Asomándose al cerebro Polisomas con microscopía de fuerza atómica

El objetivo general de este protocolo es proporcionar una tubería detallada para la purificación y deposición precisas de polirribosomas cerebrales en mica y obtener miles de imágenes a resolución a nanoescala sin la necesidad de un pesado procesamiento posterior o análisis de reconstrucción en 3D. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la traducción y el control traslacional, como la comprensión del impacto de la organización de los ribosomas dentro de los polisomas durante el recableado de la expresión génica. Las principales ventajas de esta técnica son que no se requiere fijación ni etiquetado de la muestra, y las mediciones se pueden realizar en condiciones casi fisiológicas para identificar fácilmente los ribosomas y los soportes de ARN desnudos.

Aunque este método puede proporcionar información sobre la organización del polirribosoma de los mamíferos, también se puede aplicar a otros microorganismos, como levaduras, bacterias e insectos, así como a los controles de traducción de la expresión génica. La demostración visual de este método es fundamental, ya que el manejo de la muestra polisomal para la absorción de mica y los pasos de lavado son bastante complicados y requieren habilidades y experiencia en el manejo. Los encargados de demostrar el procedimiento serán Paola Bernabo y Lorenzo Lunelli.

Para comenzar, recoja y congele el tejido cerebral como se describe en el protocolo de texto adjunto. Luego, saca el pañuelo congelado del congelador y llévalo al banco. Coloque el tejido cerebral congelado y el nitrógeno líquido en un mortero previamente enfriado y pulverize con un mortero hasta que se forme un polvo.

Transfiera unos 25 miligramos de polvo cerebral a un tubo de microcentrífuga fría e inmediatamente agregue 0,8 mililitros de tampón de lisis. Pipetea la mezcla hacia arriba y hacia abajo 25 veces rápidamente para romper las células. A continuación, centrifuga el tubo a 12.000 x g durante un minuto a cuatro grados centígrados para pellet los restos celulares.

Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga y mantenga el tubo en hielo durante 15 minutos. Luego, centrifuga el tubo durante cinco minutos para granular núcleos y mitocondrias. A continuación, retire con cuidado un mililitro de la parte superior de un degradado de sacarosa previamente preparado.

Superponer la sacarosa gota a gota con el sobrenadante del lisado citosólico. Con la muestra ahora cargada en la parte superior del gradiente, baje con cuidado el tubo y un tubo de contrapeso en los cubos de un rotor de cangilón oscilante. Centrifugar el degradado durante 100 minutos.

Después de la ultracentrifugación, deje los tubos en sus cubos durante 20 minutos a cuatro grados centígrados, para que el gradiente se estabilice. Luego, retire con cuidado el tubo de muestra y móntelo en el dispositivo colector de un sistema de fraccionamiento de gradiente de densidad. Recoja fracciones de un mililitro mientras monitorea la absorbancia de ácidos nucleicos a 260 nanómetros con un detector de luz visible UV y colóquelas en hielo.

A continuación, prepare 30-40 alícuotas de microlitros de las fracciones de interés y manténgalas en hielo. Si las muestras no se van a usar de inmediato, guárdelas a 80 grados centígrados y tome medidas para limitar el número de ciclos de congelación y descongelación. Para preparar muestras para la obtención de imágenes de AFM, primero cubra una lámina de mica lavada con 200 microlitros de un milimolar de sulfato de níquel ii e incube la lámina durante tres minutos a temperatura ambiente.

Luego retire la solución, seque la superficie con aire comprimido y coloque la placa de Petri sobre hielo. A continuación, agregue suavemente toda la alícuota de la fracción de interés gota a gota sobre la mica. Con una punta de 100 o 200 microlitros, extienda la muestra por toda la superficie de la mica e incube la muestra en hielo durante tres minutos.

A continuación, cubra la lámina de mica gota a gota con 200 microlitros de tampón frío AFM e incube la muestra en hielo durante una hora. El mantenimiento de la muestra a 40 grados y el uso de tampón frío que se prepararon en agua libre de ARNasa son importantes para preservar la organización del polirribosoma. Después de la incubación, retire con cuidado el tampón y lave la mica tres o cuatro veces con 200 microlitros de tampón frío AFM para eliminar el exceso de sacarosa.

Luego, lave la mica tres veces con una solución de lavado fría y escurra el exceso de agua de la mica con papel. La eliminación completa de la sacarosa de las muestras absorbentes es crucial ahora que se han cortado tanto el ribosoma como el ARN desnudo en el polisoma. Deje que la muestra se seque bajo la cubierta química con la parte superior de la placa de Petri parcialmente abierta.

Después de dos horas, cierre la placa de Petri. La muestra ahora se puede almacenar a temperatura ambiente. Fije la muestra preparada al portamuestras del AFM con cinta adhesiva de doble cara.

A continuación, inserte el portamuestras en la platina AFM de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de la calibración, acerque la muestra hasta que la punta del voladizo se enganche con la superficie. Seleccione un área de escaneo de dos por dos micras, una resolución de al menos 512 x 512 píxeles, elija el modo de sustracción de fondo en vivo y seleccione una escala Z de 20-25 nanómetros.

A continuación, comience la adquisición de imágenes. Inspeccionar la imagen, buscando la presencia de objetos redondos caracterizados por una altura entre 10 y 15 nanómetros al adquirir imágenes en el aire. A continuación, ajuste el punto de ajuste y los parámetros de retroalimentación hasta que se visualicen objetos nítidos.

El fondo debe aparecer relativamente plano en buenas muestras con objetos de dos a cuatro nanómetros de altura. Una vez que la imagen se vea bien, adquiera varios escaneos de dos por dos micras en diferentes áreas de muestra. Después de la deposición de alícuotas de sacarosa en la mica, AFM proporciona descripciones precisas del tamaño de polisomas individuales que aparecen como grupos de ribosomas muy compactos.

Si se observa más de cerca uno de los picos ribosómicos mediante el análisis de la sección transversal, se revela que la altura de los picos ribosómicos es de alrededor de 14 nanómetros. Esto coincide con lo que se observó anteriormente para los ribosomas y polisomas humanos después del secado al aire. En la imagen de la derecha, se utilizó una macro para identificar la ubicación del ribosoma y marcar cada ribosoma con un círculo rojo.

Con esta información, se puede analizar la distribución de frecuencia del número de ribosomas por polisoma. Esta distribución experimental se ajustó con una curva gaussiana centrada en 5,8 ribosomas por polisoma, con una desviación estándar de 1,3. Una vez dominada, esta técnica, desde la pulverización cerebral hasta la adquisición de imágenes de polirribosomas, se puede realizar en menos de ocho horas si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener la muestra en hielo y usar tampones fríos para la deposición de la muestra en la mica. Siguiendo este procedimiento, y utilizando el plugin ImageJ de un revelador para ponerlo a disposición en su artículo, puede contar con precisión el número de ribosomas por polisoma. Después de cada desarrollo, esta técnica allanará el camino para comprender la cinética de la formación de polisomas e identificar los cambios en la organización de los polisomas y sus diferentes condiciones celulares o tisulares.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo obtener miles de imágenes de polisomas para analizar y estudiar sistemáticamente su organización.