Производство Nurr-1 Удельная поликлональных антител Бесплатные перекрестной реактивности против своих Близкие гомологи, Nor1 и Nur77

Общая цель этой процедуры заключается в повышении специфичности антител против близкородственных белков путем удаления перекрестно-реактивных антител. Это достигается путем предварительного выявления белковых доменов с наибольшим расхождением между гомологичными белками. Вторым шагом является экспрессия и очистка этих белковых доменов.

Затем эти белковые домены связываются через N или C концевую матрицу с хроматографической матрицей. В этой демонстрации используется Spheros. Заключительный этап состоит из инкубации иммунной сыворотки со смолами, связанными с каждым перекрестно-реакционным доменом.

В конечном счете, проводится Элиза и вестерн-блоттинг для оценки эффективности процедуры. Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как использование моноклональных антител или аффинная очистка, заключается в том, что мы можем поддерживать аффинность к желаемой мишени, устраняя известные перекрестно-реактивные эпитопы. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности, потому что белок, который они пытаются изучить, нестабилен.

Демонстрировать эту процедуру будет доктор Ури Ким, постдокторант нашей лаборатории. Для этого исследования требуются две колонки: одна для орфанных рецепторов, полученных из нейронов, одна или ни одна, а другая для фактора роста NER IB или 77. Поскольку один и тот же протокол применяется к обоим белкам, будет продемонстрировано только приготовление одной колонки.

Разморозьте белок, который должен быть соединен со смолой, на льду, а затем определите концентрацию белка, используя коэффициент его молярного экстинкции и его поглощение на 280 нанометрах. Используйте два миллилитра смолы на два миллиграмма белка. Все последующие шаги относятся к двум миллилитрам смолы.

В 10-миллилитровой колонке подготовьте 10-миллилитровую колонку, надавливая на дно FR и пропуская через нее PBS pH 7,4. Закройте крышкой нижнюю часть колонки и добавьте два миллилитра буфера для связи. Добавьте четыре миллилитра суспензии в колонку, чтобы получить два миллилитра смолы.

Снимите нижнюю крышку и дайте колонне стечь. Промойте колонку в общей сложности шестью миллилитрами или тремя объемами смоляного слоя соединительного буфера и дайте колонне стечь. После того, как буфер муфты будет слит, установите на место нижнюю крышку.

Далее добавьте в колонку от двух до четырех миллилитров белка, взвешенного в буфере для связи. Сохраняйте аликвоту белкового раствора, чтобы оценить эффективность соединения. Позже закройте колонку крышкой и перемешайте встык.

Чтобы получить однородный раствор, измерьте общий объем реакции, учитывая объем смолы, и добавьте 10 микролитров пятимолярного гидрида натрия саноборо на миллилитр реакции. Закройте колонку крышкой и перемешайте до конца. Конец. Закрепите колонку на вращателе трубки и дайте реакции продолжаться в течение ночи.

На следующее утро при температуре четыре градуса Цельсия поднесите колонку к химическому колпаку и осторожно снимите крышку, так как могло образоваться некоторое количество газа. Слейте колонку в чистую трубку и сохраните илу. Концентрация белка в ЭИТ будет измерена и сравнена с начальной концентрацией белка.

Чтобы оценить эффективность соединения, промойте смолу четырьмя миллилитрами буфера для соединения и дайте колонне стечь. После того, как связывающий лиганд домен или LBD был связан со смолой, следующим шагом является блокирование оставшихся сайтов. Чтобы начать эту процедуру, промойте смолу четырьмя миллилитрами гасящего буфера для слива и установите на место нижнюю крышку.

Добавьте два миллилитра закалочного буфера и суспензируйте смолу. Оцените общий объем реакции, измерив объем смолы и объем буфера для гашения. Добавьте 10 микролитров пяти моляров цианы борогидрида натрия на миллилитр реакционного объема.

Аккуратно перемешайте при комнатной температуре в течение 30 минут. Конец за торцом Через 30 минут поднесите колонну к вытяжному шкафу. Осторожно снимите верхнюю, а затем нижнюю крышку и дайте колонке стечь в сливную трубу.

Промойте колонку пятью объемами смолы промывочного раствора. Контролируйте смывки на наличие остаточных белков, измеряя абсорбцию на глубине 280 нанометров несвязанные белки вымываются высокой концентрацией соли. Наконец, промойте смолу шестью миллилитрами DGAs PBS, содержащими 0,02% азида натрия, держите колонку при температуре четыре градуса Цельсия до тех пор, пока это не понадобится.

Начните процедуру очистки специфических антител nore one с промывки колонки NORE 77 LBD 10 миллилитров PBS и позволив дренажной крышке колонки закрыть дно колонки, а затем поместите дренированную колонку neuro 77 LBD в новую пробирку для сбора 15 миллилитров. Добавьте в колонку пять миллилитров белка, очищенные антитела против нейро и закапывайте ее. Поместите колонку на вращатель при температуре четыре градуса Цельсия на один час.

Далее снимите верхнюю и нижнюю крышки и соберите поток. Отложите поток в сторону на льду до тех пор, пока не придет время добавить его в нор. Одна колонка с сопряженной LBD.

Промойте колонку, не связанную ни с одним LBD, 10 миллилитрами PBS и дайте стечке колонки закрыть нижнюю часть колонки и поместите колонку с ниткой LBD в 15-миллилитровую трубку для сбора. Добавьте сквозной поток с севера 77 LBD соединенной колонны. Закройте колонку крышкой и поставьте на ротор при температуре четыре градуса Цельсия на один час.

Через час. Снимите верхнюю и нижнюю крышки и соберите поток. Измерьте концентрацию антител, измерив абсорбцию на 280 нанометрах.

Очищенное антитело против nore one впоследствии анализируется Элизой. Добавьте 100 микролитров белка в лунки на 96 лунок. При тестировании три разных белка добавляют 100 микролитров белка 1 в лунки, 1 к Н 4, 100 микролитров белка 2 к лункам, 5 к 8 и 100 микролитров белка 3 к лункам 9 к 12.

Накройте тарелку крышкой и высиживайте в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия на следующее утро. Дважды промойте покрытые лунки 300 микролитрами на лунку PBS. Затем добавьте 300 микролитров блокирующего буфера Eliza во все лунки, покрытые антигеном, и выдерживайте при комнатной температуре в течение двух часов.

После двух часов блокировки замените блокирующий буфер ELIZA в каждой лунке на 100 микролитров свежего блокирующего буфера Elisa. Добавьте 100 микролитров разведенного очищенного антитела anti-EU one во все лунки подряд. Инкубировать при комнатной температуре в течение часа после часа.

Вымойте пластину три раза с 0,05% до 20 после третьей стирки, промокните пластину, чтобы удалить излишки буфера для стирки. Добавьте 100 микролитров пероксидазы хрена, конъюгированного козьего анти-бебида IgG, разведенного в блокирующем буфере Eliza, в каждую лунку, инкубируйте при комнатной температуре в течение одного часа через час. Вымойте тарелку три раза со скоростью 0,05% до 20, как показано ранее, после третьего мытья.

Промойте все лунки, наполнив их 300 микролитрами деионизированной воды, промокните лишнюю воду, перевернув пластину на впитывающую бумагу. Добавьте по 100 микролитров три, три прайма, пять, пять первичных тетраэтилбенадина, подогрейте до комнатной температуры во все лунки и выдержите от 15 до 30 минут в темноте при комнатной температуре. Остановите реакцию, добавив в каждую лунку по 50 микролитров двух нормальных Suric кислот

Наконец, считайте абсорбцию на 450 нанометрах. Вычитание фона на 650 нанометрах Сравнение белка. А не очищаются ни один специфический антитела с белком.

Очищенные антитела против Noro one с последующим прохождением через колонки No 77 LBD и no one LBD показывают, что в то время как белок является очищенным анти no one, он не проявлял сильного связывания ни с одним LBD. Он также показал значительное связывание с No 77 LBD и ни с одним LBD Дальнейшая очистка anti no nobody против no 77 LBD и no one LBD полностью удалила эту перекрестную реакцию. Эта специфичность была дополнительно продемонстрирована вестерн-блоттингом экстрактов из клеток, трансфицированных экспрессирующими векторами, несущими метку Mick полной длины, ни одно, ни одно, ни 77 анти-мик показало, что каждый полноразмерный белок экспрессируется на его ожидаемой молекулярной массе, ни один надежно детектированный полноразмерный белок, ни один, ни один. но и обнаруживал ни один, ни 77, хотя и менее эффективно.

В противоположность этому, полностью очищенное антитело не проявило какой-либо обнаруживаемой перекрестной реактивности ни одного, ни одного иммуногистохимического анализа дофаминовых нейронов среднего мозга с полностью очищенным антителом, которое не подтвердило заметную экспрессию ни одного иммуногистохимического вещества. Использование тирозингидроксилазы также показало, что нейро один также экспрессируется исключительно в ядре дофаминовых нейронов среднего мозга в существенной области черной мозга. дней, если она выполнена должным образом. Не забывайте, что работа с ионами натрия или гидридами может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как работа в химическом вытяжке.