Name: 평가 셀 Mechanosensing 및 Durotaxis에 대한 단순화 된 시스템 체외 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: 배우세요 세포 듀로택시스를 연구하는 간소화된 PDMS 기반 시스템을 사용하여 포유류 세포가 경직된 기질로 이동하는 메커니즘을 실시간 현미경으로 관찰하는 방법을 익히세요.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작품은 NIH R01 GM47607, CA163296 및 CET에 NSF 1,334,493에 의해 지원됩니다. 우리는 원고의 중요한 읽기 터너 실험실의 구성원을 감사드립니다. 이 보고서에 표시된 모든 데이터는 Wormer 등. 2014 (11)의 허가에 의해 재현되었다.

Durotaxis 챔버 1. 준비 <ol><li> 하나의 6- 웰 조직 배양 플레이트를 준비하기 위해, 50ml의 원뿔형 튜브 용기를 설정. 50ml의 튜브에서 PDMS 염기 용액의 약 10g을 칭량 (솔루션은 매우 점성). </li><li> 90 : 1 기판 (1 ~ kPa로의 적합성), 필요에 가교 결합제 용액의 정확한 양을 결정 (90)에 의해 튜브에 PDMS 염기 용액의 중량을 측정 나눈다. 같은 튜브에 PDMS의 가교제 용액의 계산 된 금액을 추가합니다. 예 : 10g / 90 = 0.11 G. PDMS 염기 용액에 PDMS 가교제 용액 0.11 g을 추가한다. 참고 : 기본 및 가교제 솔루션은 모두 PDMS 키트에 제공됩니다. </li><li> 격렬 작은 주걱을 사용하여 실온에서 5 분 동안 PDMS 기재 / 가교 결합제의 혼합물을 혼합한다. 이 단계에서 혼합물을 공기 방울 다수를 포함 할 것이다. </li><li> BUB을 제거하기 위해 실온에서 50 XG에 5 분 동안 벤치 탑 원심 분리기에서 PDMS 기판을 원심 분리기bles. 이 경우 여전히 다시 5 분, 원심 분리 후 거품. </li><li> 90 피펫 1ml의 : 조직 배양의 각 웰에 1 PDMS 기판은 6 웰 플레이트를 처리 하였다. PDMS에 존재하는 임의의 잔류 기포는 21 G 바늘을 사용하여 팝핑함으로써,이 단계에서 제거 될 수있다. PDMS가 아니라 30 분 동안 전파하도록 허용합니다. </li><li> 종기 12mm 유리 # 5 분간 증류수 1 커버 슬립. 두 번 반복하고 증류수 된 커버를 저장합니다. </li><li> 부드럽게 한 후 PDMS에 커버 슬립을 드롭 PDMS 솔루션에 coverslip에의 한 쪽을 터치하여 조직 배양 플레이트의 각 웰에 하나, 건조 coverslip에 배치합니다. 커버 슬립이 침전으로, PDMS는 커버 슬립의 가장자리를 통해 잠식하기 시작하지만, 완전히 포함되지 않습니다. 이것은 (, B를 그림 1A 참조) 경화 후 PDMS와 유리 사이의 인터페이스를 생성합니다. </li><li> PDMS를 치료 (경화) 16 시간 동안 오븐에서 70 ° C에서 접시를 품어. 작은지면 배치세포 배양 후드에서 UV 및 E를 10 분 동안 살균. 참고 : 사용의 몇 일 이내에 판을 만드는 것이 가장 좋습니다. 그러나 판은 버퍼없이 파라 필름에 싸여과 품질에 띄는 감소없이 최대 2 주 동안 4 ℃에서 저장 될 수있다. </li></ol> 2. 셀 도금 주 : siRNA를 매개 녹다운의 효과를 연구하는 경우, 제조자의 지시 나 선택의 세포 유형에 대한 최적의 프로토콜을 이용하여 최저을 수행한다. <ol><li> 각 코트는 37 ℃에서 1 시간 동안 칼슘 및 마그네슘이없는 / ml의 PBS에 피브로넥틴을 10 μg의 1 ml의 챔버 durotaxis. 대안 적으로, 피브로넥틴은 4 ℃에서 16 시간 동안 / ml의 PBS에 피브로넥틴을 10 μg의 PDMS와 인큐베이션하여 분석 전에 일을 적용 할 수있다. 전체 표면을 PBS 용액에 피브로넥틴에 빠져들되어 있는지 확인합니다. </li><li> 열 변성 1 % BSA를 준비합니다. 0.5 g의 무게 BSA 및 PBS 50 ㎖에 용해.필터는 12 분 동안 80 ℃에서 0.22 ㎛의 필터와 열교환을 통해 살균 용액. 참고 :이 솔루션 4 ℃에서 도금 및 저장 셀하기 전에 하루를 준비합니다. </li><li> 피브로넥틴 솔루션을 기음과 PBS로 3 회 반복한다. 각 웰에 PBS에 열 변성 BSA 1 ㎖를 추가하고 실온에서 30 분 동안 품어. </li><li> durotaxis 챔버가 열 변성 BSA로 차단하는 동안를 Trypsinize 및 선택의 세포를 계산합니다. </li><li> 플레이트 원하는 특정 세포 유형에 필요한 매체를 사용 durotaxis 챔버의 각 웰에 2 ㎖를 1 × 105 세포. 세포 부착 및 5 % CO 2, 37 ℃에서 가습 된 배양기에서 4 시간 동안 기판에 도포 할 수있다. 주 : U2OS 세포는 일상적 2 mM L- 글루타민, 1 mM 피루브산 나트륨, 10 IU / ml의 페니실린, 10 μg의 / ml의 스트렙토 마이신이 보충 된 10 % FBS DMEM으로 유지된다. 주 :이 예에서 사용되는 세포 수에 최적화U2OS 세포. 다른 유형의 세포에 대한 최적화가 요구 될 수있다. 이 밀도는 세포를 다른 세포와 중요한 상호 작용없이 마이그레이션 할 수있는 충분한 공간을 제공합니다. </li></ol> 3. 라이브 셀 이미징 <ol><li> 10X 목표와 위상 콘트라스트를 사용하여, 거꾸로 현미경에 라이브 세포 이미징을 수행합니다. 현미경은 장기 촬상 동안 37 ℃ 온도의 제어 및 5 % CO 2 있도록 밀폐 환경, 습한 챔버가 장착되어야한다. </li><li> 세포를 약 3.5 시간 동안 분산 한 후, 현미경 실 플레이트를 조립한다. 샘플 (S)이 30 분 동안 챔버에서 평형화 허용한다. </li><li> 가능한 경우 현미경에 방문 자동화, 멀티 포인트를 설정합니다. (90) 사이의 인터페이스에 초점 : 1 PDMS와 유리 coverslip에 모든 durotaxis 챔버 당 40 점의 평균과의 인터페이스 주위에 이미지에 포인트를 선택합니다. 이미지 셀 최대 16 시간 동안 매 10 분. 참고 : 재관심의 기온은 커버 슬립의 가장자리와 PDMS와 커버 슬립 사이의 실제 인터페이스에 대응하는 내부 라인에 해당하는 외부 줄, 두 줄로 표시됩니다. 그림 1B를 참조하십시오. </li></ol> 4. 데이터 분석 <ol><li> 표 1과 같은 스프레드 시트를 생성한다. </li><li> 생성 된 각각의 동영상에서 유리 표면과 그 반대로 PDMS에서 교차 이벤트의 수를 카운트. 엑셀 스프레드 시트의 해당 열에 교차 이벤트의 수를 기록한다. 주 : 교차 이벤트가 어느 한 방향으로 PDMS와 유리 사이의 경계 위에 전달 세포핵으로 정의된다. </li><li> 다중 교차를 정량화하기 위해, 셀은 인터페이스 교차 회수를 카운트. 그 숫자는 셀이 영화의 단부에 위치 된 기판 상에 대응하는 엑셀 열에 기록되어야한다. t의 인터페이스를 가로 지르는 모든 셀에 대한 분석을 반복그는 영화. 촬영하는 동안 시야에서 마이그레이션 세포를 제외합니다. 주 : 세포가 피브로넥틴 - 코팅 된 PDMS와 유리 커버 슬립의 표면에 균일하게 부착 할 수있는 것을, 실험의 초기에 셀 카운팅함으로써 확인하는 것이 중요하다. </li><li> 유리 표면 (즉, durotaxis을 시행)에 PDMS에서 마이그레이션 세포의 비율을 계산합니다. 소프트에서 하드 및 교차 이벤트의 총 수에 의해 하드 및 분할에 끝났 여러 교차 이벤트에 이벤트를 건너의 수를 추가합니다. </li><li> 교차점의 총 수에 의해 다중 교차의 수를 분할하여 복수의 횡단의 비율을 계산한다. </li></ol>

<ol><li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126 (4), 677-689 (2006).</li>
<li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).</li>
<li>Levental, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+crosslinking+forces+tumor+progression+by+enhancing+integrin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling.</a> Cell. 139 (5), 891-906 (2009).</li>
<li>Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+movement+is+guided+by+the+rigidity+of+the+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Cell movement is guided by the rigidity of the substrate.</a> Biophysical Journal. 79 (1), 144-152 (2000).</li>
<li>Plotnikov, S. V., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guiding+cell+migration+by+tugging%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Guiding cell migration by tugging.</a> Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 619-626 (2013).</li>
<li>Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+rigidity+causes+strengthening+of+integrin-cytoskeleton+linkages%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin-cytoskeleton linkages.</a> Cell. 88 (1), 39-48 (1997).</li>
<li>Balaban, N. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+and+focal+adhesion+assembly%3A+a+close+relationship+studied+using+elastic+micropatterned+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Force and focal adhesion assembly: a close relationship studied using elastic micropatterned substrates.</a> Nature Cell Biology. 3 (5), 466-472 (2001).</li>
<li>Provenzano, P. P., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+signaling+through+the+cytoskeleton+regulates+cell+proliferation+by+coordinated+focal+adhesion+and+Rho+GTPase+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanical signaling through the cytoskeleton regulates cell proliferation by coordinated focal adhesion and Rho GTPase signaling.</a> Journal of Cell Science. 124 (8), 1195-1205 (2011).</li>
<li>Wang, Y. L., Pelham, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+a+flexible%2C+porous+polyacrylamide+substrate+for+mechanical+studies+of+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells.</a> Methods in Enzymology. 298, 489-496 (1998).</li>
<li>Prager-Khoutorsky, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+polarization+is+a+matrix-rigidity-dependent+process+controlled+by+focal+adhesion+mechanosensing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fibroblast polarization is a matrix-rigidity-dependent process controlled by focal adhesion mechanosensing.</a> Nature Cell Biology. 13 (12), 1457-1465 (2011).</li>
<li>Wormer, D. B., Davis, K. A., Henderson, J. H., Turner, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+focal+adhesion-localized+CdGAP+regulates+matrix+rigidity+sensing+and+durotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">The focal adhesion-localized CdGAP regulates matrix rigidity sensing and durotaxis.</a> PloS ONE. 9 (3), e91815(2014).</li>
<li>Trichet, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+a+large-scale+mechanosensing+mechanism+for+cellular+adaptation+to+substrate+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Evidence of a large-scale mechanosensing mechanism for cellular adaptation to substrate stiffness.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (18), 6933-6938 (2012).</li>
<li>Eyckmans, J., Boudou, T., Yu, X., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hitchhiker%E2%80%99s+guide+to+mechanobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">A hitchhiker’s guide to mechanobiology.</a> Developmental Cell. 21 (1), 35-47 (2011).</li>
<li>Martinac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensitive+ion+channels%3A+molecules+of+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanosensitive ion channels: molecules of mechanotransduction.</a> Journal of Cell Science. 117 (12), 2449-2460 (2004).</li>
<li>Jafar-Nejad, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sec15%2C+a+component+of+the+exocyst%2C+promotes+notch+signaling+during+the+asymmetric+division+of+Drosophila+sensory+organ+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Sec15, a component of the exocyst, promotes notch signaling during the asymmetric division of Drosophila sensory organ precursors.</a> Developmental Cell. 9 (3), 351-363 (2005).</li>
</ol>

저자는 공개할 갈등이 없습니다.

여기에서 우리는 세포를 마이그레이션하는 durotaxis을 연구하는 간단한 분석을 설명합니다. 이 분석의 주요 장점은 PDMS를 사용 durotaxis 챔버 제조의 용이성이다. 기판의 강성을 용이하게 분석에서 다양한 강성의 연구를 허용하도록하기 위해 가교제 PDMS 염기 용액의 비율을 변경함으로써 조작 될 수있다. 그러나, 시스템의 하나의 잠재적 인 한계는 더 정교한 시스템 (4)에 의해 제공되는 강도 구배를 발생 반대로 세포 만 기판에 단일 강성 변화에 노출된다는 것이다. 중요하게는, 폴리 아크릴 아미드의 기판과는 달리, ECM 성분은 화학적으로 가교 결합 된 PDMS에있을 필요가 없다. 피브로넥틴 (11)에 특이적인 항체로 염색에 의해 결정되는 바와 같이 실제로, 피브로넥틴 코팅은 PDMS와 유리의 양면에 거의 동등하다. 이전의 연구는 세포가 어느 PDMS 기판이나 폴리 아크릴 아미드, 사용 O에 동일하게 동작하는 것이 도시 했으므로기판 (F) PDMS 세포 (10, 12)에...

세포 외 기질 (ECM)의 콜라겐, 피브로넥틴 및 라미닌을 포함하고, 가교 구조 단백질의 복잡한 배열로 구성된다. 이 아니라 ECM 셀룰러 조직 중요한 구조적지지를 제공한다는 확립되어 있지만, 세포가 활발히 세포 생존, 분화 및 세포 이동을 포함한 다양한 세포 과정을 조절하는 그들의 ECM 환경에서 물리적 인 변화에 대응 것을 나타내는 증거가 증가하고있다. 딱딱한 (~ 25 kPa로) 기판 조골 세포 분화를 촉진 한 예를 들어, ECM의 강성 차이는 연질 기판 (~ 1 kPa의) 신경성 계통 촉진과 함께, 서로 다른 계통으로 중간 엽 줄기 세포를 구동 할 수있다. 마찬가지로 기질 매트릭스 강성 증가는 주변 조직에 2,3- 유방 상피 세포 및 종양 침윤을 촉진하는 것으로 나타났다. 이 mechanosign의 특히 흥미로운 양태세포가 더 견고한 기판 4,5- 향해 우선적으로 마이그레이션하는 durotaxis로 알려진 프로세스에서 aling 활동 결과. 세포는 지속적 ECM 결합 인테그린 수용체를 통해 세포 외 환경의 물리적 특성을 감지. 이것은, 차례로, 국소 유착 또는 초점 콘택트 -6,7-라고도 접착제 구조의 형성을 구동 할 그들의 세포질 도메인 수많은 구조 및 시그널링 단백질의 축적을 촉진한다. 인테그린이 더 고유의 효소 활성이 없기 때문에, 신호는 변화하는 환경에 8 셀의 응답을 조정하기 위해 이러한 액세서리 단백질을 통해 ECM에서 릴레이됩니다. 따라서, mechanosignaling durotaxis 및 조절에 관여하는 주요 단백질의 동정 및 특성 규명은 수사의 중요한 영역이다. 다양한 모델 시스템 durotaxis 관내 연구 개발되어 왔지만, 대부분은 할이용 콜라겐 코팅 된 폴리 아크릴 아미드 기판 (4). 그러나, 폴리 아크릴 아미드의 기판의 제조는 기술적으로 어려울 수 있으며, 상기 분석 방법에 사용되는 콜라겐은 기판 (9)와 화학적으로 가교되어야한다. 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 기판은 폴리 아크릴 기판 (10)에 필적하는 기계적 성질을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 그러나, PDMS 기판을 간단히 가교제 염기의 혼합 비율에 의해 제조되며, 이러한 기판은 이에 PDMS 세포 행동에 강성의 영향을 연구하기 쉬운 도구를 만드는 화학적 가교의 필요성없이 ECM 단백질로 코팅 될 수있다. 여기서, 우리는 부드러운 PDMS 기판이 경질 유리 커버 슬립과 통합되는 간단한 durotaxis 실을 준비하는 방법에 대해 설명합니다. 분석은, 아래에 설명 된대로, durotaxis을 연구하는 빠르고 간단한 방법을 제공합니다. 이 연구를 위해 우리는 siRNA를 매개로 결합 된 인간의 U2OS의 골육종 세포를 사용cdGAP의 최저은 durotaxis (11)이 초점 접착 단백질의 역할을 연구합니다. 중요한 것은,이 프로토콜은 개별적인 요구에 쉽게 적응 될 수있다. 다른 유형의 세포는 U2OS 세포를 대체 할 수 있고, 어떤 단백질은 뜨거나 durotaxis 동안 셀의 동작에 미치는 영향을 결정하기 과발현 될 수있다. 더욱이,이 프로토콜은 역학 거동 사용 FRAP 또는 접근법 FRET을 분석 형광 태그로 단백질을 포함하도록 구성 될 수있다.

<table><tbody><tr><td>폴리디메틸실록산(PDMS)</td><td>다우코닝</td><td>3097358-1004</td><td>실가드 184 실리콘 엘라스토머 키트</td></tr><tr><td>#1 커버 유리 12mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-82</td><td></td></tr><tr><td>6웰 플레이트</td><td>Celltreat</td><td>229106</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td>15-017-CM</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>Cellgro</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 Pyruvate</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP356-100</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>피브로넥틴</td><td>BD Biosciences</td><td>610077</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>21600-044</td><td></td></tr><tr><td>팔콘 튜브</td><td>Celltreat</td><td>229456</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>둔감한 혈청 알부민</td><td>시그마</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>U2OS 세포</td><td>ATCC</td><td>HTB-96</td><td></td></tr></tbody></table>

평가 셀 mechanosensing 및 durotaxis에 대한 단순화 된 시스템<em&gt; 체외</em

A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro

세포 외 매트릭스의 조성과 기계적 성질이 조직 유형 사이에서 매우 가변적이다. 이 크게 결합 조직 기질 다이버 영향 셀 동작은 세포 증식, 분화, 접착 시그널링 및 이동 방향을 포함하여 정상 및 병리학 적 과정을 조절한다. 이와 관련하여, 특정 세포 유형의 타고난 능력 durotaxis라고도 단단, 이하 호환 매트릭스 기판을 향해 이동한다. 이 현상은 배아 발생, 상처 복구 및 암세포 침윤 동안 중요한 역할을한다. 여기, 우리는 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 기판을 사용하여 시험 관내에서, durotaxis을 연구하는 간단한 분석을 설명합니다. 챔버 durotaxis 설명의 준비는 상대적으로 부드러운 PDMS 젤 단단한 유리 커버 슬립 사이에 강성 인터페이스를 만듭니다. 제공된 예에서, 우리는 cdc42의 역할을 입증하는 이들 durotaxis 챔버를 사용하고 / RAC1는 GTPase 활성 보호 자전거cdGAP에서, mechanosensing 인간 U2OS의 골육종 세포에서 durotaxis 규제. 이 분석은 mechanosignaling과 durotaxis에서 각각의 역할을 탐구하는 다른 세포 유형 및 / 또는 관심의 다른 단백질의 최저에 쉽게 적응할 수있다.

durotaxis 챔버의 개략도는도 1a에 도시되어있다. 소프트 PDMS 기판 (90 : 솔루션 가교제 PDMS 기재 1 혼합물)을 6 웰 접시에서 확산되고 유리 커버 슬립시켜 인터페이스를 생성하고 부분적으로 커버 슬립의 상부 표면을 덮는 PDMS, 위에 배치되는 다른 준수의 두 기판 사이. 소프트 PDMS 기판의 강성은 유리의 강도가 약 1 GPa의 1-2 반면, 뇌 조직의 일반적인 적합성에 필적 ~ 1 kPa로한다. PDMS와 유리 사이의 계면의 위상차 이미지는도 1b에 흰색 화살표 머리로 나타낸다. 별표는 열심히 기판으로 마이그레이션하는 두 개의 제어 RNAi의 세포를 나타낸다. 알 수있는 비정형 가장자리 (검은 화살표)은 커버 슬립의 에지에 대응한다. 데이터를 정량화하기 위해, 마이크로 소프트 엑셀 스프레드 시트를 표 1과 같이 생성한다 &lt;...

많은 포유류 세포는 듀로타시스를 통해 더 단단한 기질 또는 기질로 우선적으로 이동합니다. 이 프로토콜의 목표는 유리 커버슬립과 인터페이스하여 정의된 강성의 폴리디메틸실록산(PDMS) 기질을 통합하여 세포 듀로타시스 거동을 연구하고 조작하는 데 사용할 수 있는 간단한 체외 시스템을 제공하는 것입니다.

평가 셀 Mechanosensing 및 Durotaxis에 대한 단순화 된 시스템<em&gt; 체외</em

The composition and mechanical properties of the extracellular matrix are highly variable between tissue types. This connective tissue stroma diversity ...

이 절차의 전반적인 목표는 많은 포유류 세포가 더 단단한 기질 쪽으로 우선적으로 이동하는 세포 강성(cell durotaxis) 분석을 위한 간소화된 시스템을 제공하는 것입니다. 이는 먼저 정의된 강성을 가진 폴리메틸실록산(Polymethylsiloxane) 또는 PDMS 기질을 준비함으로써 수행됩니다. 다음으로, 준비된 PDMS를 6-웰 플레이트의 각 웰에 붓고 기포를 제거합니다.그런 다음 각 웰의 PDMS 위에 멸균된 커버슬립을 배치하여 오버레이를 생성함으로써 Durotax 챔버를 완성합니다. 마지막 단계는 다른 세포와의 상당한 상호작용 없이 세포가 이동할 수 있는 충분한 공간을 제공하는 밀도로 Durotax 챔버에 세포를 파종하는 것입니다. 최종적으로, 이동하는 세포의 축을 연구하기 위해 생세포 현미경 관찰이 사용됩니다.폴리아크릴아마이드와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 구배 겔(gradient gel) 대안 대신 부드러운 PDMS와 단단한 유리 사이에 단일 단계만 존재한다는 점입니다. 또한, 피브로넥틴과 같은 세포외 기질 성분으로 PDMS를 코팅할 때 폴리아크릴아마이드 겔에서 필요한 화학적 가교 결합이 필요하지 않습니다. 6-웰 조직 배양 플레이트 하나를 준비하려면, 먼저 50 mL 원심 분리관을 사용하여 용액의 균형을 맞추십시오.50 milliliter 튜브에 poly dimethyl suboxane 또는 PDMS 베이스 용액을 약 10 grams 계량합니다. 90:1 기판 비율의 경우, 계량한 PDMS 베이스 용액의 무게를 90으로 나눕니다. 필요한 가교제 용액의 정확한 양을 결정한 후, 계산된 양의 PDMS 가교제 용액을 튜브에 추가하고 실온에서 5분 동안 PDMS 베이스 가교제 혼합물을 격렬하게 섞어줍니다.이 단계에서 작은 스패튤라를 사용하면 혼합물에 소량의 기포가 포함될 수 있습니다. PDMS 기판을 벤치탑 원심분리기에 넣고 50 ×g에서 5분 동안 원심분리하십시오. 기포가 여전히 남아 있다면 실온에 두어 기포를 제거하십시오.5분 후 다시 원심분리하고, 90:1 PDMS 기질 1 mL를 조직 배양 처리된 6-웰 플레이트의 각 웰에 피펫으로 분주합니다. PDMS 내에 남아 있는 기포는 이 단계에서 21게이지 바늘로 터뜨려 제거할 수 있습니다.PDMS가 웰 내에서 30분 동안 퍼지도록 둡니다. 다음으로 12mm 유리 Number one 커버슬립을 증류수에 5분 동안 끓이며, 이를 총 3회 반복합니다. 커버의 한쪽 면을 살짝 터치하여 조직 배양 플레이트의 각 웰에 건조된 커버슬립을 하나씩 넣습니다.커버슬립을 PDMS 용액에 담근 후, 다시 PDMS 위로 떨어뜨립니다. 커버슬립이 안착됨에 따라 PDMS가 커버슬립의 가장자리를 따라 침범하기 시작하지만, 완전히 덮지는 않습니다. 이렇게 하면 경화 후 PDMS와 유리 사이에 계면이 생성됩니다.PDMS를 경화시키기 위해 플레이트를 오븐에서 70 °C로 16시간 동안 배양합니다. 마지막으로, 플레이트를 세포 배양 후드에 넣고 10분 동안 UV 멸균합니다. 각 durox 챔버를 칼슘과 마그네슘이 없는 인산염 완충 식염수에 희석한 1 mL의 fibronectin으로 30 °C에서 1시간 동안 코팅합니다.표면 전체가 PBS 내의 피브로넥틴 용액에 잠겼는지 확인하십시오. 0.5 g의 BSA를 정량하여 50 mL의 여과된 PBS에 녹여 1% 소태아혈청 알부민(bovine serum albumin) 또는 BSA 열처리 용액을 준비합니다. 용액을 0.22 µm 필터로 여과하여 멸균한 후, 80 °C에서 12분 동안 가열하십시오.다음으로, 피브로넥틴(fibronectin) 용액을 흡입하여 제거하고 챔버를 PBS로 3회 세척합니다. 각 웰에 PBS에 녹인 열 변성 BSA 1 mL를 첨가하고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 듀렉스(durex) 챔버가 열 변성 BSA로 블로킹되는 동안, 트립신 처리 후 원하는 세포의 수를 측정합니다. 세포를 플레이팅하기 직전에 챔버에서 BSA 용액을 흡입하여 제거합니다.doax 챔버의 각 웰에 10,000개의 세포를 2 mL 부피로 분주합니다. 선택한 특정 세포 유형에 필요한 배지를 사용하여, 37°C, 5% CO₂ 조건의 가습 배양기에서 4시간 동안 세포가 기질에 부착되고 퍼지도록 합니다. 위상차 10배율 대물렌즈가 장착된 도립 현미경을 사용하여 살아있는 세포 이미징을 수행합니다. 현미경에는 밀폐된 환경 가습 챔버가 장착되어 있어야 하며, 이를 통해 장기 이미징 동안 37°C의 온도와 5% CO₂ 농도를 제어할 수 있어야 합니다.세포가 약 3.5시간 동안 퍼진 후, 플레이트를 현미경 챔버에 장착하여 이미징을 진행합니다. 샘플이 챔버 내에서 30분 동안 평형 상태에 도달하도록 둡니다. 가능하다면 현미경의 자동 다점 방문(automated multi-point visiting) 기능을 설정하십시오.PDMS와 유리 커버슬립 사이의 계면에 집중하여 계면 주변의 모든 지점을 이미지화할 지점을 선택합니다. Durex 챔버 이미지당 평균 40개 지점에 대해 최대 16시간 동안 10분마다 세포를 촬영하면, 관심 영역(ROI)이 두 개의 선으로 나타나며, 외측 선은 커버슬립의 가장자리에 해당하고 내측 선은 PDMS와 커버슬립 사이의 실제 계면에 해당합니다. 데이터를 분석하려면 텍스트 프로토콜에 표시된 것과 같은 스프레드시트를 생성하십시오.생성된 각 동영상에서 PDMS에서 유리 표면으로, 그리고 그 반대로 이동하는 교차 이벤트 횟수를 측정하십시오. 교차 이벤트는 세포 핵이 PDMS와 유리의 경계를 어느 방향으로든 통과하는 것으로 정의합니다. 여러 번의 교차를 정량화하기 위해 엑셀 스프레드시트의 해당 열에 교차 이벤트 횟수를 기록하십시오.세포가 인터페이스를 가로지른 횟수를 측정하십시오. 해당 횟수를 영상 종료 시점에 세포가 위치했던 기판에 해당하는 Excel 열에 기록하십시오. 영상에서 인터페이스를 가로지르는 모든 세포에 대해 이 분석을 반복하십시오.이미징 중에 시야 밖으로 이동한 세포는 제외하십시오. PDMS에서 유리 표면으로 이동하여 Durotaxis를 겪은 세포의 백분율을 계산하십시오. 방법은 다음과 같습니다.soft에서 hard로의 교차 이벤트 수와 hard에서 끝난 다중 교차 이벤트 수를 더한 후, 이를 전체 교차 이벤트 수로 나눕니다. 다중 교차의 총합을 전체 교차 수로 나누어 다중 교차의 백분율을 계산함으로써, 세포가 주변 환경의 기계적 신호에 대응하는 분자적 메커니즘을 이해하기 시작합니다. 특정 단백질은 여기에서 보여주는 것과 같이 siRNA를 사용하여 넉다운할 수 있습니다.대조군 irna 처리 세포의 약 70%가 axxis를 보였습니다. 이와 극명하게 대조적으로, RNAi를 사용하여 CD gap을 넉다운시켰을 때, 세포들은 단단한 기질 또는 부드러운 기질 중 어디로 이동할지에 대해 선호도를 보이지 않았습니다. 또한, CD gap 넉다운 세포들은 경계를 여러 번 가로질렀습니다.대조군 irna 처리 세포는 일반적으로 경계를 한 번만 가로지르는 반면, 대조군 irna 세포의 대표적인 궤적은 세포가 일반적으로 경계를 한 번 가로지르며 CD gap에 비해 더 단단한 표면에 우선적으로 머무름을 보여줍니다. 강성에 대한 선호도를 보이지 않은 irna 처리 세포들은 경계를 여러 번 가로질렀습니다.이 영상을 시청한 후, PDMS 기판을 준비하고, duris 챔버를 조립하며, DUR tax를 정량화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

a-simplified-system-for-evaluating-cell-mechanosensing-durotaxis

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

ECIS / 택시 시스템은 세포 chemotaxis를 측정하는 자동화된 실시간 분석이다. 본 분석에서는 세포 표적 전극에 도착하는 아가로 오스의 레이어 아래로 이동합니다. 세포 운동은 AC 전류를 0으로 저항의 발병에 의해 측정됩니다.

ECIS / 택시와 셀룰러 Chemotaxis 측정

기계감각에 영향을 미치는 새로운 돌연변이를 식별하기 위해 MARCM 방법에 의해 생성된 돌연변이 클론에서 파리 강모의 촉각 자극에 대한 행동 반응을 측정하는 분석을 설계했습니다. 이 기술의 결합을 통해 그렇지 않으면 치명적일 수 있는 기계민감성 돌연변이를 식별할 수 있습니다.

의 Mechanosensation에 대한 행동 분석 클론의 MARCM은 기반<em&gt; 초파리</em

이들은 기계적 장력 송신 조직 항상성 및 개발에 관여하는 신호 전달 경로를 시작으로 세포 표면 유착은 mechanotransduction 중앙이다. 여기서는 리간드 피복 된 자성 마이크로 비드 접착 수용체 포스 응용 프로그램을 사용하여, 인장에 응답하여 활성화되는 생화학 적 경로를 해부위한 프로토콜을 제시한다.

자석 구슬을 사용하여 기계 인장에 대한 응답으로 세포 표면 접착 리모델링 분석

여기는 심각한 기계적인 자극에 세포질 응답을 평가 하기 위한 방법에 설명 합니다. 현미경 기반 분석 결과에서 우리 전단 흐름 간략 한 자극에 따라 붙일 표시 된 바이오 센서의 지역화를 검사 합니다. 우리는 또한 화학적 심각한 기계적인 자극에 응답에 대 한 관심의 다양 한 단백질의 활성화를 테스트합니다.

Dictyostelium discoideum 응답 심각한 기계적인 자극의 평가

Mechanobiology 연구에 대 한 새로운 도구 어떻게 기계적 스트레스를 이해 하는 데 필요한 생화학 경로 활성화 하 고 elicits 생물학 응답. 여기, 우리 세포 응답의 고해상도 이미지를 수 있도록 미세 트랩으로 움직이지 동물의 선택적 기계적 자극에 대 한 새로운 방법을 전시.

기계적 자극 및 높은 해상도 C. 선 충 의 이미징에 대 한 마이크로 장치를 사용 하 여

선물이 빛 시트 현미경을 초파리 태아에 구슬 없이 셀 역학을 구현 결합 광학 족집게의 설치.

초파리 배아에 구슬 없는 광학 핀셋으로 셀 역학 조사

기계적 힘은 세포 이동을 제어하는 데 중요합니다. 이 프로토콜은 유리 마이크로파이펫 및 마이크로매니퓰레이터를 사용하여 변형될 수 있는 탄성 하이드로겔의 사용을 입증하여 세포 구조 및 이동의 변화를 유도하기 위해 국소 강성 구배를 가진 세포를 자극한다.

세포 운동 및 관련 신호 이벤트의 기계적 제어를 평가하기위한 단일 세포 Durotaxis 분석

iTACS(셀룰러 신호)를 분석하는 통합 툴킷은 부착 셀에서 다양한 화학 및 기계적 신호를 동시에 측정하는 과정을 자동화합니다. iTACS는 지역 사회 기반의 개발을 용이하게하고 연구원이 교육 배경에 관계없이 모든 플랫폼 기능을 사용할 수 있도록 설계되었습니다.

세포 신호를 분석하는 통합 툴킷: 힘, 동작, 형태학 및 형광

이 연구는 형광 단백질 마이크로패턴의 시각화된 변위를 기반으로 단일 세포 수축력의 단순화되고 핸드오프 정량화를 위해 마이크로웰 형식으로 형광 표지된 엘라스토머 수축성 표면(FLECS) 기술을 활용하기 위한 유연한 프로토콜을 제시합니다.

마이크로 패턴화된 엘라스토머를 이용한 단일 세포 수축성의 단순화된 고처리량 분석

본 프로토콜은 최소한의 사용자 개입으로 수백 개의 초파리 멜라노가스터 배아를 정렬, 고정 및 정밀하게 압축할 수 있는 미세유체 시스템의 설계, 제조 및 특성화를 설명합니다. 이 시스템은 자극 후 분석을 위한 샘플의 고해상도 이미징 및 회수를 가능하게 하며 다른 다세포 생물학적 시스템을 수용하도록 확장할 수 있습니다.

고처리량 미세유체 압축 시스템을 통한 다세포 유기체의 기계자극

여기에 제시된 것은 mechano-node-pore sensing (mechano-NPS)라고하는 전자 기반 미세 유체 플랫폼을 사용하여 단일 세포를 기계적으로 표현형하는 방법입니다. 이 플랫폼은 1-10 cells/s의 적당한 처리량을 유지하면서 세포의 탄성 및 점성 생물물리학적 특성을 모두 측정합니다.

Mechano-Node-Pore 감지: 다중 파라미터 단일 셀 점탄성 측정을 위한 신속한 무표지 플랫폼

배우세요 세포 듀로택시스를 연구하는 간소화된 PDMS 기반 시스템을 사용하여 포유류 세포가 경직된 기질로 이동하는 메커니즘을 실시간 현미경으로 관찰하는 방법을 익히세요.

평가 셀 Mechanosensing 및 Durotaxis에 대한 단순화 된 시스템

더 많은 동영상 탐색