Tomografía Computarizada e Imagen Óptico de Acoplamiento-Osteogénesis angiogénesis para evaluar la integración de craneales hueso autoinjertos y aloinjertos

El objetivo general de este procedimiento es monitorear la integración de injertos óseos craneales en términos de regeneración ósea y neovascularización mediante enfoques de imagen multimodal. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la medicina regenerativa, como la acoplamiento entre osteogénesis y angiogénesis. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona una determinación tridimensional de alta definición del árbol vascular, y permite el estudio del órgano completo. A continuación se demostrará el procedimiento con Doron Vic, una estudiante de doctorado en mi laboratorio, tras la eutanasia de un ratón Bab sea de siete a ocho semanas de edad.

Según el protocolo descrito, utilice una máquina para cortar el cabello para afeitar la región calvarial en contra del sentido del crecimiento del pelo. Aplique isopropanol al 70 % al cadáver, comenzando por la cabeza, para desinfectar. Luego, use un escalpelo número 11 para cortar la piel del cuero cabelludo y elimine el periostio utilizando un taladro dental y una púa con un diámetro interno de 4,5 milímetros.

Desprenda un fragmento circular de hueso craneal. Transfiera el fragmento de hueso a una placa de plástico de 100 milímetros que contenga solución salina estéril. En este momento, observe con pinzas curvas la sangre y el tejido blando adheridos al fragmento de hueso.

Sujete un fragmento óseo a la vez y utilice un aplicador de algodón para frotarlo completamente, eliminando cualquier tejido cerebral, tejido blando y sangre. Use tijeras finas para cortar suavemente cualquier astilla ósea que permanezca adherida al injerto, de modo que el injerto tenga una forma redondeada perfecta.

Sumerja cada injerto una vez en un tubo de 15 mililitros que contenga etanol al 70% y dos veces en tubos de 15 mililitros que contengan PBS para eliminar el etanol. Congele el aloinjerto en un congelador a menos 80 grados Celsius en tubos criogénicos durante al menos una semana después del congelamiento. Asegúrese de que el aloinjerto aparezca transparente al trabajar con ratones transgénicos receptores que expresan luciferasa bajo el control del promotor de osteocalcina.

Después de anestesiar un ratón hembra de siete a ocho semanas de edad utilizando anestésicos inyectables y verificar la sedación, use una maquinilla de afeitar en contra del sentido del crecimiento del pelo para afeitar la región calvarial. Aplique un agente depilatorio para eliminar cualquier resto de pelo y use gasa seca para retirarlo después de no más de dos minutos.

Luego, utilice gasa empapada en solución salina para limpiar el área. Desinfecte el cuero cabelludo aplicando clorhexidina al 5% por vía subcutánea. Inyecte cinco miligramos por kilogramo de carprofeno diluido en 200 microlitros de solución salina.

Aplique pomada oftálmica para prevenir el secado y mantenga al animal sobre una placa térmica en todo momento. Luego, coloque al animal debajo del binocular quirúrgico. A continuación, utilizando tijeras finas y pinzas, haga un corte ovalado de un centímetro de largo en la piel del cuero cabelludo con las pinzas.

Sujete el periostio y use tijeras finas para cortarlo con un taladro dental y una broca de refinado con un diámetro exterior de cinco milímetros; realice el defecto calvarial dos milímetros por delante de la sutura lambdoidea para evitar la penetración de la duramadre. Taladre hasta tres cuartas partes del espesor óseo y use una espátula para separar el fragmento óseo. Un paso crítico en el protocolo es la determinación de la ubicación del defecto.

La lesión de la sutura lambdoidea provocará una hemorragia masiva. Por lo tanto, se debe tener cuidado para no alterar el durómetro subyacente y el seno sagital superior. Para implantar un autoinjerto.

Utilice 10 mililitros de solución salina estéril en una placa plástica de 10 milímetros para lavar el fragmento óseo. Retire los coágulos de sangre sin eliminar el tejido blando para implantar un aloinjerto descongelado previamente y normalice la muestra a temperatura ambiente. Luego, lave el fragmento óseo con pinzas curvas.

Coloque el injerto óseo en el defecto de manera que no toque los márgenes del defecto. Luego, utilizando gel de fibrina, pegue el injerto al hueso receptor. Suture la piel con sutura Vicryl 4-0 y aplique yodopovidona en el corte quirúrgico.

Marque la oreja del ratón e inyecte 0.25 miligramos por kilogramo de anti sedan. Para revertir el efecto anestésico del meato. Realice los cuidados postoperatorios según el protocolo descrito en el texto.

Prepare la solución salina heparinizada pesando 2000 unidades de heparina sódica y transfiriéndolas a un tubo de 50 mililitros. Añada 20 mililitros de solución salina estéril al tubo y agite. Llene completamente una jeringa de bloqueo de enganche de 20 mililitros con 15 mililitros de solución salina heparinizada tibia y conecte la jeringa a un conjunto de venoclisis de calibre 23.

Fije la jeringa a una bomba de jeringa y configure la bomba para 10 mililitros a una velocidad de un mililitro por minuto. Después de anestesiar un ratón según el protocolo descrito en el texto, confirme la sedación mediante un pellizco en el dedo del pie y sujete al ratón sobre su espalda a una placa de fijación envuelta con un forro absorbente.

A continuación, corte la piel desde el abdomen hasta el cuello. Corte la pared abdominal hasta el proceso xifoides. Luego, corte la caja torácica a lo largo de su aspecto lateral, asegurándose de que el corazón quede completamente expuesto y de que el corazón y los pulmones no resulten dañados.

Utilice un hemostato para retraer el esternón. Introduzca la aguja de mariposa tres milímetros dentro del ventrículo izquierdo. Luego, con pegamento de tres segundos, pegue la aguja al corazón y a la pared torácica. La inserción de la aguja de mariposa en el ventrículo izquierdo es un procedimiento delicado.

Trate de evitar la inserción en el ventrículo derecho o demasiado profunda en el ventrículo izquierdo, ya que penetrará la pared cardíaca posterior. A continuación, active inmediatamente la bomba. Después de un minuto, seccione la vena cava inferior para despresurizar la vasculatura.

Incline la tabla de modo que los fluidos fluyan lejos de la cabeza. Una perfusión exitosa dará como resultado la decoloración del hígado y de los vasos sanguíneos. Ahora perfunda 10 mililitros de formaldehído al 4%.

Evite la penetración de burbujas de aire en la vasculatura. Cuando la perfusión esté completa, indicado por el endurecimiento de la cola, use 10 mililitros de solución salina heparinizada para eliminar el formaldehído. Prepare el agente de contraste radiopaco según las instrucciones del fabricante.

Mezclando el diluyente del compuesto y el agente de curado en un tubo de plástico, perfunda el animal con el agente de contraste a una velocidad de un mililitro por minuto. Las arterias coronarias, intestinales y hepáticas deben volverse amarillas cuando la perfusión esté completa. Corte el tubo hacia la aguja de mariposa y envuelva el cadáver en papel para evitar la fuga de la solución hacia la región calvarial.

Coloque el animal a cuatro grados Celsius durante la noche para permitir la polimerización al día siguiente. Para diseccionar la región calvarial, use un escalpelo para cortar la piel lo más lateral posible, evitando dañar la región craneal de interés. Localice el injerto óseo y luego use tijeras finas para cortar el hueso craneal a 10 milímetros de distancia del injerto.

Utilizando un escáner de micro-TC. Establezca el campo de visión en 20,5 milímetros, la energía de rayos X en 55 kVp, la intensidad en 145 microamperios, mil proyecciones por 360 grados y un tiempo de integración de 200 milisegundos. Escanee la muestra ósea calvarial aislada.

Observe las rebanadas reconstruidas en 2D que fueron generadas por el software de micro-TC. Asegúrese de escanear adecuadamente la región de interés y luego localice el defecto calvarial. Si los vasos perfundidos son fácilmente identificables, use ácido tricloroacético al 6 % diluido en agua doblemente destilada.

Para descalcificar la muestra, vuelva a escanear la muestra utilizando los mismos parámetros que se acaban de describir. Localice la sutura lambdoidea en las rebanadas 2D reconstruidas. Defina un volumen de interés cilíndrico o VOI de dos milímetros de altura y con un diámetro de ocho milímetros que sea tangente a la sutura.

Este es el sitio anatómico del defecto. A continuación, segmente el hueso a partir del tejido blando. Establezca el umbral inferior en 130 y aplique un filtro gaussiano 3D restringido para suprimir parcialmente el ruido en los volúmenes.

Genere una reconstrucción 3D. Asegúrese de que el VOI esté correctamente posicionado utilizando el software IPL y el objeto DT. Mediante la función Peram, genere un mapa de espesor.

Esta función describe el volumen del vaso para cada diámetro de vaso mediante imágenes y microtomografía computarizada. De acuerdo con el protocolo descrito en el texto, como se muestra aquí, siete días después de la cirugía, el escaneo de TC demostró un volumen significativamente mayor de vasos sanguíneos de diámetro pequeño y medio que nutrían toda el área del injerto en ratones que habían recibido autoinjertos en comparación con ratones que recibieron aloinjertos, en los cuales los vasos parecían penetrar desde el exterior. Además, la imagen de fluorescencia mostró una perfusión sanguínea significativamente mayor en los animales tratados con autoinjertos.

Al día 14, el árbol vascular en el aloinjerto alcanza toda la proximidad del injerto. Sin embargo, el volumen de los vasos fue significativamente menor en comparación con el grupo Autógrafo. Esta diferencia fue más pronunciada cuando se compararon los vasos con diámetros de 0,08 a 0,1 milímetros, como se observa aquí; el volumen de la vasculatura regresó al valor basal siete días después de la cirugía.

El grupo con autoinjerto demostró una mineralización ósea significativamente mayor, tal como se observó mediante imágenes de fluorescencia utilizando una sonda dirigida a la hidroxiapatita. En este grupo, el hueso se formó a lo largo de toda la proximidad del injerto, mientras que en el grupo con aloinjerto solo se formó en los márgenes del defecto, marcado por una forma anular. A los 56 días posteriores a la cirugía, el volumen óseo fue significativamente mayor y el grosor del injerto fue significativamente mayor en los animales que recibieron autoinjertos en comparación con los que recibieron aloinjertos. Una vez dominada, esta técnica quirúrgica puede realizarse en aproximadamente 25 minutos. Tras este procedimiento, se puede realizar imágenes de fluorescencia utilizando otras sondas para responder preguntas adicionales, por ejemplo, la actividad de los osteoclastos y la participación de la respuesta inmune.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo obtener imágenes de la regeneración ósea en la angiogénesis subyacente.