평가 셀 Mechanosensing 및 Durotaxis에 대한 단순화 된 시스템 체외

이 절차의 전반적인 목표는 많은 포유류 세포가 더 단단한 기질로 우선적으로 이동하는 세포 듀렉스 분석을 위한 단순화된 시스템을 제공하는 것입니다. 이는 먼저 정의된 강성의 폴리메틸 수복산 또는 PDMS 기질을 준비함으로써 달성됩니다. 다음으로, 제조된 PDMS를 6개의 웰 플레이트의 각 웰에 붓고 기포를 제거합니다.

그런 다음 Durex 챔버는 각 웰의 PDMS 상단에 멸균된 커버 슬립을 배치하여 오버레이를 생성함으로써 완성됩니다. 마지막 단계는 세포가 다른 세포와 큰 상호 작용 없이 이동할 수 있는 충분한 공간을 제공하는 밀도로 Duro 세금 챔버에 세포를 시드하는 것입니다. 궁극적으로, 살아있는 세포 현미경은 이동하는 세포의 axxis를 연구하는 데 사용됩니다.

폴리 아크릴아미드와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 그래디언트 젤 대안 대신 연질 PDMS와 경질 유리 사이에 단일 단계가 있다는 것입니다. 또한 PDMS를 세포외 기질로 코팅피브로넥틴과 같은 구성 요소는 폴리아크릴아미드 겔에 필요한 화학적 가교가 필요하지 않습니다. 하나의 6웰 조직 배양 플레이트를 먼저 준비하려면 50ml 원추형 튜브로 저울을 찢습니다.

10ml 튜브에 약 50g의 폴리 디메틸 수복산 또는 PDMS 기본 용액의 무게를 잰다. 90 대 1 기판의 경우 PDMS 기본 용액의 측정된 중량을 90으로 나눕니다. 필요한 정확한 가교 결합 용액의 양을 결정하기 위해 계산된 양의 PDMS 가교 용액을 실온에서 5분 동안 튜브가 격렬하게 혼합된 A-P-D-M-S 염기 가교 혼합물에 첨가합니다.

이 단계에서 작은 주걱을 사용하면 혼합물에 적은 수의 기포가 포함됩니다. PDMS 기판을 탁상형 원심분리기에서 50회씩 5분 동안 원심분리합니다. G. 아직 거품이 있는 경우 실온을 추가하여 거품을 제거합니다.

5분 동안 원심분리한 후, 90 대 1 PDMS 기질 1 밀리리터를 처리된 조직 배양물의 각 웰에 다시 피펫팅한다. 6개의 웰 플레이트. PDMS에 남아 있는 기포는 이 단계에서 21게이지 바늘로 터뜨려 제거할 수 있습니다.

PDMS가 우물에서 30분 동안 퍼지도록 합니다. 다음으로 12mm 유리를 끓여서 1 번, 뚜껑을 증류수에 5 분 동안 총 3 번 넣습니다. 덮개의 한쪽 면을 부드럽게 만져 조직 배양 플레이트의 각 웰에 건조된 덮개 슬립 하나를 놓습니다.

PDMS 솔루션에 밀어 넣은 다음 커버 슬립을 PDMS에 떨어뜨립니다. 커버 슬립이 안정되면 PDMS가 커버 슬립의 가장자리를 침범하기 시작하지만 완전히 덮지는 않습니다. 이렇게 하면 경화 후 PDMS와 유리 사이에 인터페이스가 생성됩니다.

PDMS를 경화시키기 위해 섭씨 70도의 오븐에서 16시간 동안 플레이트를 배양합니다. 마지막으로 플레이트를 세포 배양 후드에 넣고 10분 동안 UV 살균합니다. 칼슘과 마그네슘이 없는 인산염 완충 식염수에 피브로넥틴 1ml를 넣어 각 듀록스 챔버를 섭씨 30도에서 1시간 동안 코팅합니다.

전체 표면이 PBS 용액의 피브로넥틴에 잠겨 있는지 확인합니다. BSA 0.5g의 무게를 측정하고 PBS 필터 50ml에 용해시켜 열 특성의 1% 소 혈청 알부민 또는 BSA를 준비합니다. 22 미크론 필터를 통해 용액을 살균한 후 섭씨 80도에서 12분 동안 가열합니다.

다음으로, 피브로넥틴 용액을 흡인하고 PBS로 챔버를 세 번 세척합니다. PBS에 있는 열 변성 BSA 1ml를 각 웰에 첨가하고 실온에서 30분 동안 배양하고, 눈을 트립신하고, 듀렉스 챔버가 열로 막히는 동안 선택한 세포를 계산합니다. 변성 BSA는 도금 세포 직전의 챔버에서 BSA 용액을 흡입합니다.

플레이트 10, 000 세포를 2 밀리리터의 부피로 doax 챔버의 각 우물로. 선택한 특정 세포 유형에 필요한 배지를 사용하여 세포가 5%CO2로 섭씨 37도의 가습 인큐베이터에서 4시간 동안 기질에 부착 및 확산되도록 한 다음 10 x 대물렌즈의 위상차를 사용하여 도립 현미경에서 라이브 셀 이미징을 수행합니다. 현미경에는 밀폐된 환경 가습 챔버가 장착되어 있어야 하며, 이를 통해 장기 이미징 중에 섭씨 37도의 온도와 5%CO2의 온도를 제어할 수 있어야 합니다.

세포가 약 3.5시간 동안 퍼진 후 이미징을 통해 현미경 챔버에서 플레이트를 조립합니다. 샘플이 챔버에서 30분 동안 평형을 이루도록 합니다. 사용 가능한 경우 현미경에서 자동화된 다지점 방문을 설정합니다.

PDMS와 유리 커버 슬립 사이의 인터페이스에 초점을 맞추고 인터페이스 주변의 모든 이미지를 표시할 지점을 선택합니다. Durex 챔버 이미지당 평균 40개의 포인트, 최대 16시간 동안 10분마다 셀, 관심 영역은 커버 슬립의 가장자리에 해당하는 외부 라인과 PDMS와 커버 슬립 사이의 실제 인터페이스에 해당하는 내부 라인이 있는 두 개의 선으로 나타납니다. 데이터를 분석하려면 텍스트 프로토콜에 표시된 것과 같은 스프레드시트를 생성합니다.

생성된 각 동영상에서 PDMS에서 유리 표면으로, 또는 그 반대로 교차 이벤트의 수를 계산합니다. 교차 이벤트는 PDMS와 유리 사이의 경계를 어느 방향으로든 통과하는 세포핵으로 정의됩니다. Excel 스프레드시트의 해당 열에 교차 이벤트 수를 기록하여 여러 교차를 정량화합니다.

셀이 인터페이스를 통과한 횟수를 계산합니다. 이 숫자는 동영상의 끝에서 셀이 위치한 기판에 해당하는 Excel 열에 기록되어야 합니다. 동영상에서 인터페이스를 교차하는 모든 셀에 대해 분석을 반복합니다.

이미징 중에 시야 밖으로 이동하는 세포를 제외합니다. PDMS에서 유리 표면으로 이동하여 Duro Texas를 거친 세포의 비율을 계산합니다. 그렇게하기 위해.

소프트에서 하드까지 교차 이벤트의 수와 하드에서 종료된 여러 교차 이벤트의 수를 더하고 총 교차 이벤트 수로 나눕니다. 여러 교차의 총계를 총 교차의 수로 나누어 다중 교차의 백분율을 계산하여 세포가 환경의 기계적 신호에 대응하는 분자 메커니즘을 이해하기 시작합니다. 특정 단백질은 여기에 나타난 바와 같이 IRNA를 사용하여 녹다운할 수 있습니다.

대조군 irna 처리 세포의 약 70%가 axxis를 나타냈습니다. 이와는 대조적으로, RNAi를 사용하여 CD 갭을 무너뜨렸을 때, 세포는 단단한 기질이나 부드러운 기질로 이동하는지 여부에 대해 선호하지 않았습니다. 또한, CD 갭 넉다운 셀은 경계 배수를 넘었습니다.

대조군 irna 처리된 세포는 일반적으로 한 번 대표적인 제어 트랙만 경계를 넘습니다. Irna 세포는 세포가 일반적으로 경계를 한 번 가로질러 이동하고 CD 갭에 비해 더 단단한 표면에 우선적으로 머무는 것을 보여줍니다. Irna는 두 강성 중 어느 것에도 선호되지 않고 경계를 여러 번 넘지 않는 세포를 처리했습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 PDMS 기판을 준비하고, duris 챔버를 조립하고, DUR 세금을 정량화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.