평가 셀 Mechanosensing 및 Durotaxis에 대한 단순화 된 시스템

이 절차의 전반적인 목표는 많은 포유류 세포가 더 단단한 기질 쪽으로 우선적으로 이동하는 세포 강성(cell durotaxis) 분석을 위한 간소화된 시스템을 제공하는 것입니다. 이는 먼저 정의된 강성을 가진 폴리메틸실록산(Polymethylsiloxane) 또는 PDMS 기질을 준비함으로써 수행됩니다. 다음으로, 준비된 PDMS를 6-웰 플레이트의 각 웰에 붓고 기포를 제거합니다.

그런 다음 각 웰의 PDMS 위에 멸균된 커버슬립을 배치하여 오버레이를 생성함으로써 Durotax 챔버를 완성합니다. 마지막 단계는 다른 세포와의 상당한 상호작용 없이 세포가 이동할 수 있는 충분한 공간을 제공하는 밀도로 Durotax 챔버에 세포를 파종하는 것입니다. 최종적으로, 이동하는 세포의 축을 연구하기 위해 생세포 현미경 관찰이 사용됩니다.

폴리아크릴아마이드와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 구배 겔(gradient gel) 대안 대신 부드러운 PDMS와 단단한 유리 사이에 단일 단계만 존재한다는 점입니다. 또한, 피브로넥틴과 같은 세포외 기질 성분으로 PDMS를 코팅할 때 폴리아크릴아마이드 겔에서 필요한 화학적 가교 결합이 필요하지 않습니다. 6-웰 조직 배양 플레이트 하나를 준비하려면, 먼저 50 mL 원심 분리관을 사용하여 용액의 균형을 맞추십시오.

50 milliliter 튜브에 poly dimethyl suboxane 또는 PDMS 베이스 용액을 약 10 grams 계량합니다. 90:1 기판 비율의 경우, 계량한 PDMS 베이스 용액의 무게를 90으로 나눕니다. 필요한 가교제 용액의 정확한 양을 결정한 후, 계산된 양의 PDMS 가교제 용액을 튜브에 추가하고 실온에서 5분 동안 PDMS 베이스 가교제 혼합물을 격렬하게 섞어줍니다.

이 단계에서 작은 스패튤라를 사용하면 혼합물에 소량의 기포가 포함될 수 있습니다. PDMS 기판을 벤치탑 원심분리기에 넣고 50 ×g에서 5분 동안 원심분리하십시오. 기포가 여전히 남아 있다면 실온에 두어 기포를 제거하십시오.

5분 후 다시 원심분리하고, 90:1 PDMS 기질 1 mL를 조직 배양 처리된 6-웰 플레이트의 각 웰에 피펫으로 분주합니다. PDMS 내에 남아 있는 기포는 이 단계에서 21게이지 바늘로 터뜨려 제거할 수 있습니다.

PDMS가 웰 내에서 30분 동안 퍼지도록 둡니다. 다음으로 12mm 유리 Number one 커버슬립을 증류수에 5분 동안 끓이며, 이를 총 3회 반복합니다. 커버의 한쪽 면을 살짝 터치하여 조직 배양 플레이트의 각 웰에 건조된 커버슬립을 하나씩 넣습니다.

커버슬립을 PDMS 용액에 담근 후, 다시 PDMS 위로 떨어뜨립니다. 커버슬립이 안착됨에 따라 PDMS가 커버슬립의 가장자리를 따라 침범하기 시작하지만, 완전히 덮지는 않습니다. 이렇게 하면 경화 후 PDMS와 유리 사이에 계면이 생성됩니다.

PDMS를 경화시키기 위해 플레이트를 오븐에서 70 °C로 16시간 동안 배양합니다. 마지막으로, 플레이트를 세포 배양 후드에 넣고 10분 동안 UV 멸균합니다. 각 durox 챔버를 칼슘과 마그네슘이 없는 인산염 완충 식염수에 희석한 1 mL의 fibronectin으로 30 °C에서 1시간 동안 코팅합니다.

표면 전체가 PBS 내의 피브로넥틴 용액에 잠겼는지 확인하십시오. 0.5 g의 BSA를 정량하여 50 mL의 여과된 PBS에 녹여 1% 소태아혈청 알부민(bovine serum albumin) 또는 BSA 열처리 용액을 준비합니다. 용액을 0.22 µm 필터로 여과하여 멸균한 후, 80 °C에서 12분 동안 가열하십시오.

다음으로, 피브로넥틴(fibronectin) 용액을 흡입하여 제거하고 챔버를 PBS로 3회 세척합니다. 각 웰에 PBS에 녹인 열 변성 BSA 1 mL를 첨가하고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 듀렉스(durex) 챔버가 열 변성 BSA로 블로킹되는 동안, 트립신 처리 후 원하는 세포의 수를 측정합니다. 세포를 플레이팅하기 직전에 챔버에서 BSA 용액을 흡입하여 제거합니다.

doax 챔버의 각 웰에 10,000개의 세포를 2 mL 부피로 분주합니다. 선택한 특정 세포 유형에 필요한 배지를 사용하여, 37°C, 5% CO₂ 조건의 가습 배양기에서 4시간 동안 세포가 기질에 부착되고 퍼지도록 합니다. 위상차 10배율 대물렌즈가 장착된 도립 현미경을 사용하여 살아있는 세포 이미징을 수행합니다. 현미경에는 밀폐된 환경 가습 챔버가 장착되어 있어야 하며, 이를 통해 장기 이미징 동안 37°C의 온도와 5% CO₂ 농도를 제어할 수 있어야 합니다.

세포가 약 3.5시간 동안 퍼진 후, 플레이트를 현미경 챔버에 장착하여 이미징을 진행합니다. 샘플이 챔버 내에서 30분 동안 평형 상태에 도달하도록 둡니다. 가능하다면 현미경의 자동 다점 방문(automated multi-point visiting) 기능을 설정하십시오.

PDMS와 유리 커버슬립 사이의 계면에 집중하여 계면 주변의 모든 지점을 이미지화할 지점을 선택합니다. Durex 챔버 이미지당 평균 40개 지점에 대해 최대 16시간 동안 10분마다 세포를 촬영하면, 관심 영역(ROI)이 두 개의 선으로 나타나며, 외측 선은 커버슬립의 가장자리에 해당하고 내측 선은 PDMS와 커버슬립 사이의 실제 계면에 해당합니다. 데이터를 분석하려면 텍스트 프로토콜에 표시된 것과 같은 스프레드시트를 생성하십시오.

생성된 각 동영상에서 PDMS에서 유리 표면으로, 그리고 그 반대로 이동하는 교차 이벤트 횟수를 측정하십시오. 교차 이벤트는 세포 핵이 PDMS와 유리의 경계를 어느 방향으로든 통과하는 것으로 정의합니다. 여러 번의 교차를 정량화하기 위해 엑셀 스프레드시트의 해당 열에 교차 이벤트 횟수를 기록하십시오.

세포가 인터페이스를 가로지른 횟수를 측정하십시오. 해당 횟수를 영상 종료 시점에 세포가 위치했던 기판에 해당하는 Excel 열에 기록하십시오. 영상에서 인터페이스를 가로지르는 모든 세포에 대해 이 분석을 반복하십시오.

이미징 중에 시야 밖으로 이동한 세포는 제외하십시오. PDMS에서 유리 표면으로 이동하여 Durotaxis를 겪은 세포의 백분율을 계산하십시오. 방법은 다음과 같습니다.

soft에서 hard로의 교차 이벤트 수와 hard에서 끝난 다중 교차 이벤트 수를 더한 후, 이를 전체 교차 이벤트 수로 나눕니다. 다중 교차의 총합을 전체 교차 수로 나누어 다중 교차의 백분율을 계산함으로써, 세포가 주변 환경의 기계적 신호에 대응하는 분자적 메커니즘을 이해하기 시작합니다. 특정 단백질은 여기에서 보여주는 것과 같이 siRNA를 사용하여 넉다운할 수 있습니다.

대조군 irna 처리 세포의 약 70%가 axxis를 보였습니다. 이와 극명하게 대조적으로, RNAi를 사용하여 CD gap을 넉다운시켰을 때, 세포들은 단단한 기질 또는 부드러운 기질 중 어디로 이동할지에 대해 선호도를 보이지 않았습니다. 또한, CD gap 넉다운 세포들은 경계를 여러 번 가로질렀습니다.

대조군 irna 처리 세포는 일반적으로 경계를 한 번만 가로지르는 반면, 대조군 irna 세포의 대표적인 궤적은 세포가 일반적으로 경계를 한 번 가로지르며 CD gap에 비해 더 단단한 표면에 우선적으로 머무름을 보여줍니다. 강성에 대한 선호도를 보이지 않은 irna 처리 세포들은 경계를 여러 번 가로질렀습니다.

이 영상을 시청한 후, PDMS 기판을 준비하고, duris 챔버를 조립하며, DUR tax를 정량화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.