Un système simplifié pour la cellule évaluation mechanosensing et durotaxis

L'objectif général de cette procédure est de fournir un système simplifié pour l'analyse de la durex cellulaire, un phénomène par lequel de nombreuses cellules de mammifères migrent préférentiellement vers un substrat plus rigide. Ceci est réalisé en préparant tout d'abord des substrats en Polyméthylséloxane ou PDMS de rigidité définie. Ensuite, le PDMS préparé est versé dans chaque puits d'une plaque à six puits et toutes les bulles d'air sont éliminées.

Les chambres Durex sont ensuite complétées par la pose d'un coverslip stérilisé sur le dessus du PDMS dans chaque puits afin de créer une superposition. La dernière étape consiste à ensemencer des cellules dans les chambres Duro taxes à une densité permettant aux cellules suffisamment d'espace pour migrer sans interactions significatives avec d'autres cellules. Enfin, une microscopie de cellules vivantes est utilisée pour étudier les axxis dans les cellules migratrices.

L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que le polyacrylamide est qu'elle comporte une seule étape entre le PDMS souple et le verre rigide, contrairement aux gels à gradient. De plus, l'enduction du PDMS avec des composants de la matrice extracellulaire comme la fibronectine ne nécessite pas de réticulation chimique, laquelle est indispensable pour les gels de polyacrylamide. Pour préparer une plaque de culture tissulaire à six puits, commencez par déchirer l'équilibre avec un tube conique de 50 millilitres.

Prélevez environ 10 grammes de la solution de base de polydiméthylsiloxane ou PDMS dans un tube de 50 millilitres. Pour un rapport de 90 à 1 du substrat, divisez le poids mesuré de la solution de base de PDMS par 90. Pour déterminer la quantité correcte de solution de réticulateur nécessaire, ajoutez la quantité calculée de solution de réticulateur de PDMS au tube, puis mélangez vigoureusement le mélange de base de PDMS et de réticulateur pendant cinq minutes à température ambiante.

À l'aide d'une petite spatule à ce stade, le mélange contiendra un petit nombre de bulles d'air. Centrifuger le substrat en PDMS dans une centrifugeuse de table pendant cinq minutes à 50 fois. G. Ajouter la température ambiante pour éliminer les bulles s'il en reste.

Après cinq minutes, effectuez une nouvelle centrifugation, puis pipetez un millilitre du substrat PDMS 90:1 dans chaque puits de la plaque de culture tissulaire traitée à six puits. Toutes les bulles d'air résiduelles présentes dans le PDMS peuvent être éliminées à ce stade en les perçant avec une aiguille de calibre 21.

Laisser le PDMS s'étaler pendant 30 minutes dans le puits. Ensuite, faire bouillir des lamelles en verre de 12 millimètres, numéro un, dans de l'eau distillée pendant cinq minutes, au total trois fois. Placer une lamelle sèche dans chaque puits de la plaque de culture tissulaire en touchant doucement un côté de la lamelle.

Insérez le lamelle dans la solution de PDMS, puis déposez délicatement le lamelle sur le PDMS. Lorsque le lamelle s'immobilise, le PDMS commence à recouvrir les bords du lamelle, sans toutefois le recouvrir complètement. Cela crée une interface entre le PDMS et le verre après polymérisation.

Incuber la plaque à 70 degrés Celsius dans un four pendant 16 heures pour polymériser le PDMS. Enfin, placer la plaque dans une hotte de culture cellulaire et stériliser par rayonnement UV pendant 10 minutes. Recouvrir chaque chambre Durox d'un millilitre de fibronectine dans du tampon phosphate salin sans calcium ni magnésium, pendant une heure à 30 degrés Celsius.

Veillez à ce que toute la surface soit immergée dans la solution de fibronectine dans le PBS. Préparez de l'albumine sérique bovine (BSA) à 1 % dénaturée par la chaleur en pesant 0,5 gramme de BSA et en la dissolvant dans 50 millilitres de PBS filtré. Stérilisez une solution à l’aide d’un filtre de 0,22 micron avant de la chauffer à 80 degrés Celsius pendant 12 minutes.

Ensuite, aspirez la solution de fibronectine et lavez les chambres trois fois avec du PBS. Ajoutez un millilitre de BSA dénaturé par la chaleur dans du PBS dans chaque puits et incubez pendant 30 minutes à température ambiante, trypsinisez les cellules, puis comptez les cellules de votre choix pendant que les chambres Durex sont bloquées avec le BSA dénaturé par la chaleur. Aspirez la solution de BSA des chambres juste avant de semer les cellules.

Plaquez 10 000 cellules dans un volume de deux millilitres dans chaque puits de la chambre doax. À l’aide du milieu requis pour le type cellulaire choisi, laissez les cellules adhérer et s’étaler sur le substrat pendant quatre heures dans un incubateur humide à 37 degrés Celsius avec 5 % CO2, puis effectuez une imagerie de cellules vivantes sur un microscope inversé en contraste de phase avec un objectif 10 x. Le microscope doit être équipé d’une chambre environnementale fermée et humidifiée, permettant de contrôler la température à 37 degrés Celsius et 5 % CO2 pendant l’imagerie à long terme.

Après environ 3,5 heures de dispersion des cellules, monter la plaque dans la chambre du microscope. Laisser les échantillons s'équilibrer dans la chambre pendant 30 minutes. Configurer un système d'acquisition automatisé en plusieurs points sur le microscope, si disponible.

Portez l'attention sur l'interface entre le PDMS et la lame de verre et choisissez des points à imager tout autour de cette interface. En moyenne, 40 points par chambre Durex, imagez les cellules toutes les 10 minutes pendant jusqu'à 16 heures ; la région d'intérêt apparaîtra sous forme de deux lignes, la ligne externe correspondant au bord de la lame de verre et la ligne interne correspondant à l'interface réelle entre le PDMS et la lame de verre. Pour analyser les données, générez un tableau similaire à celui présenté dans le protocole textuel.

Comptez le nombre d'événements de franchissement du PDMS vers la surface en verre et inversement à partir de chaque vidéo générée. Un événement de franchissement est défini comme le passage du noyau cellulaire au-delà de la frontière entre le PDMS et le verre, dans un sens ou dans l'autre. Enregistrez le nombre d'événements de franchissement dans la colonne appropriée du classeur Excel afin de quantifier les franchissements multiples.

Comptez le nombre de fois que la cellule a franchi l'interface. Ce nombre doit être enregistré dans la colonne Excel correspondant au substrat sur lequel la cellule se trouvait à la fin du film. Répétez l'analyse pour chaque cellule qui franchit l'interface dans le film.

Exclure les cellules qui migrent hors du champ de vision pendant l'acquisition d'images. Calculer le pourcentage de cellules ayant migré du PDMS vers la surface en verre et ayant ainsi subi le test Duro Texas. Pour ce faire.

Ajouter le nombre d'événements de franchissement passant du doux au dur ainsi que les événements de franchissement multiples qui se sont terminés sur le dur, puis diviser par le nombre total d'événements de franchissement. Calculer le pourcentage de franchissements multiples en divisant le total des franchissements multiples par le nombre total de franchissements, afin de commencer à comprendre le mécanisme moléculaire par lequel les cellules répondent aux indices mécaniques de leur environnement. Des protéines spécifiques peuvent être inhibées par ARNi, comme illustré ici.

Environ 70 % des cellules contrôles traitées par ARNi présentaient un axe. De manière frappante, lorsque l'expression de CD gap était inhibée par ARNi, les cellules ne montraient aucune préférence quant à leur migration vers le substrat dur ou mou. En outre, les cellules avec inhibition de CD gap franchissaient la frontière plusieurs fois.

Alors que les cellules traitées au irna contrôle franchissent généralement la frontière une seule fois, des pistes représentatives de cellules irna contrôle montrent que ces cellules migrent généralement à travers la frontière une fois seule et restent préférentiellement sur la surface la plus rigide, comparé aux cellules traitées au CD gap irna, qui ne démontrent aucune préférence pour l'une ou l'autre rigidité et franchissent la frontière plusieurs fois.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment préparer les substrats en PDMS, assembler les chambres duris et quantifier les impôts DUR.