

Sumar el número de eventos de cruce de blando a duro y los eventos múltiples de cruce que terminaron en duro, y dividir entre el número total de eventos de cruce. Calcular el porcentaje de cruces múltiples dividiendo el total de cruces múltiples entre el número total de cruces para comenzar a comprender el mecanismo molecular mediante el cual las células responden a las señales mecánicas en su entorno. Se pueden silenciar proteínas específicas utilizando ARNi como se muestra aquí.

Aproximadamente el 70 % de las células control tratadas con ARNi exhibieron eje. En un marcado contraste, cuando se redujo la expresión de CD gap mediante ARNi, las células no mostraron preferencia alguna por migrar hacia el sustrato duro o blando. Además, las células con la expresión reducida de CD gap cruzaron el límite múltiples veces.

Mientras que las células tratadas con irna de control generalmente cruzan el límite solo una vez, las pistas representativas de células con irna de control muestran que las células suelen migrar a través del límite una sola vez y permanecen preferentemente en la superficie más rígida en comparación con las células tratadas con irna frente a CD gap. Las células tratadas con irna que no demostraron preferencia por ninguna de las rigideces cruzaron el límite múltiples veces.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar los sustratos de PDMS, ensamblar las cámaras duris y cuantificar los impuestos DUR.