Lípidos bicapa vesículas Generación Usando Microfluidic Jetting
21 de febrero de 2014
De chorro de microfluidos contra una bicapa lipídica interfaz de gotita ofrece una manera fiable para generar vesículas con el control de la asimetría de la membrana, la incorporación de proteínas de transmembrana, y la encapsulación de material. Esta técnica se puede aplicar para estudiar una variedad de sistemas biológicos en los que se desean biomoléculas compartimentadas.
El objetivo general de este procedimiento es generar vesículas bicapa de fosfolípidos con un mayor control sobre la membrana, la unla, la molaridad, la monodispersión y el contenido interno. Usando cad, se fabrica una cámara a partir de láminas acrílicas y caucho natural. Se produce una bicapa lipídica en suspensión cargando la cámara con lípidos y solución.
A continuación, se instala una inyección de tinta que contiene la solución que se va a encapsular con el aparato de inyección. Una vez que se han establecido los ajustes adecuados, los pulsos de fluido inyectados producirán vesículas de bicapa lipídica. En última instancia, la inyección microfluídica produce vesículas bicapa monodispersas repetibles.
La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes como la electroformación, la emulsión o la generación de gotas, es el mayor nivel de control de la membrana, la molaridad unilateral, la monodispersión y el contenido interno. La demostración del procedimiento estará a cargo de Johanna Harrow, una estudiante de posgrado de un laboratorio y la asistencia será Kara Patel, una estudiante de pregrado que utilizará el software CAD. Utilizando software CAD, dibuje una forma para la cámara que se puede hacer de acrílico usando un primer taladro de corte láser, un orificio de 16 pulgadas a través de orificios en ambos lados de la cámara acrílica ensamblada. Que drenará hasta el pozo en forma de infinito.
En segundo lugar, corta un pequeño rectángulo con unas tijeras de una lámina acrílica de 0,2 milímetros para que sirva como parte inferior de la hoja con forma de infinito. Asegúrelo en su lugar con un adhesivo de secado rápido, asegurándose de que el pegamento no entre en contacto con las áreas de visualización. La lámina acrílica debe quedar al ras de la pared de la cámara y fijarse al fondo de la cámara.
En tercer lugar, use adhesivo de secado rápido para pegar una pieza delgada de lámina de caucho natural sobre los orificios perforados. Presiónelos en su lugar con pinzas. Pruebe todas las costuras pegadas en busca de fugas.
No debería haber ninguno. Por último, con una aguja de calibre 23, haga agujeros en la goma a través de los agujeros perforados, la punta de inyección de tinta piezoeléctrica se insertará a través de estos agujeros. Los fosfolípidos reservados deben disolverse en cloroformo y almacenarse a menos 20 grados centígrados.
D-P-H-P-C o DOPC. En esta demostración se utilizan lípidos. Los lípidos disueltos en cloroformo se transfieren a un vial de vidrio mientras se sostiene el vial en ángulo, seque suavemente los lípidos bajo argón o gas nitrógeno.
A continuación, coloque el vial con la tapa ligeramente floja al vacío durante una o dos horas para eliminar el disolvente residual. También se puede usar un desecado para este paso. Ahora solubilice los lípidos en la cubierta final para obtener una concentración final de lípidos de 25 miligramos por mililitro.
Vortex, la solución. Selle brevemente la tapa con param y luego sonique durante 15 minutos. Almacene esta solución a menos 20 grados centígrados.
A continuación, prepare una solución de sacarosa calzada con osmolaridad similar a la fisiológica. Esta es la solución de chorro. Considere agregar una gota de colorante alimentario oscuro o perlas fluorescentes a la solución para agregar contraste o fluorescencia.
Cargue la solución de sacarosa en una jeringa de un mililitro para eliminar el aire atrapado. Agite la jeringa para que las burbujas suban a la abertura del señuelo y puedan ser expulsadas. A continuación, conecte un filtro de 33 milímetros y 0,22 micras a la jeringa y expulse una gota a través del filtro.
Ahora desenrosque el adaptador de señuelo hembra de la inyección de tinta y presiónelo en el extremo del filtro. Expulse un poco de líquido para eliminar el aire atrapado. Por último, coloque la jeringa en la parte superior del líquido de inyección de tinta.
Debe viajar hasta la punta de inyección de tinta si la jeringa se ha colocado correctamente. En primer lugar, monte el conjunto de la jeringa en la platina del microscopio y conecte el controlador de inyección de tinta para este experimento. La platina y la jeringa necesitan un control independiente, ya que la platina y la jeringa se mueven en tres dimensiones para su visualización.
Configura una cámara de alta velocidad capaz de alcanzar al menos 1000 fotogramas por segundo. Configúrelo para usar la activación automática basada en imágenes para iniciar grabaciones. Ahora, asegure la cámara a la plataforma con cinta adhesiva y alinee cuidadosamente la punta de inyección de tinta con el orificio hecho en la lámina de goma en el costado de la cámara.
Primero, ajuste a ojo y luego haga ajustes finos con el microscopio. Una vez alineada, retroceda la jeringa a lo largo de una dimensión para cargar la jeringa en forma de infinito. A continuación, aplique una suave presión al émbolo, de modo que se forme una gota en la boquilla.
Esto proporciona cierta contrapresión inicial. Es necesario configurar los parámetros de inyección. A continuación, los valores específicos para una onda bipolar trapezoidal se presentan en la pantalla, el voltaje aplicado y el número de pulsos de chorro por tamaño de vesícula de control de disparo.
Ahora cargue la cámara con 25 a 30 microlitros de la solución lipídica al final de la década, cubriendo toda la superficie de la forma infinita. Bueno, entonces a cada uno, agregue 25 microlitros de solución de glucosa al borde más externo pipeteando lenta y suavemente, la glucosa no debe mezclarse con la solución lipídica. En 10 minutos, se formará una bicapa lipídica en el centro de la cámara.
La configuración de la bicapa es el paso más crítico, ya que la bicapa es inestable y puede romperse dependiendo de la preparación. Sé paciente. Funcionará una vez que practiques llenar la cámara unas cuantas veces.
Ahora, vuelva a insertar con cuidado la punta de inyección de tinta en la cámara cuando la punta esté a menos de 200 micras de la interfaz de gotas. Bicapa, inicie el proceso de inyección y registre los datos utilizando la inyección de tinta que proporcionó información sobre el proceso de generación de vesículas. Por ejemplo, la variación de la distancia entre la boquilla de inyección de tinta y la bicapa lipídica afectó a la fuerza que deforma la membrana. Cerrar.
La proximidad a la bicapa enfocó la corriente en chorro y evitó que la membrana dispersara la energía lejos del punto de generación de vesículas. Además, el recorrido del vórtice aumentaba con el voltaje aplicado al actuador eléctrico pizo. La formación de vesículas se visualizó como una secuencia de eventos después de su formación.
La estabilidad de las vesículas tendió a variar con el diámetro de la vesícula, siendo las vesículas más pequeñas más estables. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar vesículas violadoras de lípidos mediante chorro microfluídico.
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Descripción general
Este artículo analiza un método para generar vesículas de bicapas fosfolipídicas utilizando microflujo de inyección contra una bicapa de lípidos de interfase de gotas. La técnica permite un control preciso sobre la asimetría de la membrana, la incorporación de proteínas transmembrana y el encapsulado de materiales.
Componentes Clave del Estudio
Área de la Ciencia
- Neurociencia
- Biofísica
- Biotecnología
Antecedentes
- Las vesículas de bicapas fosfolipídicas son esenciales para estudiar biomoléculas compartimentadas.
- Las técnicas de microflujo mejoran la reproducibilidad y el control de la formación de vesículas.
- La comprensión de las propiedades de la membrana es crucial para diversas aplicaciones biológicas.
- La tecnología de inyección puede optimizar el proceso de generación de vesículas.
Propósito del Estudio
- Generar vesículas con características de membrana controladas.
- Facilitar la incorporación de proteínas específicas en la bicapa.
- Permitir el encapsulado de diversos materiales para fines de investigación.
Métodos Utilizados
- Fabricación de una cámara a partir de láminas de acrílico y caucho natural.
- Producción de una bicapa de lípidos suspendida mediante la carga de la cámara con lípidos y solución.
- Configuración de un aparato de inyección de tinta para el encapsulado de soluciones.
- Establecimiento de configuraciones adecuadas para los pulsos de fluido inyectado para crear vesículas.
Resultados Principales
- La microinyección produce vesículas de bicapas repetibles y monodispersas.
- El método permite un control preciso sobre las propiedades de las vesículas.
- El encapsulado de materiales se logra de manera efectiva.
- Las vesículas pueden adaptarse para diversos estudios biológicos.
Conclusiones
- La microinyección es una técnica confiable para la generación de vesículas.
- Se mejora el control sobre la asimetría de la membrana y la incorporación de proteínas.
- Este método tiene implicaciones significativas para el estudio de biomoléculas compartimentadas.
Preguntas Frecuentes
Executive Industry Relevance
Microfluidic jetting enables precise control over lipid bilayer vesicle generation, supporting reproducible production of giant unilamellar vesicles (GUVs) with defined membrane composition and encapsulation capacity. This capability addresses a key challenge in synthetic biology and drug delivery research by providing a tunable platform for modeling cellular systems and testing bioactive compounds. The method enhances predictive confidence in early-stage target validation by allowing systematic interrogation of membrane-dependent processes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through controlled membrane asymmetry and transmembrane protein incorporation.
- Operational Value: Supports functional target validation by generating reproducible vesicle systems for pathway clarification.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by providing quantitative readouts on lipid-protein interactions and encapsulation efficiency.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by producing mono-dispersed vesicles with tunable size and internal content.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through precise jetting parameters that control vesicle formation.
- Screening Readiness: Highlights platform scalability and reuse for reliable compound evaluation across multiple conditions.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Discusses disease relevance through the use of physiological-like osmolarity solutions and fluorescent tracking for vesicle monitoring.
- Preclinical Alignment: Describes continuity from discovery through preclinical validation by enabling encapsulation of therapeutic candidates for stability and release studies.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports decision-making by providing measurable outputs on vesicle stability and diameter-dependent performance.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing to lead identification, particularly in assays requiring controlled membrane environments and encapsulated compound delivery.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing by enabling systematic variation of lipid composition and transmembrane protein incorporation to clarify pathway dependencies.
- Screening: Describes assay readiness through the generation of mono-dispersed vesicles that ensure consistent compound exposure and reproducible readouts.
- Analytics: Highlights quantitative measurements such as vesicle size, formation rate, and encapsulation efficiency that help teams compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity by enabling encapsulation of drugs or biomolecules for stability testing and release profiling.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability rather than a single-use technique, adaptable across multiple projects requiring synthetic vesicle platforms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in membrane-related mechanisms.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of vesicle production for high-throughput applications.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early de-risking of delivery mechanisms.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on vesicle performance data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidics, lipid handling, and microscopy for chamber assembly and bilayer formation.
- Depends on instrumentation including piezo-actuated inkjet devices, high-speed cameras, and vacuum drying systems.
- Necessitates cross-team standardization of lipid solutions, jetting parameters, and chamber alignment procedures.
- Involves adaptation considerations for different lipid types, transmembrane proteins, and encapsulation agents across model systems.
- Includes practical limitations such as bilayer instability during setup and sensitivity to environmental vibrations during jetting.
