Name: Asomándose al cerebro Polisomas con microscopía de fuerza atómica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Aprende a purificar y visualizar polirribosomas cerebrales mediante microscopía de fuerza atómica sin fijación ni marcado. Este método permite estudiar la organización ribosomal en condiciones fisiológicas con resolución nanométrica.

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Esta investigación fue apoyada por el proyecto de investigación AXonomIX financiado por la Provincia Autonoma di Trento, Italia.

Las prácticas utilizadas para obtener los tejidos de ratón fueron aprobados por el Cuerpo de Protección de los Animales (OPBA) de la Universidad de Trento (Italia), el protocolo no. 04-2015, Decreto Legislativo de acuerdo con el Artículo 31 no. 26/2014. Todos los ratones se mantuvieron en el Centro Organismo modelo del Centro de Biología Integrativa (CIBIO), Universidad de Trento, Italia. Precaución: Para evitar cualquier degradación del ARN de las muestras, preparar todos los tampones que usan agua tratada con DEPC para reducir al mínimo la contaminación de ARNasa. 1. Preparación de Polisomas de todo el cerebro <ol><li> La recopilación de los tejidos del cerebro (15 min) <ol><li> La eutanasia de tipo salvaje cepa de ratón C57BL / 6 con asfixia de CO 2 durante 5 min 36. Diseccionar cuidadosamente el cerebro fuera del cráneo 36, colocar el tejido en un tubo de 1,5 ml e inmediatamente colocarlo en nitrógeno líquido. Almacenar a -80 ° C hasta su uso. </li></ol></li><li> Preparación de lisado (30 min) <ol><li> Pulverizar todo el tejido cerebral usandoun mortero bajo nitrógeno líquido. </li><li> Transferir aproximadamente 25 mg de polvo a un tubo de microcentrífuga de frío e inmediatamente (para evitar la descongelación del tejido pulverizado) añadir 0,8 ml de tampón de lisis (véase la Tabla 1) e interrumpir la célula pipeteando arriba y abajo 25 veces rápidamente. </li><li> Centrifugar el tubo a 12.000 xg durante 1 min a 4 ° C para sedimentar los restos celulares. </li><li> Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga y mantener el tubo en hielo durante 15 min. </li><li> Centrifugar el tubo a 12.000 xg durante 5 min a 4 ° C para sedimentar los núcleos y mitocondrias. </li><li> Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga. </li><li> Almacenar el sobrenadante a -80 ° C durante un máximo de 6 meses o utilizarlo inmediatamente. </li></ol></li><li> preparación gradiente de sacarosa y centrifugación (2 horas y 30 minutos) <ol><li> Lavado de tubos de ultracentrífuga extensamente con RNasa libre de agua (agua tratada diethylpyrocarbonate (DEPC-agua) o comercial) unad 3% de H 2 O 2 / DEPC disolución de H 2 O. </li><li> Poner los tubos en hielo y añadir 5,5 ml de solución de sacarosa al 50% frío en la parte inferior de cada tubo (ver Tabla 1 para soluciones de sacarosa). añadir con cuidado la gota solución de sacarosa al 15% a gota, manteniéndose cerca de la interfase con el fin de preservar una interfase nítida, hasta que el tubo esté completamente lleno. Cuando el tubo está completamente lleno, cerrarlo con un tapón de goma para evitar la formación de burbujas de aire. </li><li> En una habitación fría suavemente fijar los tubos en posición horizontal y mantenerlo en esta posición durante 2 horas. Después de este tiempo, lentamente enderece los tubos de nuevo en la posición vertical y ponerlos en hielo. Los gradientes son ahora listo para ser utilizado. Alternativamente, preparar el gradiente de sacarosa 15 a 50% usando un gradiente convencional anterior. </li><li> En un cuarto frío retirar con cuidado 1,0 ml de la parte superior de la pendiente y la superposición con la caída de sacarosa a gota con el lisado citosólica (es decir, el sobrenadante obtenido en step 1,2). </li><li> baje con cuidado los tubos en las cubetas del rotor de cubeta oscilante. Centrifugar los gradientes de 100 min a 180.000 xga 4 ° C utilizando una ultracentrífuga. </li><li> Después de la centrifugación, dejar los tubos en sus cubetas durante 20 minutos a 4 ° C para permitir que los gradientes se estabilicen. </li></ol></li><li> fraccionamiento en gradiente de sacarosa (2 hr) <ol><li> Retirar con cuidado un tubo de ultracentrífuga desde el rotor de ultracentrifugación y montarlo en el dispositivo colector de un gradiente de densidad sistema de fraccionamiento. Recoger fracciones de 1 ml de seguimiento de la absorbancia a 260 nm con un detector de UV / VIS (Ver Figura 1 panel superior). Mantenga las fracciones recogidas en el hielo. </li><li> Preparar alícuotas de 30-40 l de las fracciones de interés, mantenerlos en hielo antes de almacenarlas a -80 ° C hasta su uso. No utilice alícuotas o fracciones de sacarosa que se sometieron a más de dos ciclos de congelación-descongelación (véase la figura 1 panel inferior). </li></ol> &lt;/ Li&gt; </ol> 2. Preparación de muestras para microscopía de fuerza atómica (3 hr) <ol><li> El uso de la cinta, retire las láminas de mica. </li><li> Lavar las hojas de mica 3-4 veces con DEPC-agua y colocarlo en una pequeña placa de Petri. Después hay que secar la superficie con el aire. </li><li> Cubrir la mica con 200 l de 1 mM NiSO4 y se incuba durante 3 minutos a TA. </li><li> Retire la solución de níquel y luego secar la superficie con el aire. Llevar a cabo todas las medidas futuras a 4 ° C mediante la colocación de la placa de Petri con la mica en hielo. </li><li> Descongelar una alícuota obtenida en 1.4.2 en hielo y suavemente añadir toda la gota a gota de la muestra en la mica. Con una punta de 100 a 200 l, se extendió la muestra sobre toda la superficie de la mica. Incubar la muestra en hielo durante 3 min. </li><li> Cubrir la caída de la hoja de mica a gota con 200 l de tampón frío-AFM (véase la Tabla 1) y se incuba durante 1 hora en hielo. </li><li> Imaging en líquido <ol><li> Retirar con cuidado el Buffer-AFM y lavar las hojas de mica 3-4 vezs con 200 l de tampón frío-AFM para eliminar el exceso de sacarosa. A continuación, lavar las hojas de mica 3 veces con solución de lavado en frío (ver Tabla 1), dejando la superficie de mica cubierto por algunos microlitros de solución. </li><li> Ir hasta el punto 3 (Adquisición de imágenes). </li></ol></li><li> Formación de imágenes en el aire <ol><li> Retirar con cuidado el Buffer-AFM y lavar la mica 3-4 veces con 200 l de tampón frío-AFM para eliminar el exceso de sacarosa. A continuación, se lava la mica 3 veces con solución de lavado en frío (véase la Tabla 1) y drenar el exceso de agua con papel. </li><li> Deja secar la muestra bajo el capó química con la parte superior de la placa de Petri parcialmente abierta. Después de 2 horas, cierre la placa de Petri y se almacena a temperatura ambiente. Medir la muestra después de 2-3 horas, ya que son estables durante años. </li></ol></li></ol> 3. Adquisición de imágenes (15 min por la imagen después de la estabilización térmica) Nota: Polisomas inmovilizados sobre mica se pueden obtener imágenes en el aire o en forma líquida, se utiliza el modo de corriente alterna. <ol><li> Una la mica para el soporte de muestra usando cinta de doble cara. </li><li> Inserte el soporte de la muestra en la etapa de AFM siguiendo las instrucciones del fabricante. Cuando la imagen en forma líquida, si es posible, trate de mantener la muestra a una temperatura inferior a 25 ° C para aumentar polisomas estabilidad en el tiempo. </li><li> Seleccionar un voladizo adecuada para obtener imágenes de CA y montarlo en el soporte de la punta siguiendo las instrucciones del fabricante. En este caso, el uso de voladizos con constante entre 2-20 N / m para obtener imágenes de aire y alrededor de 0,1 N / m para la imagen líquido vigor. </li><li> Ajuste el punto de láser en el voladizo cero y las señales de los detectores de cuadrante. </li><li> Seleccione una frecuencia de accionamiento oportuno y conducir el voladizo con una amplitud de 10 a 20 nm. </li><li> Acercarse a la muestra hasta que la punta se acopla a la superficie. </li><li> Seleccione un área de barrido de m 2x2, adquirir al menos 512x512 píxeles de las imágenes (ancho de píxel &lt;4 nm), seleccionar un modo de sustracción de fondo en vivo y una escala Z de 20-25 nm. </li><li> inspeccionar tque la imagen en busca de la presencia de objetos redondos que se caracterizan por la altura entre 10 y 15 nm al adquirir en el aire y 25 y 30 nm, cuando en líquido y la anchura en el intervalo de 25-30 nm. Ajustar los parámetros de consigna y la realimentación hasta que los objetos afilados se visualizan. El fondo debería aparecer relativamente plana en buenas muestras, con algunos objetos de altura 2-4 nm (véase la Figura 2A y B). </li><li> Si la imagen se ve bien (como se indica en el punto 3.8), adquirir varias exploraciones 2x2 micras (al menos diez) en las diferentes áreas de la muestra. </li><li> (opcional). Si es necesario, adquirir imágenes de alta resolución de polisomas seleccionados (véase la figura 2C). </li><li> Aplicar correcciones de software (la resta de avión y algoritmos de corrección de línea por línea) para corregir las imágenes de AFM eliminación de inclinación arbitraria y efectos a la deriva. </li></ol> 4. Análisis de Datos (30 minutos por imagen) <ol><li> Exportación de imágenes en ImageJ (opcional: aplicar un factor de escala) preferenteially utilizando un formato de compresión sin pérdidas, por ejemplo, el formato TIFF (véase la Figura 3A). </li><li> Utilice la macro RiboPick.ijm conjunto de herramientas ImageJ (a copiar en el subdirectorio macro / conjunto de herramientas ImageJ) para contar los ribosomas en polisomas (véase la Figura 3B) y calcular propiedades estadísticas de la muestra (véase la Figura 3C). <ol><li> Comenzará a cargar una imagen mediante la &lt;imagen Lee&gt; herramienta que inicia el programa. </li><li> Recoger los centros de ribosomas con la &lt;Selección de puntos&gt; estándar ImageJ herramienta (shift + clic izquierdo permite la selección múltiple de los ribosomas). Marcar los ribosomas seleccionados con el &lt;Marcar ribosomas&gt; herramienta. ribosoma coordenadas aparecerán en una ventana de texto personalizado. </li><li> Añadir más ribosomas a la misma polisomas repitiendo el procedimiento indicado en el punto 4.2.2. </li><li> Retire los ribosomas marcados erróneamente utilizando el &lt;Deshacer la última selección&gt; herramienta (comienza a eliminar de la última ribosoma añadido a la primera212; en el polisomas actual). </li><li> Cuando se haya completado la polisomas, utilice el &lt;polisomas Nueva&gt; herramienta. A medida que se añade el número de polisomas como una superposición a la imagen, se actualiza la ventana de texto. </li><li> Utilice el &lt;Guardar los resultados y cerca&gt; escribir el ribosoma coordina una imagen PNG que resume los ribosomas y polisomas el archivo elegido (se utilizan las unidades predeterminadas de la imagen) y. La imagen original se cerró sin ser salvado. </li></ol></li></ol>

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<li>Al Omran, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Imaging+of+the+Ependymal+Cilia+in+the+Lateral+Ventricles+of+the+Mouse+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain.</a> J Vis Exp. (100), e52853(2015).</li>
<li>Warner, J. R., Rich, A., Hall, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscope+studies+of+ribosomal+clusters+synthesizing+hemoglobin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Electron microscope studies of ribosomal clusters synthesizing hemoglobin.</a> Science. 138, 1399-1403 (1962).</li>
<li>Yazaki, K., Yoshida, T., Wakiyama, M., Miura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysomes+of+eukaryotic+cells+observed+by+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Electron+Microsc+%28Tokyo%29%22%5BJournal%5D)">Polysomes of eukaryotic cells observed by electron microscopy.</a> J. Electron Microsc (Tokyo). 49, 663-668 (2000).</li>
</ol>

Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos en este documento y no tienen nada que revelar.

Como la estructura del ADN fue demostrado ser de suma importancia para describir el proceso de la transcripción y la organización de la cromatina avanzada nuestra comprensión de control transcripcional de la expresión génica, es esencial para analizar la organización y estructura de polisomas para mejorar la comprensión veraz de la traducción y su regulación. Con el protocolo descrito, una densidad óptima de polisomas suavemente inmovilizados sobre una superficie plana, se obtiene adecuado p...

La síntesis de proteínas es el proceso que consume más energía en las células de 1,2. Por lo tanto, no es sorprendente que las abundancias de proteínas son controlados principalmente en la traslación en lugar de 3,4,5 nivel transcripcional. El polisomas es el componente macromolecular fundamental que convierte la información de ARNm en lecturas proteicos funcionales. Polisomas son hasta ahora reconocidos como complejos macromoleculares donde varios controles de traslación convergen 6-13. A pesar de cientos de estudios sobre la estructura del ribosoma 14- 16, los conocimientos moleculares detallados sobre la dinámica de la traducción y la topología de polisomas ha detectado un interés limitado. Como consecuencia de ello, la organización del complejo de ribonucleoproteína polisomico nativo y su efecto potencial sobre la traducción son todavía temas bien oscuros. Polisomas pueden ocultar las organizaciones ordenados y funcionales aún desconocidos, potencialmente reflejando lo nucleosomas y contro epigenéticals han representado para el campo de la transcripción. De hecho, la investigación de este intrigante hipótesis requiere de estudios adicionales y nuevos enfoques técnicos. En esta línea, las técnicas estructurales y microscopía de fuerza atómica pueden colaborar fructíferamente para desentrañar nuevos mecanismos para el control de la expresión génica, de manera similar a lo que se logró para el nucleosoma 17,18. Desde el descubrimiento del ribosoma 14-16, su estructura se ha caracterizado ampliamente en procariotas, levaduras 19,20 21 y más recientemente en humano 22, proporcionando la descripción molecular de los mecanismos en la base de la síntesis de proteínas. Polisomas se registran inicialmente en la membrana del retículo endoplasmático, formando organizaciones geométricas 2D típicos 14. Como se ha mencionado antes, polisomas asamblea no ha sido objeto de interés constante a medida que la estructura del ribosoma. En el pasado, se han estudiado polisomas esencialmente por trtécnicas ansmission EM-basa. Sólo recientemente, las técnicas de crio-EM permitieron la reconstrucción 3D de polisomas purificados a partir de sistemas de traducción in vitro 23-26, lisados ​​celulares humanos en 27 o 28 células. Estas técnicas ofrecen información más precisa acerca de la organización de ribosomas ribosoma en polisomas 23, 26-28 y una descripción molecular preliminar de las superficies de contacto de los ribosomas adyacentes en polisomas germen de trigo 24. Por lo tanto, la tomografía crio-EM permite la divulgación de las interacciones de ribosomas ribosoma con detalle molecular, pero está cargado por una extensa post-procesamiento y análisis de reconstrucción que requiere recursos computacionales pesadas para el manejo de datos. Por otra parte, para obtener el detalle molecular de las interacciones de ribosomas ribosoma, se requiere un mapa de carreteras de resuelto de los ribosomas, y este tipo de ribosoma de referencia está disponible sólo para unas pocas especies. Es importante destacar que, tomografía crio-EM no es capaz de detectar RNA libre. Therefel mineral, se requieren nuevas técnicas para entender completamente la organización de la maquinaria de traducción. Al lado de la crio-EM, AFM ha sido también empleado como una herramienta útil para obtener imágenes directas de polisomas en eucariotas inferiores 29-33 y los seres humanos 27. En comparación con EM, AFM no requiere la fijación de la muestra o el etiquetado. Además, las mediciones se pueden llevar a cabo en condiciones fisiológicas cerca de y con la posibilidad única de identificar claramente los dos ribosomas y cadenas de ARN desnudos 27. Obtención de imágenes de polisomas individuales se puede realizar de forma relativamente rápida, obteniendo miles de imágenes en nano-resolución con poco esfuerzo post-procesamiento en comparación con la extensa y pesada de post-procesamiento y análisis de la reconstrucción requerida por microscopía de crio-EM. En consecuencia, AFM manejo y análisis de datos no necesita caras estaciones de trabajo y potencia de computación de alto. Como tal, esta técnica recoge información sobre formas polysomal, características morfológicas (por ejemplo,altura, longitud y anchura), las densidades de ribosomas, la presencia de ARN libre y el número de ribosomas por polisomas 27 con un rendimiento más alto que la crio-EM. De tal manera, AFM representa un enfoque poderoso y complementario a las técnicas de EM para retratar polisomas 27. Aquí presentamos una tubería completa de purificación para el análisis de datos en la que se aplica a la imagen de AFM y analizar polisomas cerebro de ratón. El protocolo propuesto se centra en cuestiones de purificación y en la deposición precisa de polisomas sobre sustratos de mica que se utilizan para obtener imágenes de AFM. Además del análisis de partícula convencional que puede ser fácilmente realizó con el software común usado por la comunidad AFM, un plugin de ImageJ 34, llamado RiboPick, se presenta para contar el número de ribosomas por polisomas 27, 35.

<table><tbody><tr><td>Cicloheximida</td><td>Sigma</td><td>01810</td><td>Preparación de ADN lisado</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>89836</td><td>Preparación de lisado</td></tr><tr><td>Inhibidor de ARNasa RiboLock Life</td><td>technologies</td><td>EO-0381</td><td>Preparación de lisado</td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Sigma</td><td>40718</td><td>Preparación de lisado</td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma</td><td>T8532</td><td>Preparación de lisado</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>43815</td><td>Preparación de lisado</td></tr><tr><td>Desoxicolato de Sodio</td><td>Sigma</td><td>D6750</td><td>Preparación de</td></tr><tr><td>lisado Microcentrífuga&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td>Preparación de lisado Sacarosa</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>S5016</td><td>Preparación de gradiente de sacarosa</td></tr><tr><td>Ultracentrífuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima LE-80K</td><td>Centrifugación en gradiente de sacarosa</td></tr><tr><td>Rotor ultracentrífuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>SW 41 Ti</td><td>Centrifugación en gradiente de sacarosa</td></tr><tr><td>Tubo de polialómero</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td>Centrifugación en gradiente de sacarosa</td></tr><tr><td>Sistema de fraccionamiento en gradiente de densidad&nbsp;</td><td>Teledyne Isco</td><td>67-9000-176</td><td>Fraccionamiento en gradiente de sacarosa</td></tr><tr><td>AFM</td><td>Asylum Research</td><td>Cypher</td><td>Visualización de polisomas</td></tr></tbody></table>

asomándose al cerebro polisomas con microscopía de fuerza atómica

Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy

La maquinaria de traducción, es decir, el polisomas o polyribosome, es uno de los mecanismos citoplásmicos más grandes y más complejos en las células. Polisomas, formadas por los ribosomas, ARNm, varias proteínas y ARN no codificantes, representan plataformas donde los controles se llevan a cabo de traslación integrado. Sin embargo, mientras que el ribosoma se ha estudiado ampliamente, la organización de polisomas todavía falta comprensión global. Por lo tanto se requiere un gran esfuerzo con el fin de dilucidar organización polisomas y cualquier nuevo mecanismo de control de la traducción que puede ser embebido. Microscopía de fuerza atómica (AFM) es un tipo de microscopía de barrido de la sonda que permite la adquisición de imágenes en 3D con una resolución de escala nanométrica. En comparación con técnicas de microscopía electrónica (EM), una de las principales ventajas de AFM es que se puede adquirir miles de imágenes tanto en el aire y en solución, lo que permite que la muestra se mantendrá en condiciones fisiológicas cerca sin necesidad de tinción y la fijación de proprocedimientos. Aquí, se describe un protocolo detallado para la purificación exacta de polisomas de cerebro de ratón y su deposición sobre sustratos de mica. Este protocolo permite obtener imágenes polisomas en el aire y líquido con AFM y su reconstrucción como objetos tridimensionales. Complementario al crio-microscopía electrónica (crio-ME), el método propuesto puede ser utilizado convenientemente para el análisis sistemático de polisomas y el estudio de su organización.

Sacarosa perfiles polisomico gradiente de todo el cerebro de ratón Es posible purificar polisomas partir de un lisado celular por un perfil de polysomal, que separa macromoléculas de acuerdo a su peso y tamaño. Con perfiles polysomal, lisados ​​citoplásmicos obtenidos a partir de células o tejidos cultivados, como en este ejemplo, se cargan en un gradiente de sacarosa lineal y procesados ​​por ultracentrifugac...

Aunque la estructura de los ribosomas ha sido ampliamente caracterizada, la organización de los polisomas aún está poco estudiada. Para superar esta falta de conocimiento, presentamos aquí un protocolo de preparación detallado para obtener imágenes precisas de polisomas de mamíferos mediante microscopía de fuerza atómica (AFM) en aire y líquido.

Asomándose al cerebro Polisomas con microscopía de fuerza atómica

The translational machinery, i.e., the polysome or polyribosome, is one of the biggest and most complex cytoplasmic machineries in cells. Polysomes, ...

El objetivo general de este protocolo es proporcionar una metodología detallada para la purificación precisa y deposición de polirribosomas cerebrales sobre mica, y obtener miles de imágenes con resolución a escala nanométrica sin necesidad de procesamientos posteriores intensivos ni análisis de reconstrucción tridimensional. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la traducción y el control traduccional, como comprender el impacto de la organización de los ribosomas dentro de los polisomas durante la reconfiguración de la expresión génica. Las principales ventajas de esta técnica son que no requiere fijación ni marcado de la muestra, y las mediciones pueden realizarse en condiciones cercanas a las fisiológicas para identificar fácilmente los ribosomas y las cadenas de ARN desnudas.Aunque este método puede proporcionar información sobre la organización de los polirribosomas de mamíferos, también se puede aplicar a otros microorganismos, como levaduras, bacterias e insectos, así como a estados que implican controles traductivos de la expresión génica. La demostración visual de este método es fundamental, ya que el manejo de la muestra polisómica para la absorción en mica y los pasos de lavado son bastante delicados y requieren habilidad y experiencia. El procedimiento será demostrado por Paola Bernabo y Lorenzo Lunelli.Para comenzar, recolecte y congele el tejido cerebral según se describe en el protocolo de texto adjunto. Luego, retire el tejido congelado del congelador y llévelo al banco de trabajo. Coloque el tejido cerebral congelado y nitrógeno líquido en un mortero previamente enfriado y pulverícelo usando un pistilo hasta que forme un polvo.Transfiera aproximadamente 25 miligramos del polvo de cerebro a un tubo microcentrífugo frío y agregue inmediatamente 0,8 mililitros de tampón de lisis. Aspire y expulse la mezcla 25 veces rápidamente con una pipeta para romper las células. A continuación, centrifugue el tubo a 12.000 × g durante un minuto a cuatro grados Celsius para sedimentar los restos celulares.Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrifuga y mantenga el tubo en hielo durante 15 minutos. Luego, centrifugue el tubo durante cinco minutos para obtener un sedimento de núcleos y mitocondrias. A continuación, retire cuidadosamente un mililitro de la parte superior de un gradiente de sacarosa previamente preparado.Aplique gota a gota la sobrenadante del lisado citosólico sobre la solución de sacarosa. Con la muestra ahora cargada encima del gradiente, coloque cuidadosamente el tubo y un tubo contrapesado en los cubetos de un rotor de cabezal oscilante. Centrifugue el gradiente durante 100 minutos.Después de la ultracentrifugación, deje los tubos en sus cubetas durante 20 minutos a cuatro grados Celsius para permitir que el gradiente se estabilice. Luego, retire cuidadosamente el tubo de muestra y colóquelo en el dispositivo recolector de un sistema de fraccionamiento en gradiente de densidad. Recoja fracciones de un mililitro mientras monitorea la absorbancia de los ácidos nucleicos a 260 nanómetros con un detector de luz ultravioleta visible y colóquelas en hielo.A continuación, prepare alícuotas de 30-40 microlitros de las fracciones de interés y manténgalas en hielo. Si las muestras no se van a usar inmediatamente, almacénelas a 80 grados Celsius y tome medidas para limitar el número de ciclos de congelación-descongelación. Para preparar las muestras para la imagenología de microscopía de fuerza atómica (AFM), primero cubra una lámina de mica lavada con 200 microlitros de sulfato de níquel II uno milimolar e incube la lámina durante tres minutos a temperatura ambiente.Luego, retire la solución, seque la superficie con aire comprimido y coloque la placa de Petri sobre hielo. A continuación, agregue suavemente todo el alícuota de la fracción de interés, gota a gota, sobre la mica. Utilizando una punta de 100 o 200 microlitros, distribuya la muestra sobre toda la superficie de la mica e incube la muestra en hielo durante tres minutos.Luego, cubra la lámina de mica gota a gota con 200 microlitros de tampón frío AFM e incube la muestra en hielo durante una hora. Es importante mantener la muestra a 40 grados y utilizar tampón frío preparado con agua libre de RNasas para preservar la organización de los polirribosomas. Tras la incubación, retire cuidadosamente el tampón y lave la mica tres o cuatro veces con 200 microlitros de tampón frío AFM para eliminar cualquier exceso de sacarosa.Luego, lave la mica tres veces con solución de lavado fría y elimine el exceso de agua de la mica utilizando papel. La eliminación completa de la sacarosa de las muestras absorbentes es crucial ahora que ha separado tanto el ribosoma como el ARN desnudo en el polisoma. Deje que la muestra se seque bajo la campana extractora con la tapa de la placa de Petri parcialmente abierta.Después de dos horas, cierre la placa de Petri. La muestra ya puede almacenarse a temperatura ambiente. Sujete la muestra preparada al portamuestras del microscopio de fuerza atómica (AFM) utilizando cinta de doble cara.A continuación, inserte el portamuestras en la platina del microscopio de fuerza atómica (AFM) según las instrucciones del fabricante. Tras la calibración, acerque la muestra hasta que la punta del cantiléver entre en contacto con la superficie. Seleccione un área de escaneo de dos por dos micrómetros, una resolución de al menos 512 x 512 píxeles, elija el modo de sustracción de fondo en tiempo real y seleccione una escala Z de 20-25 nanómetros.A continuación, inicie la adquisición de imágenes. Inspeccione la imagen en busca de la presencia de objetos redondeados caracterizados por una altura entre 10 y 15 nanómetros al adquirir imágenes en el aire. Ajuste luego el punto de ajuste y los parámetros de retroalimentación hasta que se visualicen objetos nítidos.El fondo debe aparecer relativamente plano en muestras buenas, con algunos objetos de entre dos y cuatro nanómetros de altura. Una vez que la imagen se vea adecuada, adquiera varias escaneos de dos por dos micrones en diferentes áreas de la muestra. Después de la deposición de alícuotas de sacarosa sobre mica, la microscopía de fuerza atómica (AFM) proporciona descripciones precisas del tamaño de polisomas individuales que aparecen como agrupaciones de ribosomas estrechamente empaquetados.Al examinar más de cerca uno de los picos ribosomales mediante análisis de sección transversal, se revela que la altura de los picos ribosomales es de aproximadamente 14 nanómetros. Esto coincide con lo observado previamente para ribosomas y polisomas humanos después del secado al aire. En la imagen de la derecha, se utilizó un macro para identificar la ubicación de los ribosomas y marcar cada ribosoma con un círculo rojo.Utilizando esta información, se puede analizar la distribución de frecuencias del número de ribosomas por polisoma. Esta distribución experimental se ajustó a una curva gaussiana centrada en 5,8 ribosomas por polisoma, con una desviación estándar de 1,3. Una vez dominada, esta técnica, desde la pulverización del tejido cerebral hasta la adquisición de imágenes de polirribosomas, puede realizarse en menos de ocho horas si se lleva a cabo correctamente.Al realizar este procedimiento, es importante recordar mantener la muestra en hielo y usar tampones fríos para la deposición de la muestra sobre la mica. Siguiendo este procedimiento y utilizando el complemento de ImageJ de un desarrollador para que esté disponible en su artículo, puede contar con precisión el número de ribosomas por polisoma. Tras cada desarrollo, esta técnica allanará el camino para comprender la cinética de formación de polisomas y para identificar los cambios en la organización de los polisomas y sus diferentes condiciones celulares o tisulares.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo obtener miles de imágenes de polisomas para analizar y estudiar sistemáticamente su organización.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Source: Williams, S. M. et al. Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates tapping-mode AFM to visualize phage–antigen interactions on a mica surface. It outlines the steps for antigen immobilization, phage binding, and high-resolution nanoscale imaging.

Atomic Force Microscopy to Visualize Phage–Antigen Interactions

En este video, demostramos la microscopía estática de fuerza atómica para visualizar nucleosomas ensamblados. Esta técnica de imagen de alta resolución permite el estudio de la estructura del nucleosoma.

Microscopía estática de fuerza atómica para visualizar y caracterizar nucleosomas ensamblados

Fuente: Lunelli, L., et. al. Observando los polisomas cerebrales con microscopía de fuerza atómica. J. Vis. Exp.(2016). Este video muestra la obtención de imágenes de polisomas utilizando microscopía de fuerza atómica. Una lámina de mica recubierta de iones de níquel ancla el ARN con ribosomas unidos. La muestra se lava, se seca y se monta en la platina del microscopio. La punta en voladizo escanea la superficie de la muestra, registrando las desviaciones del láser para mapear la topología. El...

 Obtención de imágenes de polisomas aislados del cerebro de un ratón mediante microscopía de fuerza atómica

Aquí, se describe un método para analizar los cambios en la iniciación de la traducción de ARNm de células eucariotas en respuesta a condiciones de estrés. Este método se basa en la separación de velocidad en gradientes de sacarosa de la traducción de los ribosomas de los ribosomas no traducir.

Análisis de la Traducción Iniciación Durante condiciones de estrés por polisoma Profiling

En este artículo se describe un método para investigar la estructura de un fotorreceptor de proteína utilizando microscopía de fuerza atómica (AFM). El mapeo de propiedades nanomecánicas cuantitativas de PeakForce (PF-QNM) revela dímeros de proteínas intactos en una superficie de mica.

Microscopía de Fuerza Atómica de Red-Light fotorreceptores a través de cartografía PeakForce cuantitativa nanomecánico Propiedad

Se describen los procedimientos y estrategias para medir las propiedades mecánicas y las vías despliegue mecánicas de las moléculas de proteína sola utilizando un microscopio de fuerza atómica. También mostramos resultados representativos como referencia para la selección y justificación de las grabaciones de molécula única de proteína buena.

Espectroscopia de la fuerza de las moléculas de proteína sola utilizando un microscopio de fuerza atómica

Aquí, presentamos un protocolo para caracterizar partículas nucleosoma en el nivel de una sola molécula mediante microscopía de fuerza atómica estática y Time-lapse (AFM) técnicas de imagen. El método de funcionalización de superficies descrito permite la captura de la estructura y la dinámica de los nucleosomas en alta resolución a escala nanométrica.

Sondear la estructura y dinámica de nucleosomas utilizando imágenes de microscopía de fuerza atómica

Presentamos un protocolo para funcionalizar los voladizos del microscopio de fuerza atómica (AFM) con una sola célula T y partícula de cuentas para estudios inmunológicos. Se muestran los procedimientos para sondear la unión de células T de un solo par por AFM y para monitorear la respuesta celular en tiempo real de los macrófagos a una sola partícula sólida por AFM con imágenes de fluorescencia.

Funcionalización de voladizos de microscopio de fuerza atómica con células de una t o de una sola partícula para espectroscopia de fuerza de una sola célula inmunológica

El desarrollo del cerebro de los mamíferos requiere un control adecuado de la expresión génica a nivel de traducción. Aquí, describimos un sistema de perfilado de polisoma con una plataforma de degradado y fraccionamiento de sacarosa fácil de ensamblar para evaluar el estado traslacional de los ARNM en el cerebro en desarrollo.

Análisis de la traducción en el cerebro del ratón en desarrollo utilizando perfiles de polisoma

Este protocolo describe cómo generar un perfil de polisoma sin utilizar generadores de gradiente automatizados o sistemas de fraccionamiento de gradiente.

Perfilado de polisomas sin fabricantes de gradiente ni sistemas de fraccionamiento

En este artículo, presentamos un protocolo para detectar oligodendrocitos cargados de microtúbulos en un modelo de tubulinopatía a través de un enfoque simple e innovador de microscopía de segunda generación armónica.

Óptica no lineal sin etiquetas para el estudio de defectos dependientes de tubulina en mielina central

Aprende a purificar y visualizar polirribosomas cerebrales mediante microscopía de fuerza atómica sin fijación ni marcado. Este método permite estudiar la organización ribosomal en condiciones fisiológicas con resolución nanométrica.

Asomándose al cerebro Polisomas con microscopía de fuerza atómica

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