Name: Formación Automated bicapa lipídica membrana utilizando un polidimetilsiloxano Thin Film (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Aprende la formación automatizada de bicapas lipídicas utilizando películas finas de polidimetilsiloxano. Este método permite estudiar interacciones proteína-membrana con alta reproducibilidad en menos de una hora.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Este trabajo fue apoyado por el Programa del Centro de Investigación Pioneer (NRF-2012-0009575) y las Becas de la Fundación Nacional de Investigación (NRF-2012R1A1B4002413, NRF-2014R1A1A2059341) de la Fundación Nacional de Investigación de Corea. Este trabajo también fue parcialmente apoyado por la Beca de Investigación de la Universidad de Inha.

1. Preparación de la solución <ol><li> Preparación de solución tampón: <ol><li> Para formular solución tampón, disolver 1 M KCl (cloruro de potasio), 10 mM Tris-HCl (Tris-hidrocloruro), y EDTA 1 mM (ácido etilendiaminotetraacético) en agua destilada y ajustar el pH a 8,0. </li><li> Filtrar la solución usando un filtro de 0,20 micras. Para esterilizar, esterilizar en autoclave la solución a 121 ° C durante 15 min. </li></ol></li><li> Preparación de la solución de lípidos para la pre-pintura: <ol><li> Para formular la solución de lípidos para la pre-pintura, disolver 3% DPhPC (1,2-diphytanoyl- sn -glicero-3-fosfatidilcolina) de lípidos (w: v) en una mezcla de 2: 8 n decano y hexadecano (v: v). Se agita durante la noche utilizando un rotador. </li></ol></li><li> Preparación de la solución de lípidos para la formación de la membrana: <ol><li> Para formular la solución de lípidos para la formación de la membrana, se disuelven 0,1% DPhPC (1, 2-diphytanoyl- sn -glicero-3-fosfatidilcolina) de lípidos (w: v) en una mezcla de 2: 8 cuadradosualene y hexadecano (v: v). Se agita durante la noche utilizando un rotador. </li></ol></li></ol> 2. Formación de una película delgada de PDMS <ol><li> Mezclar PDMS y agente de curado en una relación de 9: 1 (w / w) en una taza de mezcla para formar el prepolímero de PDMS. Añadir 5 g de PDMS prepolímero a una placa de Petri para formar los PDMS película delgada (espesor de 200 - 250 micras). Spread PDMS pre-polímero utilizando una recubridora de rotación a 800 rpm durante 10 segundos para formar una película delgada. </li><li> Coloque la placa de Petri en un desecador de vacío a una presión de 100 mTorr durante 2 horas para eliminar las burbujas de aire. Polimerizar la película delgada pre-polímero, horneado en un horno durante 5 horas a 70 ° C. </li><li> Con el fin de hacer un cuadrado de PDMS capa fina, cortar la película delgada de PDMS polimerizadas en 2 x 2 cm 2 casillas. Use un micro punzón 500 micras para hacer una abertura en el centro de los PDMS película delgada. Aberturas pre-pintura con solución de lípidos DPhPC 3% mezclada en 2: 8 n-decano y hexadecano. </li></ol> 3. Fabricación Cámara y Assembly <ol><li> Para fabricar la cámara de BLM, diseño de dos bloques simétricos de la cámara utilizando el software de dibujo 3D con dimensiones exteriores de 4 cm x 1,5 cm x 1 cm y dimensiones internas pocillos de 1,5 cm x 1,3 cm x 0,8 cm 17. </li><li> Las embarcaciones de la cámara usando un bloque de PTFE con una máquina CNC y siga las instrucciones del fabricante. </li></ol> 4. Cámara de la Asamblea <ol><li> Para montar la cámara, coloque la película delgada pre-pintado-PDMS entre los dos bloques de PTFE de tal manera que la abertura de la película delgada de PDMS está alineado con el orificio en la cámara. </li><li> Sellar los bordes exteriores de la cámara usando una cubierta de vidrio con grasa (facilitando la observación óptica). Inmovilizar la cámara montada utilizando tuercas y tornillos. NOTA: Asegúrese de que la cámara está bien sellada para que no haya ninguna fuga de líquido. </li></ol> 5. La formación de la membrana precursor con Formación Acelerada autoensamblaje (MPES) <ol><li> Con una pipeta, depositar 0,5l de 0,1% de lípidos DPhPC mezclado en 2: 8 n decano: hexadecano en la abertura de la película delgada PDMS montado con la cámara. </li><li> Antes de usar, almacenar la cámara en un congelador o refrigerador por debajo de 10 ° C. </li></ol> 6. formación de la membrana y Verificación <ol><li> Para formar una BLM con MPES, retirar de la cámara de la nevera y suspender 2 ml de solución tampón en cada lado de la cámara. Ajuste la cámara de un lado a &lt;10 min hasta que el precursor de las membranas congelado se descongela. </li><li> Coloque la cámara en un micromanipulador para controlar con precisión la elevación con respecto a la fuente de luz y el microscopio. Iluminar un lado de la cámara como una fuente de luz usando una luz halógena de fibra óptica para iluminar la abertura del PDMS película delgada para la observación óptica del proceso de formación de la BLM. </li><li> En el otro lado, colocar un microscopio digital verticalmente con respecto a la fuente de luz para observar la formación de BLM (magnificar por 200X). </li><li> Para confirmar la formación de BLM, observar el centro de la abertura, donde el color se vuelve más brillante que el espacio anular. </li></ol> 7. registro eléctrico <ol><li> Para la medición eléctrica, preparar electrodos de Ag / Cl utilizando un alambre de plata 208 micras de espesor y lejía en hipoclorito de sodio durante&gt; 1 min. Coloque los electrodos Ag / Cl en cada lado de la cámara lo suficientemente profunda para ser sumergido en la solución tampón. </li><li> Conectar los electrodos al amplificador de microelectrodos. El uso de software de electrofisiología, aplicar una forma de onda triangular mV ± 10 a través de la membrana para adquirir una onda cuadrada. Establecer la aplicación de tensión haciendo clic en las flechas indicadas en V_clamp (mV). </li><li> Registrar las propiedades eléctricas de la membrana haciendo clic en el botón de grabación (punto rojo icono). Proceder con la grabación hasta que se observa una onda cuadrada uniforme. Salir de la grabación haciendo clic en el icono cuadrado negro. </li></ol> 8. Incorporación un canal iónico NOE: gramicidina A (gA) la incorporación se produce espontáneamente tras la formación de la BLM, como se añade gA directamente a la solución de lípidos. <ol><li> Para observar las actividades del canal gA, aplique 100 mV a través de la membrana a una velocidad de muestreo de 5 kHz para medir el potencial de la membrana que sostiene. Establecer la aplicación de tensión haciendo clic en las flechas indicadas en V_clamp (mV). </li><li> Registrar las propiedades eléctricas de la incorporación gA haciendo clic en el botón de grabación (punto rojo icono). Proceder de la grabación hasta que se observa saltos de corriente. Salir de la grabación haciendo clic en el icono cuadrado negro. </li><li> Después de la adquisición de datos eléctricos, filtrar los datos con un filtro de paso bajo de Bessel a 100 Hz usando un software de electrofisiología. </li><li> Observar saltos de corriente en la celebración de los datos potenciales filtrada (cada salto de corriente, ~ 0,15 nS, representa la dimerización de un canal iónico GA) para verificar gA incorporación. </li></ol>

<ol><li>Hanke, W., Schulue, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHanke%2C+W+%22Planar+lipid+bilayers%3A+methods+and+applications%22">Planar lipid bilayers: methods and applications</a>. , Academic Press. (2012).</li>
<li>Mirzabekov, T. A., Silberstein, A. Y., Kagan, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+planar+lipid+bilayer+membranes+for+rapid+screening+of+membrane+active+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Use of planar lipid bilayer membranes for rapid screening of membrane active compounds.</a> Methods Enzymol. 294, 661-674 (1999).</li>
<li>Bayley, H., Cremer, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+sensors+inspired+by+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stochastic sensors inspired by biology.</a> Nature. 413 (6852), 226-230 (2001).</li>
<li>Fang, Y., Lahiri, J., Picard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein-coupled+receptor+microarrays+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug.+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">G protein-coupled receptor microarrays for drug discovery.</a> Drug. Discov. Today. 8 (16), 755-761 (2003).</li>
<li>Majd, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+biological+pores+in+nanomedicine%2C+sensing%2C+and+nanoelectronics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Applications of biological pores in nanomedicine, sensing, and nanoelectronics.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 21 (4), 439-476 (2010).</li>
<li>Kim, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+Biomimetic+Membranes+and+Their+Sensor+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Synthetic Biomimetic Membranes and Their Sensor Applications.</a> Sensors (Basel). 12 (7), 9530-9550 (2012).</li>
<li>Ryu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+Ion+Channel+Activities+of+Gramicidin+A+in+the+Presence+of+Ionic+Liquids+Using+Model+Cell+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Investigation of Ion Channel Activities of Gramicidin A in the Presence of Ionic Liquids Using Model Cell Membranes.</a> Sci Rep. 5, (2015).</li>
<li>Wood, C., Williams, C., Waldron, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamping+by+numbers%5BTitle%5D)+AND+%22Drug.+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">Patch clamping by numbers.</a> Drug. Discov. Today. 9 (10), 434-441 (2004).</li>
<li>Mueller, P., Rudin, D. O., Tien, H. T., Wescott, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+cell+membrane+structure+in+vitro+and+its+transformation+into+an+excitable+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of cell membrane structure in vitro and its transformation into an excitable system.</a> Nature. 194, 979-980 (1962).</li>
<li>Montal, M., Mueller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+bimolecular+membranes+from+lipid+monolayers+and+a+study+of+their+electrical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Formation of bimolecular membranes from lipid monolayers and a study of their electrical properties.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 69, 3561-3566 (1972).</li>
<li>Baaken, G., Sondermann, M., Schlemmer, C., Ruhe, J., Behrends, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planar+microelectrode-cavity+array+for+high-resolution+and+parallel+electrical+recording+of+membrane+ionic+currents%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Planar microelectrode-cavity array for high-resolution and parallel electrical recording of membrane ionic currents.</a> Lab Chip. 8 (6), 938-944 (2008).</li>
<li>Costello, R., Peterson, I., Heptinstall, J., Byrne, N., Miller, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+gel-bilayer+channel+biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater.+Opt.+Electron%22%5BJournal%5D)">A robust gel-bilayer channel biosensor.</a> Adv. Mater. Opt. Electron. 8 (2), 47-52 (1998).</li>
<li>Ide, T., Yanagida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+artificial+lipid+bilayer+formed+on+an+agarose-coated+glass+for+simultaneous+electrical+and+optical+measurement+of+single+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">An artificial lipid bilayer formed on an agarose-coated glass for simultaneous electrical and optical measurement of single ion channels.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 265 (2), 595-599 (1999).</li>
<li>Jeon, T. J., Malmstadt, N., Schmidt, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel-encapsulated+lipid+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Hydrogel-encapsulated lipid membranes.</a> J Am Chem Soc. 128 (1), 42-43 (2006).</li>
<li>Malmstadt, N., Jeon, T. J., Schmidt, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Lived+Planar+Lipid+Bilayer+Membranes+Anchored+to+an+In+Situ+Polymerized+Hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Long-Lived Planar Lipid Bilayer Membranes Anchored to an In Situ Polymerized Hydrogel.</a> Adv. Mater. 20 (1), 84-89 (2008).</li>
<li>Jeon, T. J., Poulos, J. L., Schmidt, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+storable+and+shippable+lipid+bilayer+membrane+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Chip%22%5BJournal%5D)">Long-term storable and shippable lipid bilayer membrane platform.</a> Lab. Chip. 8 (10), 1742-1744 (2008).</li>
<li>Ryu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+Lipid+Membrane+Formation+Using+a+Polydimethylsiloxane+Film+for+Ion+Channel+Measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Automated Lipid Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Film for Ion Channel Measurements.</a> Anal. Chem. 86 (18), 8910-8915 (2014).</li>
<li>Yaws, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYaws%2C+C+%22Chemical+Properties+Handbooks%3A+Physical%2C+Thermodynamic%2C+Environmental%2C+Transport%2C+Safety%2C+and+Health+Related+Properties+for+Organic+and+Inorganic+Chemicals%22">Chemical Properties Handbooks: Physical, Thermodynamic, Environmental, Transport, Safety, and Health Related Properties for Organic and Inorganic Chemicals</a>. , MC GRAW HILL HANDBOOKS. (1999).</li>
<li>Windholz, M., Budavari, S., Stroumtsos, L. Y., Fertig, M. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWindholz%2C+M+%22The+Merck+index.+An+encyclopedia+of+chemicals+and+drugs%22">The Merck index. An encyclopedia of chemicals and drugs</a>. , Merck & Co. (1976).</li>
<li>Miller, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiller%2C+C+%22Ion+Channel+Reconstitution%22">Ion Channel Reconstitution</a>. , Springer Science & Business Media. (1986).</li>
<li>Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-state+substructure+of+single+chloride+channels+from+Torpedo+electroplax%5BTitle%5D)+AND+%22Philos.+Trans.+R.+Soc.+Lond.+B.+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Open-state substructure of single chloride channels from Torpedo electroplax.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 299 (1097), 401-411 (1982).</li>
<li>Benz, R., Frohlich, O., Lauger, P., Montal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+capacity+of+black+lipid+films+and+of+lipid+bilayers+made+from+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Electrical capacity of black lipid films and of lipid bilayers made from monolayers.</a> Biochim. Biophys. Acta. 394 (3), 323-334 (1975).</li>
<li>Priel, A., Gil, Z., Moy, V. T., Magleby, K. L., Silberberg, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionic+requirements+for+membrane-glass+adhesion+and+giga+seal+formation+in+patch-clamp+recording%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Ionic requirements for membrane-glass adhesion and giga seal formation in patch-clamp recording.</a> Biophys. J. 92 (11), 3893-3900 (2007).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Nuestra técnica de formación BLM proporciona una poderosa herramienta para los estudios de membranas celulares y canales iónicos, en contraste con las técnicas convencionales que tienen un potencial limitado para uso industrial. Desarrollamos un precursor de membrana utilizando una película delgada de PDMS e ideamos un precursor de membrana congelado con autoensamblaje acelerado.
A diferencia de los métodos convencionales de formación de membranas con películas hidrofóbicas, donde la formación...

Artificial membrana de bicapa lipídica, o membrana lipídica negro (BLM), es una herramienta importante para la aclaración de los mecanismos de las membranas celulares y los canales de iones, así como para la comprensión de las interacciones entre los canales iónicos e iones / moléculas. 1-7 Aunque el método de patch-clamp a menudo se considera el estándar de oro para los estudios de la membrana celular, es laboriosa y requiere operadores altamente calificados para las mediciones de los canales iónicos. 8 Aunque las membranas de bicapa lipídica reconstituidas artificialmente se han convertido en herramientas alternativas para los estudios de los canales iónicos, 9,10 también se asocian con laboriosa procesos y conocimientos específicos. Por otra parte, las membranas son susceptibles a perturbaciones mecánicas. Por lo tanto, las tecnologías de bicapa lipídica introducidas hasta la fecha han limitado las aplicaciones prácticas. 11 Con el fin de mejorar la robustez y la longevidad de las membranas bicapa de lípidos, Costello et al., 12, y Ide y Yanagida <sup&gt; 13 han ideado una bicapa lipídica independiente con el apoyo de los hidrogeles. A pesar de una mayor longevidad sin embargo (&lt;24 h), la robustez bicapa no mejoró. Jeon et al. 14 ideó una membrana de encapsulado de hidrogel (HEM) con íntimo contacto bicapa lipídica de hidrogel, lo que resulta en una mayor longevidad (hasta varios días). Para aumentar aún más la vida útil de la HEM, Malmstadt y Jeon et al. Crean una membrana de hidrogel encapsulado con la unión de hidrogel de lípidos a través de la conjugación covalente (cgHEM). 15 in-situ En ambos sistemas, tiempos de vida de la membrana aumentaron sustancialmente (&gt; 10 días) . Sin embargo, los sistemas de formación de membrana no fueron lo suficientemente consistentes, y no se pueden guardar o entregados cuando sea necesario para liberar a la experiencia de uso de las bicapas lipídicas. El desarrollo de una plataforma de bicapa lipídica ha girado principalmente en torno a aumentar la robustez y longevidad de BLM. Aunque la longevidad de BLM ha sido substantially mejorado recientemente, sus aplicaciones han sido limitados debido a la falta de capacidad de almacenamiento y facilidad de transporte. Para superar estos problemas, Jeon et al. Creado un sistema de membrana almacenable e introdujo un precursor de membrana (MP). 16 Para construir una MP, prepararon una mezcla de n-decano y hexadecano que contiene 3% DPhPC (1,2-diphytanoyl- sn -glicero-3-fosfatidilcolina) para controlar el punto de la solución de lípidos tal que se congelaría a ~ 14 ° C (por debajo de la temperatura ambiente, superior a la temperatura típica refrigerador) de congelación. En este experimento, la MP se extendió sobre una pequeña abertura en una película de politetrafluoroetileno (PTFE) y, posteriormente, congelado en un refrigerador a 4 ° C. Cuando el MP se llevó a temperatura ambiente, la MP descongela y una bicapa lipídica se formó automáticamente, eliminando la experiencia típicamente asociada con la formación de la membrana. Sin embargo, la tasa de éxito de la BLM a partir del MP fue tan baja como ~ 27%, y la membrana formation tiempo era incompatible (30 min a 24 h), lo que limita sus aplicaciones prácticas. En este estudio, un polidimetilsiloxano (PDMS) de película fina se utiliza en lugar de un películas convencionales hidrófobos delgadas (PTFE, polioximetileno, poliestireno) a (a) el tiempo de control de fabricación y (b) aumentar la tasa de éxito de la formación de BLM como se informó anteriormente por Ryu et al. 17 en este documento, formación de la membrana fue facilitada por la extracción de disolventes debido a la naturaleza porosa de PDMS, y el tiempo requerido para la formación de membrana se controla con éxito en este estudio. En este sistema, como la solución de lípidos se absorbe en la película delgada PDMS, se consiguió un tiempo de formación de la membrana consistente. Por otra parte, la vida útil de la membrana se prolongó debido a la absorción lenta de disolventes en el PDMS película delgada, como resultado de la adición de escualeno a la solución de lípidos. Hemos llevado a cabo las mediciones ópticas y eléctricas para verificar que las membranas formadas utilizando esta técnica son adecuados para ien estudios de canales.

<table><tbody><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>Para solución tampón</td></tr><tr><td>Clorhidrato de tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1185-53-1</td><td>Para solución tampón</td></tr><tr><td>Ácido etilendiaminotetraacético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60-00-4</td><td>Para solución tampón</td></tr><tr><td>n-decano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44074-U</td><td>Para solución</td></tr> <tr><td>lipídicaHexadecano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>544-76-3</td><td>Para solución lipídica</td></tr><tr><td>Escualeno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3626</td><td>Para solución lipídica</td></tr><tr><td>Gramicidina A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11029-61-1 Proteína de</td><td>membrana</td></tr><tr><td>1,2-dipitanoil-sn-glicero-3-fosfocolina</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>850356</td><td>Para la formación de membranas</td></tr><tr><td>Sylgard 184a y 184b kit de gastrómeros</td><td>Dow Corning Asia</td><td></td><td>Para producir película delgada PDMS</td></tr><tr><td>0.2 &mu; m filter</td><td>Satorius stedim</td><td>16534----------K</td><td>Para filtrar la solución tampón</td></tr><tr><td>Rotator</td><td>FinePCR</td><td>AG</td><td>Para disolver los lípidos de forma homogénea</td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Biofree</td><td>BF-60AC</td><td>Para esterilizar la solución tampón</td></tr><tr><td></td><td>Barnu Mst</td><td>SP-60P</td><td>Para esparcir el prepolímero PDMS</td></tr><tr><td>Vaccum deseccator</td><td>Welch</td><td>2042-22</td><td>Para eliminar las burbujas de aire en prepolímero PDMS</td></tr><tr><td>500 &mu; m&nbsp; punzón</td><td>Harris Uni-Core</td><td>0.5</td><td>Para crear una apertura en la máquina CNC de película delgada PDMS</td></tr> Comercio de <tr><td></td><td>pymes</td><td>SME 2518</td><td>Para fabricar la cámara de formación de membranas</td></tr><tr><td>Iluminador halógeno de fibra óptica</td><td>Motic</td><td>MLC-150C</td><td>Para iluminar la apertura de la película delgada PDMS para observación óptica</td></tr><tr><td>Microscopio digital</td><td>Azul digital</td><td>QX-5</td><td>Para observar ópticamente la membrana bicapa lipídica formación</td></tr><tr><td>de electrodos</td><td></td><td>Sistemas A-M</td><td>Para observar eléctricamente la formación de membranas</td></tr><tr><td>Amplificador de microelectrodos (amplificador Axopatch)</td><td>Axon Instruments</td><td>Amplificador Axopatch 200B</td><td>Para medir la capacitancia de la membrana (descrito como amplificador de microelectrodos en el manuscrito)</td></tr></tbody></table>

formación automated bicapa lipídica membrana utilizando un polidimetilsiloxano thin film

Automated Lipid Bilayer Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Thin Film

Una bicapa lipídica artificial, o membrana lipídica negro (BLM), es una poderosa herramienta para el estudio de los canales iónicos y la interacción de proteínas, así como para aplicaciones de biosensores. Sin embargo, las técnicas de formación de BLM convencionales tienen varios inconvenientes y que a menudo requieren conocimientos específicos y procesos laboriosos. En particular, BLM convencionales sufren de bajas tasas de éxito de formación y tiempo de formación de la membrana inconsistente. Aquí, se demuestra un sistema de formación de BLM almacenable y transportable con el tiempo de espera adelgazamiento controlado y velocidad de formación de BLM mejorada mediante la sustitución de películas utilizadas convencionalmente (politetrafluoroetileno, polioximetileno, poliestireno) de polidimetilsiloxano (PDMS). En este experimento, se usa un polímero poroso estructurado tal como una película delgada PDMS. Además, a diferencia de los disolventes usados ​​convencionalmente con baja viscosidad, el uso de escualeno permite un tiempo de adelgazamiento de salida controlada por medio de absorción de disolvente lento por PDMS, prolongando la vida de la membrana. En anunciocondición, mediante el uso de una mezcla de escualeno y hexadecano, el punto de la solución de lípidos de congelación se incrementó (~ 16 ° C), además, se produjeron los precursores de membrana que se puede almacenar indefinidamente y fácilmente transportado. Estos precursores de membrana han reducido el tiempo BLM formación de &lt;1 hora y se logró una tasa de formación de BLM de ~ 80%. Por otra parte, los experimentos de los canales iónicos con gramicidina A demostraron la viabilidad del sistema de membranas.

Optimización de Solución MPES Composición Diferentes composiciones de lípidos y disolventes se ensayaron para reconstituir con éxito membranas de bicapa lipídica de MPES. El sistema MP con una mezcla de n-decano y hexadecano que contiene 3% DPhPC 14 exhibió una baja tasa de éxito de la formación de la membrana (~ 27%). Además, como la película de PDMS se extrae continuamente solución de lípidos, era necesario para optimizar la composición del d...

Demostramos un sistema almacenable, transportable lípidos formación de bicapa. Una membrana de bicapa lipídica se puede formar dentro de 1 h con tasa de éxito más del 80% cuando un precursor de membrana congelada se llevó a temperatura ambiente. Este sistema reducirá los procesos laboriosos y conocimientos asociados a los canales iónicos.

Formación Automated bicapa lipídica membrana utilizando un polidimetilsiloxano Thin Film

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for ...

El objetivo general de este procedimiento es describir un método que pueda utilizarse para estudiar la formación automatizada de bicapas lipídicas utilizando una película delgada de polidimetilsiloxano. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de los nanobiosensores respecto a las interacciones entre membranas y proteínas. La principal ventaja de esta técnica es que la formación de la bicapa lipídica es automatizada y reproducible.Para comenzar, prepare la solución tampón combinando cloruro de potasio, tris hidrocloruro y EDTA en agua destilada. Luego, ajuste el pH de la solución a 8,0. A continuación, filtre la solución utilizando un filtro de 0,2 micrones y autóclavela a 121 grados Celsius durante 15 minutos.A continuación, prepare la solución de lípidos para el pre-pintado disolviendo el 3% del lípido en una mezcla compuesta por dos partes de undecano y ocho partes de hexadecano en volumen. Agite la solución durante la noche utilizando un rotador. Asimismo, prepare la solución de lípidos para la formación de la membrana disolviendo el 0,1% del lípido en la misma mezcla de dos partes de undecano y ocho partes de hexadecano en volumen.Agite esta solución du

automated-lipid-bilayer-membrane-formation-using-polydimethylsiloxane

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Bicapas lipídicas soportadas y partículas de membrana naturales son sistemas convenientes que pueden aproximarse a las propiedades de las membranas celulares y ser incorporadas en una gran variedad de estrategias de análisis. Aquí se demuestra un método para preparar compuestos de microarrays de soportados de lípidos de la bicapa recubiertos de SiO 2 perlas, vesículas de fosfolípidos o partículas de membrana naturales.

Formación de biomembrana Microarrays con un método basado en la Asamblea Rasero

De chorro de microfluidos contra una bicapa lipídica interfaz de gotita ofrece una manera fiable para generar vesículas con el control de la asimetría de la membrana, la incorporación de proteínas de transmembrana, y la encapsulación de material. Esta técnica se puede aplicar para estudiar una variedad de sistemas biológicos en los que se desean biomoléculas compartimentadas.

Lípidos bicapa vesículas Generación Usando Microfluidic Jetting

Se presenta un protocolo experimental para formar una bicapa lipídica apoyado sobre soportes sólidos sin usar vesículas lipídicas. Se demuestra un método de un solo paso para formar una bicapa lipídica en dióxido de silicio y oro, así como membranas soportadas con dominio enriquecida en colesterol para diversas aplicaciones biológicas.

Biomembrana Fabrication por la bicapa lipídica (SALB) Método-Solvente asistida

La generación de emulsiones dobles microfluídicas generalmente involucra dispositivos con humectabilidad estampada o componentes de vidrio fabricados a medida. Aquí describimos la fabricación y prueba de un generador de doble emulsión de polidimetilsiloxano (PDMS) que no requiere tratamiento superficial ni procesos de fabricación complicados, y es capaz de producir emulsiones dobles de hasta 14 μm.

Generación de doble emulsión utilizando un flujo Focus Dispositivo de polidimetilsiloxano (PDMS) Co-axial

Apoyo sólido, libre de proteína, dobles membranas de bicapa de fosfolípidos (DLBM) pueden transformarse en redes de nanotubos de lípidos complejos y dinámicos y pueden servir como modelos 2D de abajo hacia arriba del retículo endoplasmático.

Formación espontánea y cambio de redes de nanotubos lipídica Artificial como un modelo Bottom-Up de retículo endoplasmático

Reportamos un protocolo para producir una membrana lipídica híbrida en la interfaz agua/aire dopando la bicapa lipídica con moléculas de cobre (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-phthalocyanine (CuPc). La membrana lipídica híbrida resultante tiene una estructura sándwich de lípidos/CuPc/lípidos. Este protocolo también se puede aplicar a la formación de otros nanomateriales funcionales.

Autoensamble de membranas lipídicas híbridas dopadas con moléculas orgánicas hidrófobas en la interfaz agua/aire

Este protocolo describe la formación de vesículas unilipídicas y multilipídicas que imitan a las células, bicapas lipídicas soportadas y bicapas lipídicas suspendidas. Estos modelos in vitro se pueden adaptar para incorporar una variedad de tipos de lípidos y se pueden utilizar para investigar diversas interacciones de moléculas y macromoléculas.

Ensamblaje de modelos de bicapa lipídica soportada y suspendida de imitación celular para el estudio de interacciones moleculares

Aquí, se presenta un protocolo para realizar y analizar la unión, movilidad y ensamblaje de moléculas individuales en membranas lipídicas artificiales apiñadas utilizando microscopía de fluorescencia de reflexión interna total de molécula única (smTIRF).

Difusión y ensamblaje de una sola molécula en membranas lipídicas llenas de polímeros

Aquí, se desarrolla un sistema de bicapa lipídica soportado por nanobarras para proporcionar una membrana sintética con una curvatura definida que permite la caracterización de proteínas con capacidad de detección de curvatura in vitro.

Un sistema de bicapa lipídica soportado por nanobar para el estudio de proteínas de detección de curvatura de membrana in vitro

El presente protocolo describe el ensamblaje de liposomas asistido por octanol (OLA), una técnica microfluídica para generar liposomas biocompatibles. OLA produce liposomas monodispersos de tamaño micrométrico con encapsulación eficiente, lo que permite la experimentación inmediata en chip. Se prevé que este protocolo sea particularmente adecuado para la biología sintética y la investigación de células sintéticas.

Conjunto de liposomas asistido por octanol en chip para bioingeniería

Este protocolo presenta un procedimiento de desmoldeo mejorado para la técnica de doble fundición de polidimetilsiloxano (PDMS) mediante la introducción de aceite de silicona como barrera no adhesiva entre las capas de PDMS. A diferencia de los métodos de modificación de superficies con plasma o químicos, este enfoque no requiere equipos especializados o costosos, lo que lo convierte en una alternativa más accesible y rentable.

Doble fundición mejorada de polidimetilsiloxano (PDMS) mediante tratamiento con aceite de silicona para la replicación de microestructuras densamente empaquetadas

Aprende la formación automatizada de bicapas lipídicas utilizando películas finas de polidimetilsiloxano. Este método permite estudiar interacciones proteína-membrana con alta reproducibilidad en menos de una hora.

Formación Automated bicapa lipídica membrana utilizando un polidimetilsiloxano Thin Film

Explorar más videos