Tomografía Computarizada e Imagen Óptico de Acoplamiento-Osteogénesis angiogénesis para evaluar la integración de craneales hueso autoinjertos y aloinjertos

El objetivo general de este procedimiento es monitorizar la integración de los injertos óseos craneales en términos de regeneración ósea y neovascularización mediante abordajes de imagen multimodal. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la medicina regenerativa, como el acoplamiento de la osteogénesis y la angiogénesis. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona una determinación 3D de alta definición de los tres vasculares, y permite el estudio del órgano completo demostrando que el procedimiento será realizado por Doron Vic, un estudiante de doctorado en mi laboratorio después de la eutanasia de siete a ocho semanas de edad con un ratón marino Bab.

De acuerdo con el protocolo de texto, use una cortadora de cabello para afeitar la región de la pantorrilla en contra de la dirección del crecimiento del vello. Aplique un 70% de isopropanol a la canal, cabeza para desinfectar. A continuación, utiliza un bisturí número 11 para cortar la piel del cuero cabelludo y extraer el periostio con un taladro dental y una púa de 4,5 milímetros de diámetro interior.

Separe un fragmento circular de hueso de la pantorrilla. Transfiera el fragmento de hueso a un plato de plástico de 100 milímetros que contenga solución salina estéril. En este punto, observe la sangre y el tejido blando adheridos al fragmento de hueso con pinzas curvas.

Sostenga un fragmento de hueso a la vez y use un aplicador con punta de algodón para frotarlo completamente. Extirpación de cualquier tejido cerebral, tejido blando y sangre. Use unas tijeras finas para cortar suavemente cualquier viruta de hueso que quede adherida al injerto para que el injerto tenga una forma redondeada perfecta.

Sumerja cada injerto una vez en un tubo de 15 mililitros que contenga 70% de etanol y dos veces en tubos de 15 mililitros que contengan PBS para lavar el etanol. Congele el aloinjerto en un congelador a menos 80 grados Celsius en tubos criogénicos durante al menos una semana después de la congelación. Asegurar que el aloinjerto parezca transparente trabajando con ratones transgénicos receptores que expresan luciferasa bajo el control del promotor de osteocalcina.

Después de anestesiar a una rata hembra de siete a ocho semanas de edad con anestésicos inyectables y verificar la sedación. Use una cortadora de cabello en contra de la dirección del crecimiento del cabello para afeitar la región del calvario. Aplique un depilatorio para eliminar cualquier remanente de pelo y use una gasa seca para limpiarlo después de no más de dos minutos.

Luego, use una gasa empapada en solución salina para limpiar el área. Desinfectar el cuero cabelludo aplicando clorhexidina al 5% por vía subcutánea. Inyectar cinco miligramos por kilogramo de carprofeno diluido en 200 microlitros de solución salina.

Aplique ungüento para los ojos para evitar la sequedad y mantenga al animal en una almohadilla térmica en todo momento. A continuación, coloque al animal bajo los prismáticos de funcionamiento. A continuación, con unas tijeras finas y unas pinzas, haz un corte ovalado de un centímetro de largo en la piel del cuero cabelludo con unas pinzas.

Sostenga el periostio y use unas tijeras finas para cortarlo con un taladro dental y un taladro de cinco milímetros de diámetro exterior para refinar el defecto de la pantorrilla dos milímetros antes de la sutura lambdoidea para evitar la penetración de la duramadre. Perfore tres cuartas partes del camino en el hueso y use una espátula para separar el fragmento de hueso. Un paso crítico en el protocolo es la terminación de la ubicación del defecto.

La lesión de la sutura labométrica provocará un sangrado masivo. Por lo tanto, se debe tener cuidado de no alterar el durómetro subyacente y el sagital superior. Para implantar un autoinjerto.

Use 10 mililitros de solución salina estéril en una placa de plástico de 10 milímetros para lavar el fragmento de hueso. Retire los coágulos de sangre sin eliminar el tejido blando para implantar un aloinjerto, descongele con anticipación y normalice la muestra a temperatura ambiente. A continuación, lave el fragmento de hueso con unas pinzas curvas.

Coloque el injerto óseo en el defecto para que no toque los márgenes del defecto. Luego, con gel de fibrina, pegue el injerto al hueso huésped. Suturar la piel con cuatro suturas de vicrilo y aplicar povidona yodada sobre la incisión quirúrgica.

Marque la oreja del ratón e inyecte 0,25 miligramos por kilogramo anti sedán. Para revertir el efecto anestésico del meato. Realizar los cuidados postoperatorios según el protocolo de texto.

Preparar solución salina heparinizada pesando 2000 unidades de heparina sódica y transfiriéndola a un tubo de 50 mililitros. Agregue 20 mililitros de solución salina estéril al tubo y agite. Llene una jeringa de 20 mililitros con 15 mililitros de solución salina heparinizada tibia y conecte la jeringa a un juego de venas del cuero cabelludo de calibre 23.

Fije la jeringa a una bomba de jeringa y configure la bomba para 10 mililitros a un mililitro por minuto. Después de anestesiar a un ratón de acuerdo con el protocolo de texto, confirme la sedación con un pellizco en el dedo del pie y asegure el ratón puesto. Está de espaldas a un tablero de fijación envuelto con un revestimiento de superficie absorbente.

A continuación, corta la piel desde el abdomen hasta el cuello. Corta la pared abdominal hasta la apófisis xifoides. A continuación, corte la caja torácica a lo largo de su aspecto lateral, asegurándose de que el corazón esté completamente expuesto y de que el corazón y los pulmones no estén dañados.

Use un hemostático para retraer el esternón. Inserte la aguja de mariposa tres milímetros en el ventrículo izquierdo. Luego, con pegamento de tres segundos, pegue la aguja al corazón y la pared torácica La inserción de la aguja de mariposa en el ventrículo izquierdo es un procedimiento delicado.

Trate de evitar la inserción en el ventrículo derecho o demasiado profunda en el ventrículo izquierdo porque penetrará la pared posterior del corazón. A continuación, active inmediatamente la bomba. Después de un minuto, diseccionar la vena inferior CVA para despresurizar la vasculatura.

Inclina la tabla para que los líquidos fluyan lejos de la cabeza. El éxito de la perfusión dará lugar a una limpieza del hígado y los vasos sanguíneos. Ahora perfundido 10 mililitros de formaldehído al 4%.

Evitar la penetración de burbujas de aire en la vasculatura. Cuando la perfusión sea completa, como lo indica un endurecimiento de la cola, use 10 mililitros de solución salina heparinizada para eliminar el formaldehído. Prepare el agente de contraste radio-opaco de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Mezclando el diluyente compuesto y el agente de curado en un tubo de plástico, perfunda el animal con el agente de contraste a una velocidad de un mililitro por minuto. Las arterias coronarias, intestinales y hepáticas deben volverse amarillas cuando se completa la perfusión. Corte el tubo a la aguja de mariposa y envuelva la carcasa en papel para evitar fugas de la solución a la región del pantorrillo.

Coloque el animal a cuatro grados centígrados durante la noche para permitir la polimerización al día siguiente. Para diseccionar la región de la pantorrilla, utilice un bisturí para cortar la piel lo más lateral posible, evitando dañar la región craneal de interés. Ubique el injerto óseo y luego use unas tijeras finas para cortar el hueso craneal a 10 milímetros del injerto.

Usando un escáner de micro tomografía computarizada. Establezca el campo de visión en 20,5 milímetros, la energía de rayos X en 55 KVP, la intensidad en 145 microamperios, mil proyecciones por 360 grados y un tiempo de integración de 200 milisegundos. Escanee la muestra aislada de hueso del calvario.

Observe los cortes reconstruidos en 2D que fueron generados por el software de micro CT. Asegúrese de escanear correctamente la región de interés y luego localice el defecto de la pantorrilla. Si los recipientes perfundidos son fácilmente identificables, utilice ácido tricloroacético al 6% diluido en agua bidestilada.

Para descalcificar la muestra, vuelva a escanear la muestra utilizando los mismos parámetros que se acaban de describir. Localice la sutura lambdoidea en los cortes 2D reconstruidos. Definir un volumen cilíndrico de interés o VOI de dos milímetros de altura y con un diámetro de ocho milímetros que sea tangencial a la sutura.

Este es el sitio anatómico del defecto. A continuación, segmentar el hueso del tejido blando. Establezca el umbral inferior en 130 y aplique un filtro gaussiano 3D restringido para suprimir parcialmente el ruido en los volúmenes.

Genera una reconstrucción en 3D. Asegurarse de que el VOI esté colocado correctamente utilizando el software IPL y el objeto DT. Peram genera un mapa de grosor.

Esta función describe el volumen del vaso para cada diámetro de vaso para realizar imágenes y micro tomografía computarizada. De acuerdo con el protocolo de texto, como se muestra aquí, siete días después de la cirugía, la tomografía computarizada demostró un volumen significativamente mayor de vasos sanguíneos de diámetro pequeño y mediano que nutrieron toda el área del injerto en los ratones que habían recibido autógrafos en comparación con los ratones que recibieron aloinjertos donde los vasos parecían penetrar desde el exterior. Además, las imágenes de fluorescencia mostraron una perfusión sanguínea significativamente mayor en los animales tratados con autógrafos.

Hacia el día 14, el árbol vascular del aloinjerto alcanza toda la proximidad de los injertos. Sin embargo, el volumen de los vasos fue significativamente menor en comparación con el grupo Autographt. Esta diferencia fue más prominente cuando se compararon los vasos con diámetros de 0,08 a 0,1 milímetros, como se observó aquí 28 días después de la cirugía, el volumen de la vasculatura volvió al valor basal siete días después de la cirugía.

El grupo de autoinjerto demostró una mineralización ósea significativamente mayor, como se observa en las imágenes de fluorescencia utilizando una sonda dirigida por hidroxiapatita. El hueso se formó a lo largo de la proximidad del injerto en este grupo, mientras que se formó solo en los márgenes del defecto en el grupo de aloinjertos marcados por una forma de anillo 56 días después de la cirugía, el volumen óseo fue significativamente mayor y el grosor del injerto fue significativamente mayor en los animales que recibieron autógrafos en comparación con los aloinjertos. Una vez dominada, esta técnica quirúrgica se puede realizar en unos 25 minutos. Después de este procedimiento, se pueden realizar imágenes de fluorescencia utilizando otros sondeos para responder preguntas adicionales, por ejemplo, las actividades de los osteoclastos y la participación de la respuesta inmunitaria.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo obtener imágenes de la regeneración ósea en la angiogénesis subyacente.