Desarrollo de un Modelo Organotípicos multicelular tridimensional de la mucosa intestinal humanas cultivadas en condiciones de microgravedad

El objetivo general de este procedimiento es describir el desarrollo de un modelo organotípico multicelular en 3D de la mucosa intestinal humana cultivada en microgravedad proporcionada por biorreactores de recipientes de pared giratoria. Este método tiene un amplio potencial como herramienta para el descubrimiento tanto en la salud como en la enfermedad. Incluyendo las interacciones con patógenos, el tráfico de antígenos y los procesos inflamatorios.

Las principales ventajas de esta técnica son la imitación de la diversidad fenotípica del gato y el uso de los biorreactores de recipiente D-12 que permiten una difusión eficiente de nutrientes y oxígeno. Comience desenroscando la tapa del puerto de llenado del recipiente de cultivo y agregue 50 mililitros de nuestro PMI. Una vez que el recipiente esté lleno, vuelva a colocar la tapa y limpie cualquier medio derramado con etanol al 70%.

Deje que el recipiente se incube durante al menos 15 minutos o toda la noche a temperatura ambiente. Cuando esté listo para continuar, use el puerto de llenado para desechar el medio de cultivo y agregue 30 mililitros del medio de cultivo 3D al recipiente. Vuelva a colocar la tapa en el puerto de llenado y, nuevamente, limpie cualquier medio derramado con etanol al 70%.

Retire de la incubadora los matraces cercanos a confluentes que contengan células endoteliales de la vena umbilical humana y fibroblastos colónicos humanos y lávelos dos veces con PBS. A continuación, separe las células cubriéndolas con una solución de tripsina al 0,25 % con EDTA al 0,05 % de tripsina. Una vez que las células se desprenden, recójalas en un tubo de 50 mililitros precargado con 30 mililitros de DMEM que contenga un 30% de FBS.

Centrifugar el tubo durante 10 minutos para granular las células. A continuación, vuelva a suspender las células en 30 mililitros de DMEM que contengan un 30% de FBS. A continuación, diluye 20 microlitros de las células resuspendidas con 20 microlitros de tinte azul de tripano.

Cargue el hemocitómetro con la mezcla de células y cuente la concentración de células viables. Luego, vuelva a suspender cada tipo de celda a 50 a 80 millones de celdas por mililitro en DMEM que contenga 30% de FBS. Primero, coloque el número apropiado de insertos de cultivo en los pocillos de una placa de seis pocillos.

A continuación, prepare la mezcla de colágeno añadiendo primero 10x DMEM, 10x Reconstitution Media, 200 milimolares de L-glutamina y FBS inactivado por calor a un tubo cónico de 50 mililitros. Luego agregue colágeno bovino tipo uno, laminina, colágeno tipo cuatro, fibronectina, proteoglicano de sulfato de heparina y finalmente agregue hidróxido de sodio para neutralizar el pH de la solución. Si en algún momento la mezcla desarrolla un aspecto ácido de color amarillento, agregue unas gotas de hidróxido de sodio normal estéril 1 para neutralizar la mezcla.

Cierre el tubo y mezcle la solución invirtiéndolo varias veces evitando la formación de burbujas. Cuando no esté mezclando, mantenga la solución en hielo para evitar que se polimerice. Una vez mezclados, agregue las suspensiones celulares a la preparación de colágeno y mezcle los tubos invirtiendo suavemente los tubos varias veces para evitar la formación de burbujas.

Luego colóquelos nuevamente en el hielo. Agregue de cuatro a cinco mililitros de la solución de colágeno que contiene células en cada inserto y deje que el colágeno se gelifique en la capucha con poco o ningún movimiento durante una hora. Después de una hora, transfiera la placa de seis pocillos a una incubadora durante una o dos horas adicionales.

A continuación, vuelva a colocar la placa en la campana de cultivo de tejidos y utilice un par de pinzas estériles y un bisturí para cortar asépticamente la membrana del inserto. Separe la célula que contiene el gel de la membrana y luego corte el gel desprendido en cuadrados pequeños. Agregue la celda pequeña que contiene cuadrados de colágeno en uno de los recipientes precargados de 50 mililitros usando el puerto de llenado.

A continuación, prepare una suspensión de células epiteliales humanas HCT-8 como se describe en el protocolo de texto adjunto. Vuelva a suspender las células a una concentración de 10 millones de células por mililitro en DMEM que contenga 30% de FBS. A continuación, añada un mililitro de la suspensión de la célula HCT-8 en el recipiente de 50 mililitros utilizando su puerto de llenado.

Después de agregar las células, agregue 20 mililitros adicionales de medio de cultivo 3D en el recipiente para que esté casi lleno. Vuelva a colocar la tapa y humedezca el borde del orificio de llenado con etanol al 70%. A continuación, coloque una jeringa de cinco mililitros que contenga de tres a cuatro mililitros de medio de cultivo 3D en un puerto del recipiente y una jeringa vacía de cinco mililitros en el otro puerto.

Elimine las burbujas visibles tirando de la jeringa vacía mientras se inyecta aproximadamente el mismo volumen de medio a través de la otra jeringa en el recipiente. Con todo el aire ahora eliminado, coloque los recipientes en el biorreactor, encienda la alimentación y establezca la velocidad en 13 a 14 rotaciones por minuto. Ajuste la velocidad según sea necesario para evitar que las células entren en contacto con las paredes del vaso.

Cultive las células en microgravedad y cambie el medio de cultivo cada tres o cuatro días. Para cambiar el medio, use el método de jeringa doble para reemplazar aproximadamente 30 mililitros del medio usado con medio de cultivo 3D nuevo. Después de tres a cinco días en cultivo, aísle las células mononucleares de sangre periférica como se describe en el protocolo de texto adjunto.

A continuación, retire el recipiente del biorreactor y añada aproximadamente 20 millones de células formadas por linfocitos y monocitos a los recipientes a través del puerto de llenado. Vuelva a colocar los recipientes en el biorreactor y cultive durante cuatro a seis días adicionales. Alrededor del noveno día del cultivo, agregue 20 millones de células adicionales que consisten en linfocitos y monocitos en el vaso y continúe los cultivos durante un máximo de 12 días adicionales.

Al final del experimento, use una pipeta de transferencia para recolectar cada pequeño fragmento de gel, ahora llamado constructo, y colóquelos en los pocillos de una placa de seis pocillos que contiene 10 mililitros de tampón de formalina al 10%. Fije los constructos durante tres horas a temperatura ambiente y luego proceda con los protocolos estándar de inclusión histológica, seccionamiento y tinción. Los métodos presentados en este video producen un modelo organotípico multicelular en 3D de la mucosa intestinal humana.

En el cultivo en microgravedad, las células se diferencian bien y forman características ordenadas, parecidas a vellosidades, hacia el día 20. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en seis horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe seguir las buenas pautas de cultivo celular.

Es crucial controlar sistemáticamente la viabilidad de las células, la contaminación por micoplasmas y los cambios en el comportamiento del crecimiento celular. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la inmunohistoquímica para identificar marcadores de linaje y diferenciación celular. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo desarrollar un modelo organotípico 3D multicelular de la mucosa intestinal humana cultivada en microgravedad.