Formación de biomembrana Microarrays con un método basado en la Asamblea Rasero

El objetivo general de este procedimiento es crear microarrays de biomembranas utilizando un método de preparación sencillo. Esto se logra recubriendo primero las perlas de sílice con membranas de bicapa lipídica. El segundo paso del procedimiento es depositar las perlas recubiertas de lípidos sobre el sustrato de micropocillos de silicona.

El tercer paso es eliminar las perlas que no están en los micro pocillos, utilizando una escobilla de goma de polimetilsuboxano. El paso final es obtener imágenes de las matrices de perlas recubiertas de lípidos con microscopía de fluorescencia. En última instancia, este método se puede utilizar para determinar las constantes de unión a las interacciones de los lípidos de las toxinas utilizando un enfoque de imágenes de matriz.

Este método se puede utilizar para crear matrices de bicapas lipídicas esféricas soportadas y partículas de membrana natural derivadas de las células. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes es que, aparte de la fabricación de los micropocillos, la técnica no requiere modificación química ni del sustrato ni de las membranas lipídicas para crear matrices de biomembranas definidas espacialmente. Las aplicaciones de esta técnica pueden extenderse a la detección sin marcadores de interacciones de proteínas lipídicas utilizando plasma de superficie y resonancia basada en matrices de agujeros metálicos nanométricos.

Aunque este método puede proporcionar información sobre las interacciones de las proteínas lipídicas, también se puede aplicar a otros sistemas, como los estudios de adhesión focal celular, las matrices de micropocillos y las preparaciones de escobillas de goma que se detallan en el protocolo de texto. Este video comienza con la preparación de las vesículas. Primero en una pequeña mezcla de viales de vidrio, los lípidos componentes de las vesículas.

Un total de medio miligramo de lípido se encuentra en esta solución bajo vacío desecar la mezcla durante seis horas. A continuación, prepare una solución de cloruro de sodio 0,1 molar y agregue medio mililitro a los lípidos secos. Deje que la mezcla se incube durante la noche a temperatura ambiente.

Al día siguiente, vórtice la mezcla para suspender las vesículas. A continuación, sonicar la mezcla durante 20 minutos en un baño, sonicar a temperatura ambiente. Después de la sonicación, extruya la suspensión a través de un filtro de membrana de policarbonato de 100 nanómetros.

Pase la suspensión a través del filtro de extrusión un total de 17 veces. A continuación, almacene las vesículas extruidas en un vial de vidrio a cuatro grados centígrados. Primero utilizando perlas de dióxido de silicio de 700 nanómetros de diámetro.

Haga una suspensión de 15 mil millones de perlas en cloruro de sodio de 0.1 molar. Agite la suspensión y luego centrifugue a 1700 Gs durante 20 minutos y deseche el sobrenadante. Repita el lavado por resus, suspendiendo las perlas en otro mililitro de solución salina y girándolas durante otros 20 minutos.

A continuación, repita el proceso una tercera vez para formar las bicapas lipídicas esféricas soportadas o SSB. Mezcle 25 microlitros de la suspensión de perlas de dióxido de silicio con 200 microlitros de la suspensión de vesículas de la sección anterior. Agite la mezcla y enciéndala incubar a temperatura ambiente durante una hora después, centrifugue la mezcla a 1700 Gs durante 20 minutos.

Deseche el sobrenadante. La bolita es de color rosa a vesículas rotas con fila de DPPE en las cuentas. Vuelva a suspenderlo en 225 microlitros de PBS a PH 7.4.

Repita los pasos de centrifugado y suspensión Resus dos veces para eliminar las vesículas no rotas y completar la creación de los SSB. Divida las obleas de las matrices de micropocillos en piezas rectangulares de cuatro a seis matrices cada una. A continuación, el vórtice, la suspensión SSLB de la sección anterior y transferir 10 microlitros a cada matriz de micro pocillos.

Espere una hora para que los SSB se asienten más tarde. Lave suavemente los chips de la matriz con PBS y sumerja la matriz en PBS usando el deslizamiento de la escobilla sobre la superficie de los chips sumergidos cinco veces. Esto elimina los SLP que no están dentro de los micro pocillos.

A continuación, sujete cada chip de matriz con pinzas y sacuda suavemente el PBS. Luego transfiéralo a un baño PBS fresco. Las superficies superiores de las virutas deben permanecer húmedas.

Retire una viruta de la bañera y aléjese. La mayoría de los PBS con una toallita de laboratorio. Deje suficiente PBS para mantener la matriz hidratada.

Ahora agregue 200 microlitros de solución BSA a la matriz para bloquear el enlace no específico. Deje que la matriz se incube durante una hora. Más tarde, en una caja humidificada, retire el BSA con una micropipeta y agregue 200 microlitros de solución de toxina del cólera.

A continuación, devuelva el conjunto a la cámara humidificada. Espere una hora más, luego lave la matriz con PBS y absorba el exceso de PBS con una toallita para el regazo. A continuación, coloque el chip de la matriz en un portaobjetos de microscopía estándar y adjunte una cubierta cuadrada de 24 por 40 milímetros a la matriz y proceda con la obtención de imágenes.

El análisis de imágenes se puede realizar con las funciones de análisis de partículas automatizado de imágenes J. A continuación, para cada matriz, resuma las intensidades medias de los SSB individuales como histogramas. Después de usar los métodos descritos, un área cuadrada de 100 micras en una matriz muestra 936 SSB.

Mientras tanto, se calcularon los datos de ocupación y se generó un histograma de intensidades fluorescentes de SSLB después de una semana en almacenamiento. El mismo conjunto se volvió a analizar de la misma manera, y no hubo cambios en las intensidades fluorescentes o la ocupación del conjunto. La deposición secuencial de diferentes SSB con diferentes marcadores de identificación también fue posible con los métodos descritos.

Los segundos SSB se depositaron en una décima. La concentración de las primeras SSB depositadas. Se muestra una superposición de ambos marcadores para un experimento.

Las matrices se fabricaron con SSB con varias concentraciones de GM y se expusieron a una concentración fija de toxina del cólera. También se realizó la inversa para determinar la constante de disociación de equilibrio. Para GM uno.

Las matrices de unión a la toxina del cólera también se pueden fabricar a partir de biomembranas naturales, como esta matriz hecha de partículas de mielina. Está marcado con fluoro lipofílico cuatro FM 1 43. Las balsas lipídicas están enriquecidas en colesterol y gangliósidos como el transgénico.

Por lo tanto, la toxina del cólera conjugada Alexa 4 88 se une fuertemente a los microarrays de balsas lipídicas, por el contrario, el Aden rayado con fluorescencia no se une a estos arrays. Se hizo una matriz mediante la entrega de balsas de mielina y lípidos a los micropozos a través de un chip microfluídico con canales de 250 micras. Se marcó con IgM anti oligodendrocitos y el sulfuro S que se encuentra en la mielina se marcó, pero las balsas lipídicas no.

No Una vez que las perlas recubiertas de lípidos bator están preparadas. Esta técnica se puede utilizar para preparar matrices en una hora si se realiza correctamente, después de la creación de matrices de partículas de membrana natural. Otros métodos, como el plasma de superficie de nanoagujeros y la resonancia, se pueden utilizar para la detección sin etiquetas de las interacciones biomoleculares.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo crear matrices de biomembranas utilizando perlas recubiertas de capas biliares lipídicas y partículas de membrana naturales.