Asomándose al cerebro Polisomas con microscopía de fuerza atómica

El objetivo general de este protocolo es proporcionar una metodología detallada para la purificación precisa y deposición de polirribosomas cerebrales sobre mica, y obtener miles de imágenes con resolución a escala nanométrica sin necesidad de procesamientos posteriores intensivos ni análisis de reconstrucción tridimensional. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la traducción y el control traduccional, como comprender el impacto de la organización de los ribosomas dentro de los polisomas durante la reconfiguración de la expresión génica. Las principales ventajas de esta técnica son que no requiere fijación ni marcado de la muestra, y las mediciones pueden realizarse en condiciones cercanas a las fisiológicas para identificar fácilmente los ribosomas y las cadenas de ARN desnudas.

Aunque este método puede proporcionar información sobre la organización de los polirribosomas de mamíferos, también se puede aplicar a otros microorganismos, como levaduras, bacterias e insectos, así como a estados que implican controles traductivos de la expresión génica. La demostración visual de este método es fundamental, ya que el manejo de la muestra polisómica para la absorción en mica y los pasos de lavado son bastante delicados y requieren habilidad y experiencia. El procedimiento será demostrado por Paola Bernabo y Lorenzo Lunelli.

Para comenzar, recolecte y congele el tejido cerebral según se describe en el protocolo de texto adjunto. Luego, retire el tejido congelado del congelador y llévelo al banco de trabajo. Coloque el tejido cerebral congelado y nitrógeno líquido en un mortero previamente enfriado y pulverícelo usando un pistilo hasta que forme un polvo.

Transfiera aproximadamente 25 miligramos del polvo de cerebro a un tubo microcentrífugo frío y agregue inmediatamente 0,8 mililitros de tampón de lisis. Aspire y expulse la mezcla 25 veces rápidamente con una pipeta para romper las células. A continuación, centrifugue el tubo a 12.000 × g durante un minuto a cuatro grados Celsius para sedimentar los restos celulares.

Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrifuga y mantenga el tubo en hielo durante 15 minutos. Luego, centrifugue el tubo durante cinco minutos para obtener un sedimento de núcleos y mitocondrias. A continuación, retire cuidadosamente un mililitro de la parte superior de un gradiente de sacarosa previamente preparado.

Aplique gota a gota la sobrenadante del lisado citosólico sobre la solución de sacarosa. Con la muestra ahora cargada encima del gradiente, coloque cuidadosamente el tubo y un tubo contrapesado en los cubetos de un rotor de cabezal oscilante. Centrifugue el gradiente durante 100 minutos.

Después de la ultracentrifugación, deje los tubos en sus cubetas durante 20 minutos a cuatro grados Celsius para permitir que el gradiente se estabilice. Luego, retire cuidadosamente el tubo de muestra y colóquelo en el dispositivo recolector de un sistema de fraccionamiento en gradiente de densidad. Recoja fracciones de un mililitro mientras monitorea la absorbancia de los ácidos nucleicos a 260 nanómetros con un detector de luz ultravioleta visible y colóquelas en hielo.

A continuación, prepare alícuotas de 30-40 microlitros de las fracciones de interés y manténgalas en hielo. Si las muestras no se van a usar inmediatamente, almacénelas a 80 grados Celsius y tome medidas para limitar el número de ciclos de congelación-descongelación. Para preparar las muestras para la imagenología de microscopía de fuerza atómica (AFM), primero cubra una lámina de mica lavada con 200 microlitros de sulfato de níquel II uno milimolar e incube la lámina durante tres minutos a temperatura ambiente.

Luego, retire la solución, seque la superficie con aire comprimido y coloque la placa de Petri sobre hielo. A continuación, agregue suavemente todo el alícuota de la fracción de interés, gota a gota, sobre la mica. Utilizando una punta de 100 o 200 microlitros, distribuya la muestra sobre toda la superficie de la mica e incube la muestra en hielo durante tres minutos.

Luego, cubra la lámina de mica gota a gota con 200 microlitros de tampón frío AFM e incube la muestra en hielo durante una hora. Es importante mantener la muestra a 40 grados y utilizar tampón frío preparado con agua libre de RNasas para preservar la organización de los polirribosomas. Tras la incubación, retire cuidadosamente el tampón y lave la mica tres o cuatro veces con 200 microlitros de tampón frío AFM para eliminar cualquier exceso de sacarosa.

Luego, lave la mica tres veces con solución de lavado fría y elimine el exceso de agua de la mica utilizando papel. La eliminación completa de la sacarosa de las muestras absorbentes es crucial ahora que ha separado tanto el ribosoma como el ARN desnudo en el polisoma. Deje que la muestra se seque bajo la campana extractora con la tapa de la placa de Petri parcialmente abierta.

Después de dos horas, cierre la placa de Petri. La muestra ya puede almacenarse a temperatura ambiente. Sujete la muestra preparada al portamuestras del microscopio de fuerza atómica (AFM) utilizando cinta de doble cara.

A continuación, inserte el portamuestras en la platina del microscopio de fuerza atómica (AFM) según las instrucciones del fabricante. Tras la calibración, acerque la muestra hasta que la punta del cantiléver entre en contacto con la superficie. Seleccione un área de escaneo de dos por dos micrómetros, una resolución de al menos 512 x 512 píxeles, elija el modo de sustracción de fondo en tiempo real y seleccione una escala Z de 20-25 nanómetros.

A continuación, inicie la adquisición de imágenes. Inspeccione la imagen en busca de la presencia de objetos redondeados caracterizados por una altura entre 10 y 15 nanómetros al adquirir imágenes en el aire. Ajuste luego el punto de ajuste y los parámetros de retroalimentación hasta que se visualicen objetos nítidos.

El fondo debe aparecer relativamente plano en muestras buenas, con algunos objetos de entre dos y cuatro nanómetros de altura. Una vez que la imagen se vea adecuada, adquiera varias escaneos de dos por dos micrones en diferentes áreas de la muestra. Después de la deposición de alícuotas de sacarosa sobre mica, la microscopía de fuerza atómica (AFM) proporciona descripciones precisas del tamaño de polisomas individuales que aparecen como agrupaciones de ribosomas estrechamente empaquetados.

Al examinar más de cerca uno de los picos ribosomales mediante análisis de sección transversal, se revela que la altura de los picos ribosomales es de aproximadamente 14 nanómetros. Esto coincide con lo observado previamente para ribosomas y polisomas humanos después del secado al aire. En la imagen de la derecha, se utilizó un macro para identificar la ubicación de los ribosomas y marcar cada ribosoma con un círculo rojo.

Utilizando esta información, se puede analizar la distribución de frecuencias del número de ribosomas por polisoma. Esta distribución experimental se ajustó a una curva gaussiana centrada en 5,8 ribosomas por polisoma, con una desviación estándar de 1,3. Una vez dominada, esta técnica, desde la pulverización del tejido cerebral hasta la adquisición de imágenes de polirribosomas, puede realizarse en menos de ocho horas si se lleva a cabo correctamente.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar mantener la muestra en hielo y usar tampones fríos para la deposición de la muestra sobre la mica. Siguiendo este procedimiento y utilizando el complemento de ImageJ de un desarrollador para que esté disponible en su artículo, puede contar con precisión el número de ribosomas por polisoma. Tras cada desarrollo, esta técnica allanará el camino para comprender la cinética de formación de polisomas y para identificar los cambios en la organización de los polisomas y sus diferentes condiciones celulares o tisulares.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo obtener miles de imágenes de polisomas para analizar y estudiar sistemáticamente su organización.