Un système simplifié pour la cellule évaluation mechanosensing et durotaxis In Vitro

L’objectif global de cette procédure est de fournir un système simplifié d’analyse des cellules durex à travers lequel de nombreuses cellules de mammifères migrent préférentiellement vers un substrat plus rigide. Ceci est accompli en préparant d’abord des substrats de polyméthyl suboxane ou PDMS de rigidité définie. Ensuite, le PDMS préparé est versé dans chaque puits d’une plaque à six puits et toutes les bulles d’air sont éliminées.

Les chambres Durex sont ensuite complétées par la mise en place d’une lamelle de recouvrement stérilisée sur le dessus du PDMS dans chaque puits pour créer un revêtement. La dernière étape consiste à ensemencer des cellules dans les chambres de taxes Duro à une densité qui donne aux cellules suffisamment d’espace pour migrer sans interactions significatives avec d’autres cellules. En fin de compte, la microscopie à cellules vivantes est utilisée pour étudier les axxis dans les cellules en migration.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme le poly-acrylamide est qu’il n’y a qu’une seule étape entre le PDMS souple et le verre rigide au lieu d’alternatives en gel dégradé. Revêtement également du PDMS avec une matrice extracellulaire Les composants tels que la fibronectine ne nécessitent pas de réticulation chimique, ce qui est nécessaire pour les gels de poly acrylamide. Pour préparer d’abord une plaque de culture tissulaire à six puits, déchirez le reste avec un tube conique de 50 millilitres.

Pesez environ 10 grammes de la solution de base de polydiméthyl suboxane ou PDMS dans le tube de 50 millilitres. Pour un substrat de 90 pour un, divisez le poids mesuré de la solution de base PDMS par 90. Pour déterminer la quantité correcte de solution de réticulation nécessaire, ajoutez la quantité calculée de solution de réticulation PDMS au mélange de base de réticulant A-P-D-M-S vigoureusement mélangé pendant cinq minutes à température ambiante.

À l’aide d’une petite spatule à ce stade, le mélange contiendra un petit nombre de bulles d’air. Centrifugez le substrat PDMS dans une centrifugeuse de paillasse pendant cinq minutes à 50 fois. G.Ajoutez la température ambiante pour éliminer les bulles s’il y a encore des bulles.

Après les cinq minutes de centrifugation, pipetez à nouveau un millilitre de substrat PDMS de 90 à un dans chaque puits de la culture tissulaire traitée. Plaque à six puits. Toutes les bulles d’air restantes présentes dans le PDMS peuvent être éliminées à ce stade en les faisant éclater avec une aiguille de calibre 21.

Laissez le PDMS se répandre pendant 30 minutes dans le puits. Ensuite, faites bouillir le verre de 12 millimètres Numéro un, couvrez-le dans de l’eau distillée pendant cinq minutes, un total de trois fois. Placez une lamelle séchée dans chaque puits de la plaque de culture tissulaire en touchant doucement un côté de la couverture.

Glissez-le dans la solution PDMS, puis laissez tomber le couvercle sur le PDMS. Au fur et à mesure que le bordereau de recouvrement se dépose, le PDMS commencera à empiéter sur les bords du bordereau de recouvrement, mais ne le couvrira pas complètement. Cela générera une interface entre le PDMS et le verre après durcissement.

Incuber la plaque à 70 degrés Celsius dans un four pendant 16 heures pour durcir le PDMS. Enfin, placez la plaque dans une hotte de culture cellulaire et stérilisez aux UV pendant 10 minutes. Enduire chaque chambre en durox d’un millilitre de fibronectine dans une solution saline tamponnée au phosphate sans calcium ni magnésium pendant une heure à 30 degrés Celsius.

Assurez-vous que toute la surface est immergée dans la fibronectine dans la solution PBS. Préparez de l’albumine sérique bovine à 1 % ou BSA en pesant 0,5 gramme de BSA et en le dissolvant dans 50 millilitres de filtre PBS. Stérilisez une solution à travers un filtre ponctuel de 22 microns avant de la chauffer à 80 degrés Celsius pendant 12 minutes.

Ensuite, aspirez la solution de fibronectine et lavez les chambres trois fois avec du PBS. Ajoutez un millilitre de BSA dénaturé par la chaleur dans du PBS dans chaque puits et incubez pendant 30 minutes à température ambiante, trypsine yeux, et comptez les cellules de votre choix pendant que les chambres durex sont bloquées par la chaleur. Solution d’aspiration de BSA dénaturée des chambres juste avant le placage des cellules.

Plaquez 10 000 cellules d’un volume de deux millilitres dans chaque puits de la chambre doax. À l’aide du milieu requis pour le type de cellule choisi et laisser les cellules adhérer et se propager sur le substrat pendant quatre heures dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius avec 5 % de CO2, effectuer l’imagerie de cellules vivantes sur un microscope inversé en utilisant un contraste de phase avec un objectif 10 x. Le microscope doit être équipé d’une chambre humidifiée fermée, permettant de contrôler la température à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 pendant l’imagerie à long terme.

Après que les cellules se sont étalées pendant environ 3,5 heures, assemblez la plaque dans la chambre du microscope. Laissez les échantillons s’équilibrer dans la chambre pendant 30 minutes. Configurez la visite multipoint automatisée sur le microscope si disponible.

Concentrez-vous sur l’interface entre le PDMS et la lamelle en verre et choisissez des points pour imager tout autour de l’interface. Avec une moyenne de 40 points par image de chambre Durex, les cellules toutes les 10 minutes pendant une période pouvant aller jusqu’à 16 heures, la région d’intérêt apparaîtra sous la forme de deux lignes, la ligne extérieure correspondant au bord de la lamelle de protection et la ligne intérieure correspondant à l’interface réelle entre le PDMS et la lamelle. Pour analyser les données, générez une feuille de calcul comme celle illustrée dans le protocole texte.

Comptez le nombre d’événements de croisement entre le PDMS et la surface du verre et vice versa à partir de chaque film généré. Un événement de croisement est défini comme le noyau cellulaire passant au-dessus de la frontière entre le PDMS et le verre dans les deux sens. Inscrivez le nombre d’événements de franchissement dans la colonne appropriée de la feuille de calcul Excel afin de quantifier les passages à niveau.

Comptez le nombre de fois où la cellule a traversé l’interface. Ce numéro doit être enregistré dans la colonne Excel correspondant au substrat sur lequel se trouvait la cellule à la fin du film. Répétez l’analyse pour chaque cellule qui traverse l’interface dans le film.

Excluez les cellules qui migrent hors du champ de vision pendant l’imagerie. Calculez le pourcentage de cellules qui ont migré du PDMS vers la surface du verre et qui ont donc subi Duro Texas. Pour ce faire.

Additionnez le nombre d’événements de croisement de soft à hard et les multiples événements de croisement qui se sont terminés en hard et divisez par le nombre total d’événements de croisement. Calculez le pourcentage de croisements multiples en divisant le total des croisements multiples par le nombre total de croisements pour commencer à comprendre le mécanisme moléculaire par lequel les cellules correspondent à des signaux mécaniques dans leur environnement. Des protéines spécifiques peuvent être éliminées à l’aide de l’ARNi, comme illustré ici.

Environ 70 % des cellules témoins traitées à l’ARNi présentaient axxis. En revanche, lorsque l’écart CD a été réduit à l’aide de l’ARNi, les cellules n’avaient aucune préférence quant à savoir si elles migraient sur le substrat dur ou mou. De plus, les cellules d’inactivation de l’espace CD ont franchi le multiple limite.

Alors que les cellules de contrôle traitées à l’ARNi ne franchissent généralement la limite qu’une fois qu’elles représentent les traces de contrôle. Les cellules Irna montrent que les cellules migrent généralement une fois à travers la limite et restent préférentiellement sur la surface la plus rigide par rapport à l’espace CD. Irna a traité des cellules qui n’ont pas montré de préférence pour l’une ou l’autre rigidité et qui ont franchi la limite à plusieurs reprises.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation des substrats PDMS, de l’assemblage des chambres duris et de la quantification des taxes DUR.