Calcificación de células del músculo liso y de imagen de la calcificación aórtica y la inflamación

El objetivo general de este procedimiento es visualizar la calcificación vascular aórtica ex vivo y modelar in vivo la calcificación vascular utilizando células musculares lisas aórticas primarias cultivadas de ratón. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología de las enfermedades vasculares al proporcionar un modelo in vitro para estudiar los mecanismos moleculares de la calcificación vascular y permitir la evaluación de la calcificación vascular y la inflamación de macrófagos in vivo. La principal ventaja de esta técnica es que permite la cuantificación sensible y la co-localización de la actividad de macrófagos con depósitos de calcio en lesiones ateroscleróticas, incluso en etapas tempranas de la enfermedad.

Además de Caitlin y yo, Robert Tainsh, un técnico en nuestro laboratorio, demostrará este procedimiento. Para comenzar este procedimiento, desinfecte la cola con una torunda de alcohol y localice las venas de la cola en posición lateral. A continuación, aplique una ligera presión hacia adelante sobre la jeringa mientras se introduce una aguja de calibre 30 en la cola sin encontrar resistencia.

Luego, inyecte 100 microlitros de calcio NIR y/o 100 microlitros de cathepsina NIR a un ritmo constante. Retire la aguja después de cinco segundos y recoja las aortas entre tres y 24 horas después de la inyección. Bajo un microscopio estereoscópico, elimine el peritoneo para exponer los órganos abdominales.

Posteriormente, retire los órganos gastrointestinales teniendo cuidado de no seccionar la aorta. A continuación, realice una incisión lateral en el diafragma anterior y continúe la incisión a través del abdomen. Utilizando tijeras de disección, libere la caja torácica cortando por los lados de las costillas y eliminando el tejido blando adherido a la porción superior del esternón.

Luego, retire la caja torácica y exponga los pulmones. Retire cuidadosamente los pulmones. A continuación, retire la tráquea y el esófago con cuidado, asegurándose de que la aorta permanezca intacta.

Posteriormente, retire el tejido blando que rodea la aorta desde la bifurcación ilíaca hasta el arco aórtico. Tenga cuidado al eliminar la grasa periaórtica. Después de eso, retire la grasa restante y el tejido blando que rodea la aorta torácica y las grandes ramas del arco aórtico.

A continuación, retire el timo. Ahora retire el corazón de la cavidad torácica separándolo cuidadosamente de la aorta proximal. Luego, seccione la aorta distal en la bifurcación ilíaca.

Mediante una aguja de insulina, inyecte solución salina normal en la aorta desde el arco aórtico para lavar las células sanguíneas restantes. Separe la aorta junto con los vasos del arco aórtico y extráigala completamente del cuerpo. Coloque la aorta en solución salina normal sobre hielo hasta que esté lista para la obtención de imágenes.

En este paso, coloque las aortas en HBSS frío hasta que las disecciones estén completas. En una campana de cultivo celular estéril, transfiera las aortas a la solución de digestión aórtica en las placas de cultivo celular de 35 x 10 milímetros. Luego, incúbelas a 37 grados Celsius durante 30 minutos con agitación intermitente suave.

Después de la digestión, las aortas deben presentar un aspecto estirado o deshilachado. Bajo un microscopio de disección, retire la capa adventicia externa de una aorta manteniendo intacta la capa media. Para ello, desprenda la capa externa de la aorta en un extremo y retírela de la capa media subyacente como si fuera un calcetín.

Una vez que se haya eliminado la capa adventicia, incubar la aorta restante en un nuevo recipiente de cultivo con medio de cultivo celular a 37 grados Celsius durante dos a cuatro horas. Posteriormente, cortar la aorta en anillos de uno a dos milímetros de ancho. Transferir los anillos a un nuevo recipiente de cultivo tisular con solución de digestión aórtica e incubar a 37 grados Celsius con agitación intermitente suave durante 120 minutos.

Durante la incubación, pipetee la solución hacia arriba y hacia abajo varias veces para resuspender las células. Posteriormente, agregue cinco mililitros de medio de cultivo celular tibio a la solución de digestión y transfiera la mezcla a un tubo cónico de 15 mililitros. Centrifugue el tubo durante cinco minutos a 200 ×g. Luego aspire el medio y resuspenda las células en el volumen deseado de medio de cultivo celular.

Para inducir la calcificación en células musculares lisas vasculares, transfiera las células a una placa de cultivo de seis pocillos y permita que se adhieran. A continuación, cambie el medio a medio de calcificación. Incube las células a 37 grados Celsius durante al menos siete días.

A continuación, aspire el medio del plato de cultivo celular. Lave las células una vez con agua ionizada. Fije las células colocándolas en un mililitro de formalina al 10% a temperatura ambiente durante 20 minutos.

Luego, retire el formaldehído y lave las células fijadas con agua destilada durante cinco minutos. A continuación, incube las células en un mililitro de solución al 5% de nitrato de plata bajo una bombilla de 60 a 100 vatios durante una a dos horas. Posteriormente, aspire la solución de nitrato de plata y lave con agua destilada durante cinco minutos.

Después de cinco minutos, elimine la plata no reaccionada colocando las células en un mililitro de solución al 5% de tiosulfato de sodio en agua destilada durante cinco minutos. Posteriormente, enjuague las células con agua destilada durante cinco minutos. Las células teñidas con von Kossa ya están listas para su observación mediante microscopía óptica invertida estándar.

En esta figura, ratones silvestres knockout para MGP y ratones knockout para LDLR fueron inyectados con calcio NIR y cathepsina NIR mediante inyección en la vena caudal, y las aortas se recolectaron 24 horas después y se evaluaron mediante imágenes de fluorescencia NIR. Los ratones silvestres muestran prácticamente ninguna calcificación aórtica ni presencia de macrófagos. Las aortas de los ratones knockout para LDLR presentan una calcificación extensa que se co-localiza con la acumulación de macrófagos.

En contraste, los ratones knockout de MGP presentan calcificación aórtica que ocurre en ausencia de infiltración de macrófagos. En este experimento, las células musculares lisas vasculares aórticas cultivadas se aislaron de ratones knockout de MGP y se infectaron con adenovirus que expresaban GFP o MGP. Las células musculares lisas vasculares aórticas aisladas de ratones de tipo silvestre se transfectaron con siRNA de control aleatorizado o con siRNA dirigido contra MGP.

Las células se cultivaron en medio de calcificación A durante siete días y posteriormente se fijaron y tiñeron con von Kossa. La tinción de calcio se cuantificó utilizando el software ImageJ tras la sustracción del fondo. Tras su desarrollo, estas técnicas han permitido a los científicos obtener imágenes de aterosclerosis y calcificación vascular ex vivo.

Y para modelar la calcificación vascular in vitro. Esto abre la posibilidad de probar los efectos de nuevos tratamientos farmacológicos sobre la enfermedad vascular. Después de ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo aislar aortas en células primarias de músculo liso vascular aórtico murino, visualizar placas ateroscleróticas mediante el uso de sondas de imagen fluorescente en el infrarrojo cercano y músculos lisos vasculares calcificados in vitro.