Desarrollo de un Modelo Organotípicos multicelular tridimensional de la mucosa intestinal humanas cultivadas en condiciones de microgravedad
25 de julio de 2016
Las células que crecen en un entorno tridimensional (3-D) representan una mejora marcada sobre el cultivo de células en entornos 2-D (por ejemplo, frascos o platos). Aquí se describe el desarrollo de un modelo organotípico 3-D multicelular de la mucosa intestinal humana cultivadas en microgravedad proporcionada por la rotación de la pared de los vasos biorreactores (RWV).
El objetivo general de este procedimiento es describir el desarrollo de un modelo organotípico tridimensional multicitónico de la mucosa intestinal humana cultivado bajo microgravedad proporcionada por biorreactores de pared rotatoria. Este método tiene un amplio potencial como herramienta para el descubrimiento tanto en salud como en enfermedad, incluyendo interacciones con patógenos, el tráfico de antígenos y los procesos inflamatorios.
Las principales ventajas de esta técnica son la imitación de la diversidad fenotípica del gato y el uso de los biorreactores de vaso D-12 que permiten una difusión eficiente de nutrientes y oxígeno. Comience desatornillando la tapa del puerto de llenado del vaso de cultivo y agregue 50 mililitros de nuestro PMI. Una vez que el vaso esté lleno, reemplace la tapa y limpie cualquier medio derramado con etanol al 70%.
Deje que el recipiente se incube durante al menos 15 minutos hasta toda la noche a temperatura ambiente. Cuando esté listo para continuar, use el puerto de llenado para desechar el medio de cultivo y agregue 30 mililitros del medio de cultivo 3-D al recipiente. Vuelva a colocar la tapa en el puerto de llenado y nuevamente, limpie cualquier derrame de medio con etanol al 70%.
Retire los frascos casi confluentes que contienen células endoteliales de vena umbilical humana y fibroblastos cólicos humanos del incubador y lávenlos dos veces con PBS. Luego, desprenda las células cubriéndolas con una solución de tripsina al 0,25 % con EDTA al 0,05 %. Una vez que las células se hayan desprendido, recójanlas en un tubo de 50 mililitros previamente cargado con 30 mililitros de DMEM que contenga 30 % de FBS.
Centrifugar el tubo durante 10 minutos para formar el pellet celular. Luego, re-suspender las células en 30 mililitros de DMEM que contenga 30% de FBS. A continuación, diluir 20 microlitros de las células re-suspendidas con 20 microlitros de colorante azul de tripano.
Cargue el hemocitómetro con la mezcla de células y cuente la concentración de células viables. Luego, re-suspenda cada tipo celular a 50-80 millones de células por mililitro en DMEM que contenga 30% de FBS. Primero, coloque el número adecuado de insertos de cultivo en los pocillos de una placa de seis pocillos.
A continuación, prepare la mezcla de colágeno añadiendo primero DMEM 10x, medio de reconstitución 10x, L-glutamina 200 milimolar y suero bovino fetal inactivado por calor a un tubo cónico de 50 mililitros. Luego agregue colágeno bovino tipo uno, laminina, colágeno tipo cuatro, fibronectina, proteoglucano de sulfato de heparina y finalmente añada hidróxido de sodio para neutralizar el pH de la solución. Si en algún momento la mezcla adquiere un aspecto ácido de color amarillento, agregue unas gotas de hidróxido de sodio estéril 1 normal para neutralizar la mezcla.
Cierre el tubo y mezcle la solución invirtiéndolo varias veces, evitando la formación de burbujas. Cuando no esté mezclando, mantenga la solución en hielo para evitar que se polimerice. Una vez mezclada, agregue las suspensiones celulares a la preparación de colágeno y mezcle los tubos invirtiéndolos suavemente varias veces para evitar la formación de burbujas.
Luego, colóquelos nuevamente sobre el hielo. Añada de cuatro a cinco mililitros de la solución de colágeno que contiene células a cada inserto y deje que el colágeno forme un gel en la cabina, con poca o ninguna movilidad, durante una hora. Después de una hora, transfiera la placa de seis pocillos a un incubador durante una o dos horas adicionales.
A continuación, regrese la placa a la cabina de cultivo celular y use una pinza estéril y un escalpelo para cortar asépticamente la membrana del inserto. Separe el gel que contiene células de la membrana y luego corte el gel separado en pequeños cuadrados. Añada los pequeños cuadrados de colágeno que contienen células a uno de los recipientes de 50 mililitros previamente llenos utilizando el puerto de llenado.
A continuación, prepare una suspensión de células epiteliales humanas HCT-8 como se describe en el protocolo de texto adjunto. Re-suspenda las células a una concentración de 10 millones de células por mililitro en DMEM que contenga 30% de suero bovino fetal (FBS). Luego, agregue un mililitro de la suspensión de células HCT-8 al recipiente de 50 mililitros utilizando su puerto de llenado.
Después de agregar las células, añada 20 mililitros adicionales de medio de cultivo 3-D al recipiente para que quede casi lleno. Vuelva a colocar la tapa y humedezca el borde del puerto de llenado con etanol al 70 %. A continuación, coloque una jeringa de cinco mililitros que contenga de tres a cuatro mililitros de medio de cultivo 3-D en uno de los puertos del recipiente y una jeringa vacía de cinco mililitros en el otro puerto.
Elimine las burbujas visibles tirando del medio hacia la jeringa vacía mientras se inyecta aproximadamente el mismo volumen de medio a través de la otra jeringa hacia el recipiente. Una vez eliminado todo el aire, coloque los recipientes en el biorreactor, encienda la alimentación y ajuste la velocidad a 13-14 rotaciones por minuto. Ajuste la velocidad según sea necesario para evitar que las células entren en contacto con las paredes del recipiente.
Cultive las células bajo microgravedad y cambie el medio de cultivo cada tres o cuatro días. Para cambiar el medio, utilice el método de jeringa dual para reemplazar aproximadamente 30 mililitros del medio usado con medio fresco de cultivo 3-D. Después de tres a cinco días en cultivo, aísle las células mononucleares de sangre periférica según se describe en el protocolo de texto adjunto.
Luego, retire el recipiente del biorreactor y agregue aproximadamente 20 millones de células compuestas por linfocitos y monocitos al recipiente a través del puerto de llenado. Coloque los recipientes nuevamente en el biorreactor y cultive durante cuatro a seis días adicionales. Alrededor del día nueve del cultivo, agregue 20 millones adicionales de células compuestas por linfocitos y monocitos al recipiente y continúe los cultivos hasta 12 días adicionales.
Al final del experimento, utilice una pipeta de transferencia para recolectar cada fragmento pequeño de gel, ahora denominado constructo, y colóquelos en los pocillos de una placa de seis pocillos que contenga 10 mililitros de tampón de formalina al 10%. Fije los constructos durante tres horas a temperatura ambiente y luego continúe con los protocolos estándar de inclusión histológica, corte y tinción. Los métodos presentados en este video producen un modelo organotípico tridimensional multicelular de la mucosa intestinal humana.
En cultivo bajo microgravedad, las células se diferencian bien y forman estructuras ordenadas similares a vellosidades para el día 20. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en seis horas si se lleva a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar seguir las buenas prácticas de cultivo celular.
Es fundamental controlar sistemáticamente las células en cuanto a viabilidad, contaminación por micoplasmas y cambios en el comportamiento del crecimiento celular. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la inmunohistoquímica para identificar marcadores de linaje y diferenciación celular. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo desarrollar un modelo organotípico tridimensional multicitonario de la mucosa intestinal humana cultivado bajo microgravedad.
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Resumen
Este artículo describe el desarrollo de un modelo organotípico tridimensional multicitónico de la mucosa intestinal humana cultivado bajo microgravedad utilizando biorreactores de pared rotatoria (RWV). Este enfoque innovador mejora el cultivo celular en comparación con los métodos tradicionales bidimensionales.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Investigación en microgravedad
Antecedentes
- Los modelos de cultivo celular 3D imitan mejor las condiciones in vivo.
- Los ambientes de microgravedad pueden influir en el comportamiento celular y en las interacciones celulares.
- Los biorreactores de pared rotatoria facilitan la difusión de nutrientes y oxígeno.
- Comprender la mucosa intestinal es fundamental para la investigación sobre salud y enfermedades.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un modelo organotípico tridimensional de la mucosa intestinal humana.
- Explorar las interacciones celulares en un entorno de microgravedad.
- Proporcionar una plataforma para estudiar los mecanismos de la salud y las enfermedades.
Métodos Utilizados
- Uso de biorreactores de vaso con pared rotatoria para el cultivo celular.
- Preparación de un modelo multicelular para simular la mucosa intestinal.
- Evaluación de las interacciones y respuestas celulares.
- Evaluación de la eficiencia de difusión de nutrientes y oxígeno.
Resultados Principales
- El modelo 3-D imitó con éxito la diversidad fenotípica de las células intestinales.
- Las condiciones de microgravedad influyeron en el comportamiento celular y en las interacciones.
- El modelo mostró potencial para estudiar las interacciones con patógenos y los procesos inflamatorios.
- Se logró una difusión eficiente de nutrientes y oxígeno en el montaje del biorreactor.
Conclusiones
- El modelo desarrollado es un avance significativo en la tecnología de cultivo celular.
- Ofrece nuevas perspectivas sobre la salud intestinal y los mecanismos de las enfermedades.
- Este enfoque puede ser una herramienta valiosa para la investigación biomédica futura.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este modelo organotípico tridimensional multicelular de la mucosa intestinal humana cultivado bajo microgravedad proporciona un sistema fisiológicamente relevante para estudiar las interacciones huésped-patógeno, el tráfico de antígenos y los procesos inflamatorios. Al imitar la arquitectura tisular y la diversidad celular in vivo, el modelo aumenta la confianza predictiva en la validación preclínica de dianas y en la reducción de riesgos mecanicistas. Facilita la continuidad traslacional desde el descubrimiento hasta las etapas preclínicas, al permitir la evaluación reproducible y cuantitativa de las respuestas de la mucosa en un sistema relevante para la enfermedad.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biofármacos
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas que implican interacciones epiteliales-inmunitarias en un modelo multicelular de mucosa intestinal humana.
- Valor operativo: Facilita la validación funcional de objetivos al mantener estructuras diferenciadas, similares a vellosidades, bajo condiciones de microgravedad.
- Valor predictivo: Reduce la ambigüedad mecanicista en la selección temprana de objetivos mediante la modelización de la complejidad de la mucosa humana.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Valor científico: Prepara sistemas biológicos validados para el cribado posterior de compuestos que afectan la función de barrera o la modulación inmunitaria.
- Valor operativo: Asegura la estandarización y reproducibilidad del ensayo mediante el cultivo en microgravedad controlada y relaciones definidas de siembra celular.
- Escalabilidad: Permite la reutilización de la plataforma en múltiples series experimentales con formación consistente de constructos para el día 20.
Investigación Translacional y Preclínica
- Relevancia Translacional: Modela la mucosa intestinal humana con componentes epiteliales, endoteliales, fibroblastos y linfocitos para estudios relacionados con enfermedades.
- Continuidad Preclínica: Permite tomar decisiones con ajuste de riesgo al facilitar cultivos longitudinales de hasta 30 días con características fenotípicas estables.
- Reducción de Riesgos Mecanicistas: Permite evaluar procesos inflamatorios e interacciones con patógenos en un sistema controlado de origen humano.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación temprana del blanco hasta la modelización preclínica, especialmente para líneas de investigación centradas en gastroenterología e inmunología.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre las respuestas inmunitarias mucosales y la integridad epitelial en un sistema tridimensional relevante para el ser humano.
- Cribado: Proporciona resultados cuantitativos mediante lecturas histológicas e inmunohistoquímicas tras la fijación y seccionado del constructo.
- Análisis: Permite la comparación de la localización celular, los marcadores de diferenciación y la organización estructural entre diferentes condiciones experimentales.
- Investigación Traducional: Conecta los hallazgos del descubrimiento con la validación preclínica mediante el cultivo sostenido de constructos multicelulares.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma estandarizada, basada en biorreactores rotatorios, aplicable a múltiples modelos de enfermedades intestinales.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva mediante la diversificación fenotípica y la morfogénesis similar a vellosidades bajo microgravedad.
- Valor operativo: Normalización mediante siembra celular definida, gelificación de colágeno y control de la velocidad del biorreactor (13–14 rpm).
- Valor estratégico: Mejora en las decisiones de avance o interrupción al reducir el riesgo de fracaso en fases avanzadas debido a una selección inadecuada de dianas en tejidos mucosos.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de candidatos basada en sus efectos en un modelo intestinal complejo derivado de humanos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el aislamiento de células primarias, preparación de geles tridimensionales y manejo de biorreactores.
- Depende de biorreactores de pared rotatoria (HARV/STLV) y manipulación estéril de fluidos sin burbujas.
- Exige estandarización entre equipos para el origen de las células, la mezcla de colágeno y los horarios de cambio de medio.
- Las consideraciones de adaptación incluyen la escala de tipos y proporciones de células para diferentes regiones mucosas o estados patológicos.
- Las limitaciones prácticas incluyen tiempos prolongados de cultivo (hasta 30 días) y sensibilidad al estrés por cizalladura si la velocidad del biorreactor no se ajusta adecuadamente.
