Formación Automated bicapa lipídica membrana utilizando un polidimetilsiloxano Thin Film

El objetivo general de este procedimiento es describir un método que se puede utilizar para estudiar la formación automatizada de bicapas lipídicas utilizando una película delgada de polidimetilsiloxano. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de los nanobiosensores con respecto a las interacciones membrana-proteína. La principal ventaja de esta técnica es que la formación de la bicapa lipídica es automatizada y reproducible.

Para comenzar, prepare la solución tampón combinando cloruro de potasio, clorhidrato de tris y EDTA en agua destilada. A continuación, ajuste el PH de la solución a 8,0. A continuación, filtre la solución con un filtro de 0,2 micras y autoclave la solución a 121 grados centígrados durante 15 minutos.

A continuación, prepare la solución lipídica para el prepintado disolviendo el 3% del lípido en una mezcla compuesta por dos partes de undecano y ocho partes de hexadecano por volumen. Revuelva la solución durante la noche con un rotador. Además, prepare la solución lipídica para la formación de membranas disolviendo el 0,1% del lípido en la misma mezcla de dos partes de undecano y ocho partes de hexadecano por volumen.

Revuelva esta solución durante la noche en un rotador también. Para preparar una película delgada de PDMS, mezcle nueve partes de prepolímero con una parte de agente de curado en una taza mezcladora. Coloque cinco gramos de esta mezcla en una placa de Petri y centrifuga la placa a 800 rpm durante 10 segundos para formar una película de 200 a 250 micras de grosor.

A continuación, coloque la placa de Petri en un desecador de vacío y tire de una aspiradora de 100 militorr durante dos horas para eliminar las burbujas de aire residuales. Luego, hornee la película delgada en un horno durante cinco horas a 70 grados centígrados para polimerizar el PDMS. Una vez enfriada, corte la película delgada polimerizada en cuadrados de dos centímetros por dos centímetros y use un punzón de 500 micras de diámetro para hacer una pequeña abertura en el centro del cuadrado.

A continuación, utilice una micropipeta para pintar previamente las aberturas con un microlitro de la solución lipídica al 3%. Para crear la cámara de membrana lipídica negra, diseñe dos bloques simétricos para la cámara utilizando un software de dibujo en 3D. Luego, fabrique la cámara usando un bloque de PTFE y una máquina CNC.

Para ensamblar la cámara, coloque la película delgada PDMS prepintada entre los dos bloques de PTFE, de modo que la abertura de la película delgada PDMS esté centrada con el orificio de la cámara. Use cubreobjetos y grasa para aspirar para sellar los bordes exteriores de la cámara. Una vez sellada, inmovilice la cámara ensamblada con tuercas y pernos.

Es importante asegurarse de que la cámara esté bien sellada para que no haya fugas de líquido. Con una pipeta, deposite 0,5 microlitros de la solución lipídica al 0,1% en la abertura de la película delgada PDMS, ensamblada con la cámara. Luego, coloque la cámara en un ambiente enfriado por debajo de los 10 grados centígrados y guárdela hasta que la necesite.

Para formar una membrana lipídica negra con autoensamblaje acelerado, retire la cámara del refrigerador y agregue dos mililitros de la solución tampón a cada lado de la cámara. Deje la cámara a un lado durante 10 minutos hasta que el precursor de membrana congelado se descongele. A continuación, coloque la cámara en un micromanipulador para controlar con precisión la elevación con respecto a la fuente de luz y el microscopio.

Usando un iluminador halógeno de fibra óptica, ilumine un lado de la cámara para iluminar la apertura de la película delgada PDMS. En el otro lado, coloque un objetivo de 20x en línea con la apertura y observe el centro donde el color se vuelve más brillante que el anillo. Para la medición eléctrica, prepare electrodos de cloruro de plata colocando un alambre de plata de 208 micrómetros de espesor en una solución de hipoclorito de sodio durante al menos un minuto.

A continuación, conecte los electrodos a un amplificador de microelectrodos. Luego, coloque los electrodos de cloruro de plata en cada lado de la cámara, de modo que estén en la solución tampón. Usando un software de electrofisiología, aplique una forma de onda triangular de 10 milivoltios a través de la membrana para adquirir una onda cuadrada.

Registre las propiedades eléctricas de la membrana haciendo clic en el botón de grabación. Continúe grabando hasta que se observe una onda cuadrada uniforme. A continuación, cierra la grabación haciendo clic en el icono del cuadrado negro.

Se pueden emplear dos métodos para incorporar gramicidina A en la bicapa lipídica. En primer lugar, la gramicidina A puede añadirse directamente a la solución lipídica antes de esparcir la solución lipídica sobre la abertura de la película fina del PDMS. En segundo lugar, se puede agregar una solución de gramicidina A a la cámara cuando se forma una bicapa lipídica.

Para observar las actividades del canal de gramicidina A, aplique 100 milivoltios a través de la membrana a una velocidad de muestreo de 5 kilohercios para medir el potencial de retención de la membrana. Registre las propiedades eléctricas como se hizo anteriormente, haciendo clic en el botón de grabación. A medida que se muestran las actividades de los canales iónicos, siga grabando hasta que se observen varios saltos de corriente para confirmar la incorporación de canales iónicos.

Una vez confirmado, salga de la grabación haciendo clic en el icono del cuadrado negro. Una vez finalizada la grabación, filtre los datos con un filtro Bessel de paso bajo a 100 hercios utilizando un software de electrofisiología. Observe los saltos de corriente en los datos de potencial de retención filtrados.

Estos saltos representan la dimerización de un canal iónico de gramicidina A. Cuando el precursor de membrana congelada se llevó a temperatura ambiente para descongelarse, la formación de bicapas lipídicas se facilita debido a la extracción de solvente hidrofóbico en la película delgada de PDMS. Esta secuencia de imágenes muestra la formación de una bicapa lipídica, que se autoensambla cuando se calienta a partir de su forma congelada.

Aquí, la conductancia eléctrica ilustra la incorporación y dimerización de gramicidina A. Tras la dimerización, la gramicidina A forma un canal iónico y los niveles de conductancia saltan a 28 picosiemens, lo que es consistente con los resultados de informes anteriores y muestra la incorporación inmediata de este antibiótico a la bicapa. Nuestra técnica de formación de membranas proporciona una poderosa herramienta para los estudios de membranas celulares y nanocanales en contraste con las técnicas convencionales que tienen un potencial limitado para la aplicación práctica. Nuestro sistema no requiere experiencia ni para la formación de membranas ni para la incorporación de canales iónicos, lo que lo hace muy adecuado para aplicaciones de detección de fármacos y biodetección.