Name: Un imitador del microambiente tumoral: Un método simple para generar poblaciones de células enriquecido y Comunicación intercelular Investigando (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Aprende un método de cocultivo in vitro para imitar el microambiente tumoral, enriquecer poblaciones celulares y estudiar la comunicación intercelular sin estrés por marcaje fluorescente.

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Esta investigación fue apoyada por subvenciones de la Comisión de Investigación del Cáncer de Nueva Jersey (Beca Predoctoral DFHS13PPCO17), los Institutos Nacionales de Salud (CA049062) y la Administración Nacional de Aeronáutica y del Espacio (NNX15AD62G).

Los autores declaran que no tienen intereses en competencia o en conflicto.

El protocolo descrito aquí es un simple, adaptable en procedimiento in vitro (Figura 1) que utiliza un inserto de membrana microporosa permeable para generar poblaciones de células individuales altamente enriquecido de un co-cultivo de células heterotípicos. De manera significativa, el modelo es adecuado para la investigación de diversos medios de comunicación intercelular. Los pasos críticos incluyen la selección de la pieza de inserción de tamaño de poro apropiado para el interés exp...

El microambiente tumoral (TME) es un sistema altamente complejo compuesto de células de carcinoma que coexisten y evolucionar junto estroma huésped. Este componente estromal típicamente consiste en fibroblastos, miofibroblastos, células endoteliales, varios componentes inmunológicos, así como una matriz extracelular 1. Un constituyente importante, a menudo la mayoría de este estroma, son fibroblastos activados, refiere con frecuencia como fibroblastos asociados al cáncer o fibroblastos de carcinoma asociada (CAF) 2,3. A diferencia de los fibroblastos normales, no activado, CAF contribuyen a la iniciación del tumor, la progresión, la angiogénesis, invasión, metástasis y la recurrencia 4-11 en una amplia variedad de carcinomas, incluyendo cáncer de mama, próstata, pulmón, páncreas, piel, colon, esófago, y ovario 5,6,12-17. Sin embargo, la naturaleza exacta de la contribución de CAF en toda la patogénesis del cáncer sigue siendo mal definidos. Por otra parte, la evidencia clínica ha demostrado un valor pronóstico de la CAF, Correlacionando su presencia a los tumores malignos de alto grado, los fracasos terapéuticos, y pobres en general 10,18,19 pronóstico. Claramente, la mejora de nuestra comprensión de los sucesos iniciadores en el desarrollo de la CAF, así como las comunicaciones intercelulares que median su papel dentro de la TME, puede proporcionar emocionantes nuevas dianas terapéuticas y estrategias mejoradas que podrían mejorar los resultados del paciente. Hacia este objetivo, varios en vivo y en modelos in vitro han sido desarrollados. Si bien los métodos in vivo son más un reflejo de TME de los pacientes, poseen limitaciones, incluyendo la inmensa complejidad y heterogeneidad tanto dentro como entre los tumores. Por otra parte, las muestras tumorales procedentes de sujetos humanos a menudo representan muy desarrollados TME y no permiten una comprensión de los sucesos iniciadores TME. los estudios en animales experimentales ofrecen algunas ventajas, sin embargo, la generalización de los datos en animales a los seres humanos debe hacerse con precaución debido a las diferencias en physiology entre humanos y animales tales como roedores (por ejemplo, la química de tiol 20, la tasa metabólica 21, tolerancia al estrés 22, etc.). Además, a diferencia de la población humana, que es genéticamente heterogénea en la naturaleza, los animales de laboratorio son típicamente criados para la homogeneidad. Además, a menudo es difícil de examinar variaciones fisiológicas transitorios y los cambios del fenotipo de células, así como para el control de los parámetros experimentales específicos utilizando animales tales como roedores. Por lo tanto, 2- in vitro y modelos de cultivo de tejidos de 3 dimensiones (2D y 3D) son frecuentemente utilizados para avanzar en el conocimiento básico del desarrollo de TME. A pesar de su falta de una representación exacta de la complejidad de los sistemas in vivo, estos modelos ofrecen ventajas que facilitan en gran medida las investigaciones mecanicistas. Modelos in vitro permiten un análisis más simplificado, enfocado, y rentable de la TME, por lo que estadísticamente significativa los datos pueden ser generados encélulas libres de variaciones sistémicas que surgen en los animales. Hay varias variedades de sistemas in vitro. Los dos modelos TME in vitro utilizados más comúnmente consisten en monocapa mixta o cultivos celulares esferoides. Ambos métodos de cultivo son ventajosas para estudios básicos de interacciones intercelulares (por ejemplo, células normales con células tumorales) y para el análisis de varios cambios de fenotipo celular específicos TME (por ejemplo, la aparición de los fibroblastos asociados con el cáncer de fibroblastos normales). Además, los esferoides son capaces de crear una estructura similar a un tejido más reflexiva del TME, y pueden ser representativos de la heterogeneidad del tumor 23. Sin embargo esferoides menudo producen muy diversos gradientes de tensión de oxígeno a través de capas, que pueden complicar conclusiones experimentales 24. Desafortunadamente, ambos modelos son extremadamente limitados en su capacidad para aislar poblaciones de células puras para su posterior caracterización y estudio siguiente co-cultura. Para ello, sería necesario al menos un tipo de célula que ser marcado con fluorescencia-o etiquetados con un fabricante de identificación, y luego someter el co-cultivo mixto a la extensa procesamiento y clasificación de células para separar las poblaciones de células. Mientras que un clasificador de células es capaz de aislar una población de células en lugar puro, uno debe ser consciente de estrés celular y la contaminación microbiana riesgos potenciales 25. Para facilitar la comprensión de la comunicación intercelular, grandes esfuerzos se han dedicado a desarrollar y optimizar en sistemas in vitro que imitan estrechamente el entorno in vivo, al tiempo que permite un enfoque simplificado. Una de estas herramientas es la inserción microporosa permeable, un sustrato de membrana que fue desarrollado por primera vez en 1953 26 y posteriormente adaptado para diversas aplicaciones y estudios (por ejemplo, la polaridad celular 27, 28 endocitosis, transporte de drogas 29, el modelado de tejido 30, FERTilization 31, efecto espectador 32,33, etc.). Este sistema permite el crecimiento de las células con anatómica in vivo -como y la diferenciación funcional, así como la expresión de muchos en vivo marcadores 34,35 que no se observó cuando se cultivan en recipientes de plástico impermeable. Además, la membrana porosa extremadamente delgada (10 micras de espesor) permite la rápida difusión de las moléculas y los tiempos de equilibrio, que simula el entorno in vivo y permite el funcionamiento celular independiente en los dominios de células apical y basolateral. Una ventaja adicional de la utilidad de la inserción como un sistema de TME es su separación física de dos poblaciones de células cultivadas heterotípicos a cada lado de la membrana en las mismas condiciones ambientales, mientras que el mantenimiento de los diversos modos de comunicación intercelular a través de los poros de la membrana. Aunque físicamente separados, las dos poblaciones de células se acoplan metabólicamente a través de elementos secretadas y, como dedescribe aquí, también a través de los canales de gap-unión. Además, mediante el mantenimiento de las piezas de inserción en la tensión de oxígeno in vivo parcial (PO 2), el modelo reduce las complicaciones de oxígeno y químicas gradientes observados en otros sistemas. Más bien, se aumenta la comprensión de los mecanismos naturales que controlan el TME. En particular, las dos poblaciones de células pueden ser fácilmente aislados con alta pureza, sin el etiquetado fluorescente y / o la clasificación de células después de períodos prolongados de co-cultivo. Aquí se describe un protocolo TME in vitro que consiste en células de carcinoma de mama humano y fibroblastos humanos cultivados, respectivamente, a ambos lados de un inserto de membrana microporosa permeable, pero todavía en continua comunicación bidireccional a través de los poros de la membrana. Se demuestra que mediante el uso de membranas con diferentes tamaños de poro, la contribución de un tipo específico de la comunicación intercelular (por ejemplo, factores secretados frente a uniones gap) para el desarrollode la TME pueden ser investigados.

<table><tbody><tr><td>For Cell Culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AG01522 (i.e., AG1522) fibroblasto diploide humano</td><td>Coriell</td><td>107661</td><td>Passage 8-13</td></tr><tr><td>MDA-MB-231-luc-D3H1 línea celular de adenocarcinoma de mama</td><td>PerkinElmer</td><td>119261</td><td>línea parental: ATCC (#HTB-26)</td></tr><tr><td>MDA-MB-231/GFP línea celular de adenocarcinoma de mama</td><td>Cell Biolabs</td><td>AKR-201</td><td></td></tr><tr><td>Medio esencial mínimo (MEM) de EagleCorning</td> <td>Cellgro</td><td>15-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS), Calificado</td><td>Sigma</td><td>F6178-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento de Corning Glutagro (200 mM L-alanil-L-glutamina)</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-015-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Solución de Penicilina Estreptomicina, 100x</td><td>Corning Cellgro</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Inserto Transwell (i.e., inserto de membrana microporosa permeable) (0.4 &mu; m poro)</td><td>Inserto Transwell Costar</td><td>3450</td><td></td></tr><tr><td>(i.e.e., inserto de membrana microporosa permeable) (1 &mu; m poro)</td><td>Greiner bio-one</td><td>657610</td><td></td></tr><tr><td>Inserto Transwell (i.e., inserto de membrana microporosa permeable) (3 &mu; m poro)</td><td>Costar</td><td>3452</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultivo de 6 pocillos</td><td>Greiner Bio-One Cellstar</td><td>657160-01</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 matraz de cultivo CellStar</td><td></td><td>658 170</td><td></td></tr><tr><td>solución salina tamponada con fosfato (PBS), 1x</td><td>Corning Cellgro</td><td>21-040-CV</td><td>sin calcio y magnesio</td></tr><tr><td>0,25% (vol/vol) Tripsina, 2,21 mM EDTA, 1x</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-053-CL</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga de 15 ml</td><td>CellTreat</td><td>229411</td><td></td></tr><tr><td>plato de cultivo celular de 35 mm x 10 mm</td><td>Greiner bio-one</td><td>627 160</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Para microscopía inmunofluorescente</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-Caveolin 1</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>610406</td><td>In situ Inmunofluorescencia - 1:5.000</td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario IgG (H+L) anti-ratón anti-ratón en cabra, conjugado Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11029</td><td>in situ Inmunofluorescencia - 1:2.000</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina - Fracción V</td><td>Rockland</td><td>BSA-50</td> Solución de formaldehído al 16% (peso/vol.) <td>libre de inmunoglobulinas y proteasas</td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>28908</td><td>Diluir al 4% con 1x PBS</td></tr><tr><td>Premium Cover Glass (22 mm x 22 mm No.1)</td><td>Fisher</td><td>12548B</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787-50ML</td><td></td></tr><tr><td>SlowFade Gold reactivo antidecoloración con DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>S36938</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>Para análisis de citometría >de</td><td></td><td></td><td></td> flujo</calceína</tr> <tr><td>fuerte,</td><td>Sondas moleculares</td> AM <td>C3100MP</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina equilibrada de Hanks (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14025-076</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo<</td><td>strong>Comments</td></tr><tr><td>For Western Blot Análisis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-Caveolin 1</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>610406</td><td>Western Blot - 1:1.000</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>BioRad</td><td>170-6531</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de nitrocelulosa (0,2 &mu; m)</td><td>BioRad</td><td>162-0112</td><td></td></tr><tr><td>Western Lightning Plus-ECL</td><td>PerkinElmer</td><td>NEL104001EA</td><td></td></tr><tr><td>BioRad DC Ensayo de proteínas BioRad</td><td></td><td>500-0116</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sodio (SDS)</td><td>BioRad</td><td>161-0302</td><td></td></tr><tr><td>Desoxicolato de sodio monohidratado (DOC)</td><td>Sigma</td><td>D5670</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630 (NP40)</td><td>Sigma</td><td>I8896</td><td></td></tr><tr><td>Solución de acrilamida/Bis al 30%, 37,5:1</td><td>BioRad</td><td>161-0158</td><td></td></tr></tbody></table>

un imitador del microambiente tumoral: un método simple para generar poblaciones de células enriquecido y comunicación intercelular investigando

A Mimic of the Tumor Microenvironment: A Simple Method for Generating Enriched Cell Populations and Investigating Intercellular Communication

La comprensión de las interacciones tempranas heterotípicos entre las células cancerosas y el estroma no canceroso que rodea es importante en el esclarecimiento de los acontecimientos que conducen a la activación del estroma y el establecimiento del microambiente tumoral (TME). Varios in vitro y en modelos in vivo de la TME se han desarrollado; Sin embargo, en general, estos modelos no permiten fácilmente el aislamiento de poblaciones de células individuales, en condiciones no perturbar, para su posterior estudio. Para evitar esta dificultad, se ha empleado un modelo TME in vitro usando un sustrato de crecimiento de las células que consta de un inserto de membrana microporosa permeable que permite la generación sencilla de poblaciones de células altamente enriquecido crecido íntimamente, sin embargo, por separado, a cada lado de la membrana de la pieza de inserción para co extendida -Cultura veces. Mediante el uso de este modelo, que somos capaces de generar fibroblastos enormemente enriquecido asociada al cáncer (CAF) las poblaciones de fibroblastos humanos diploides normales siguienteco-cultivo (120 horas) con células de carcinoma de mama humano altamente metastásicas, sin el uso de marcado fluorescente y / o la clasificación de células. Además, mediante la modulación del tamaño de poro de la inserción, se puede controlar para el modo de comunicación intercelular (por ejemplo, comunicación brecha cruce, factores secretados) entre las dos poblaciones de células heterotípicos, que permite la investigación de los mecanismos subyacentes al desarrollo de la TME, incluyendo el papel de la permeabilidad brecha de la salida. Este modelo sirve como una herramienta valiosa en la mejora de la comprensión de los eventos iniciales que conducen a la iniciación del cáncer de estroma, la evolución temprana de la TME, y el efecto de modulación del estroma en las respuestas de las células cancerosas a los agentes terapéuticos.

Aquí hemos adaptado un inserto de membrana microporosa permeable para desarrollar un sistema de células de co-cultivo heterotípicos in vitro que imita el microambiente tumoral in vivo (Figura 1). Este sistema permite que dos poblaciones diferentes de células que se cultivan en cada lado de la membrana porosa de la pieza de inserción para largos períodos de tiempo (hasta 120 horas, en el uso). Es importante destacar que el sistema es capaz de mantener la...

Adaptamos un inserto de membrana microporosa permeable para imitar el microambiente tumoral (TME). El modelo consiste en un cultivo celular mixto, permite la generación simplificada de poblaciones celulares individuales altamente enriquecidas sin utilizar el marcaje fluorescente o la clasificación celular, y permite estudiar la comunicación intercelular dentro del TME en condiciones normales o de estrés.

Un imitador del microambiente tumoral: Un método simple para generar poblaciones de células enriquecido y Comunicación intercelular Investigando

Understanding the early heterotypic interactions between cancer cells and the surrounding non-cancerous stroma is important in elucidating the events ...

El objetivo general de este sencillo modelo de cocultivo in vitro es imitar las características de un microentorno tumoral in vivo, enriquecer poblaciones celulares individuales e investigar diversos modos de comunicación intercelular. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la oncología y la radiobiología, específicamente relacionadas con los factores subyacentes a la generación de fibroblastos asociados al cáncer y las respuestas a agentes terapéuticos. La principal ventaja de esta técnica es que permite obtener poblaciones celulares individuales a partir de un cultivo celular mixto sin necesidad de etiquetado fluorescente que induzca estrés ni de clasificación celular.Comience por lavar dos veces la cultura celular de interés con cinco mililitros de PBS. Después del segundo lavado, desprenda las células con un mililitro de tripsina-EDTA a temperatura ambiente durante dos minutos. A continuación, detenga la reacción con nueve mililitros de medio de crecimiento completo, pipeteando suavemente el medio sobre la superficie del frasco 10 veces para disociar las células.Después de contar, diluya las células hasta una concentración de 2,5 veces 10 a la quinta células por mililitro en medio fresco y transfiera las células a un tubo cónico estéril de 15 mililitros. Centrifugue las células para sedimentarlas y resuspenda el precipitado en medio de crecimiento fresco suplementado con 50 % de suero bovino fetal, a una concentración de 2,5 veces 10 a la quinta células por 70 microlitros de medio. A continuación, transfiera los insertos con el tamaño de poro experimental adecuado desde su empaque a pozos individuales de una placa de múltiples pozos y tape la placa.Luego, sosteniendo el recipiente con ambas manos, invierta suavemente el recipiente hasta que las bases de los insertos queden orientadas hacia arriba. Retire la base del recipiente. Usando pinzas estériles en una mano, sostenga un inserto en su lugar y utilice la otra mano para aspirar lentamente 70 microlitros de células en una punta de micropipeta.Luego, distribuya lentamente las células a través de la superficie de lo que ahora es el lado superior del inserto. Después de sembrar cada uno de los insertos, reemplace cuidadosamente la base de la placa e incube la placa invertida a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono con humedad durante 30 a 45 minutos. Al final de la incubación, en una cabina de flujo laminar con seguridad biológica, invierta cuidadosamente la placa de nuevo, de modo que las bases de los insertos queden ahora orientadas hacia abajo.Luego, sumerja lenta y cuidadosamente la parte inferior de cada inserto en dos mililitros de medio completo precalentado, y regrese el recipiente al incubador humedecido. Después de 48 horas, reemplace el medio en la parte inferior de cada pocillo con dos mililitros de medio de crecimiento fresco. Cuando se haya renovado todo el medio, siembre 2,5 veces 10 a la quinta células de la segunda población de interés sobre la parte superior de los insertos en un mililitro de medio fresco, y devuelva el recipiente al incubador.24, 48 y 96 horas después, reemplace el medio en la parte superior de cada inserto con un mililitro de medio completo fresco, y el medio en la parte inferior de cada pocillo con dos mililitros de medio completo fresco. Después de 120 horas de cocultivo, transfiera un inserto a la vez a placas individuales de cultivo celular de 35 milímetros que contengan un mililitro de PBS.Lave las partes inferior y superior de los insertos con un mililitro de PBS. Para recolectar las células cultivadas en la parte inferior del inserto, coloque los insertos con la parte inferior hacia abajo en 200 microlitros de tripsina-EDTA a temperatura ambiente. Después de dos minutos a temperatura ambiente, detenga la reacción con 800 microlitros de medio de crecimiento completo.Luego, sosteniendo el inserto en un ángulo ligero, pipetee suavemente el sobrenadante sobre la superficie de las células 10 veces, recogiendo las células en la placa. Cuando todos los insertos hayan sido procesados, resuspenda las células a una concentración de dos por diez a la quinta células por mililitro de medio de crecimiento. Y agregue 250 microlitros de células sobre cubreobjetos de vidrio estériles individuales.Coloque los cubreobjetos en la incubadora humidificada durante una hora. Al final de la incubación, en un gabinete de seguridad biológica de flujo laminar, agregue cuidadosamente dos mililitros de medio de crecimiento completo al recipiente e incube a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono con humedad durante 48 horas. Luego lave las células tres veces con PBS.Después del tercer lavado, fije las células en formaldehído al 4% en PBS durante diez minutos a temperatura ambiente, seguido de cinco lavados con solución salina tamponada con Tris. Después del último lavado, permeabilice las células con Triton X-100 al 0,25% suplementado con saponina al 0,1 durante cinco minutos a temperatura ambiente, seguido de la incubación en solución bloqueante durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, marque las muestras con el anticuerpo primario de interés en la solución bloqueante a cuatro grados Celsius durante la noche.A la mañana siguiente, retire el anticuerpo no unido mediante lavados de tres minutos en solución de lavado, seguidos por una incubación de una hora a temperatura ambiente con el anticuerpo secundario apropiado en solución bloqueadora. Al final de la incubación, lave el anticuerpo secundario no unido tal como se acaba de indicar y monte las laminillas sobre portaobjetos individuales con medio de montaje antifade que contenga DAPI. Selle los bordes de las laminillas con esmalte de uñas transparente.Luego, observe las células con un aumento de 63x con inmersión en aceite en un microscopio invertido equipado con una fuente de luz externa para la excitación de fluorescencia. Este sistema permite cultivar dos poblaciones celulares diferentes en cada lado de las membranas porosas de los insertos para cultivo celular durante al menos 120 horas, manteniendo una pureza superior al 99 % en las poblaciones celulares de cada lado de la membrana, cuando se utilizan insertos con poros de 0,4 o un micrón. Sin embargo, los insertos con poros de tres micrones son lo suficientemente grandes como para permitir que las células migren a través de la membrana, tal como se observó en este experimento utilizando una línea celular de cáncer de mama humano positiva para GFP.Los insertos con poros de 0,4 micrones también limitan la formación de uniones en hendidura funcionales entre los cultivos celulares en ambos lados del inserto, restringiendo la comunicación a factores secretados. Sin embargo, los insertos con poros de uno y tres micrones permiten el acoplamiento funcional de las células a través de las uniones en hendidura, como se indica por la transferencia de la marca fluorescente a través de la membrana en estos cultivos en cocultivo. Importante, este sistema puede utilizarse para generar eficazmente fibroblastos asociados al cáncer a partir de fibroblastos diploides humanos normales tras su cocultivo con células de cáncer de mama, tal como lo demuestra la reducida expresión de caveolina-1 en los fibroblastos en cocultivo con las células de cáncer de mama humanas.Al realizar este procedimiento, es importante seleccionar insertos con un tamaño de poro adecuado para la pregunta que se está investigando. Y observar la primera población celular en la cara inferior del inserto en un medio que facilite su adhesión. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como inmunotransferencia, inmunofluorescencia in situ, o la mayoría de los demás ensayos celulares para responder preguntas adicionales sobre alteraciones en la expresión proteica, cambios en la invasión y migración o diferencias en las respuestas a agentes terapéuticos.Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología del cáncer y la biología de la radiación exploraran los factores que contribuyen al desarrollo, la evolución del microambiente tumoral y, en nuestro caso, a la propagación de los efectos nocivos de la radiación ionizante desde las células irradiadas hacia las células vecinas no irradiadas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar una cocultivo celular mixto, mantener el cocultivo y obtener poblaciones celulares enriquecidas de alta pureza a partir del cocultivo para su posterior análisis. No olvide que trabajar con cepas o líneas celulares humanas puede ser peligroso y que se debe usar el equipo de protección personal adecuado y cumplir con las regulaciones de bioseguridad correspondientes durante la realización de este procedimiento.Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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