Un imitador del microambiente tumoral: Un método simple para generar poblaciones de células enriquecido y Comunicación intercelular Investigando
September 20th, 2016
Adaptamos un inserto de membrana microporosa permeable para imitar el microambiente tumoral (TME). El modelo consiste en un cultivo celular mixto, permite la generación simplificada de poblaciones celulares individuales altamente enriquecidas sin utilizar el marcaje fluorescente o la clasificación celular, y permite estudiar la comunicación intercelular dentro del TME en condiciones normales o de estrés.
El objetivo general de este sencillo modelo de cocultivo in vitro es imitar las características de un microambiente tumoral in vivo, enriquecer las poblaciones celulares individuales e investigar varios modos de comunicación intercelular. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos del cáncer y la radiobiología, específicamente con respecto a los factores subyacentes a la generación de fibroblastos asociados al cáncer y las respuestas a los agentes terapéuticos. La principal ventaja de esta técnica es que permite la generación de poblaciones celulares individuales a partir de un cultivo celular mixto sin que induzca estrés, etiquetado de fluorescencia o clasificación de células.
Comience lavando el cultivo celular de interés dos veces con cinco mililitros de PBS. Después del segundo lavado, separe las celdas con un mililitro de tripsina-EDTA a temperatura ambiente durante dos minutos a temperatura ambiente. A continuación, apague la reacción con nueve mililitros de medio de crecimiento completo, pipeteando suavemente el medio sobre la superficie del matraz 10 veces para disociar las células.
Después de contar, diluya las células a una concentración de 2,5 veces 10 a la quinta célula por mililitro en medio fresco y transfiera las células a un tubo de centrífuga estéril de 15 mililitros. Centrifugar las células y resuspender el pellet en un medio de crecimiento fresco suplementado con un 50% de suero fetal bovino a 2,5 veces 10 a la quinta célula por 70 microlitros de concentración media. A continuación, transfiera los insertos del tamaño de poro experimental adecuado de su envase a los pocillos individuales de un plato de pocillos múltiples y cubra el plato.
Luego, sosteniendo el plato con ambas manos, invierta suavemente el plato hasta que la parte inferior del inserto quede hacia arriba. Retira el fondo del plato. Con pinzas estériles en una mano, sostenga un inserto en su lugar y use la otra mano para aspirar lentamente 70 microlitros de células en la punta de una micropipeta.
A continuación, dispense lentamente las células por la superficie de lo que ahora es la parte superior del inserto. Después de sembrar cada uno de los insertos, vuelva a colocar con cuidado el fondo del plato e incube el plato invertido a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono con humedad durante 30 a 45 minutos. Al final de la incubación, en una cabina de seguridad biológica de flujo laminar, reinvierta cuidadosamente el plato de modo que la parte inferior de los insertos quede hacia abajo.
A continuación, sumerja lenta y cuidadosamente el fondo de cada inserto en dos mililitros de medio completo precalentado y vuelva a colocar la placa en la incubadora humidificada. Después de 48 horas, reemplace el medio en el fondo de cada pocillo con dos mililitros de medio de crecimiento fresco. Cuando se haya enfriado todo el medio, siembre 2,5 veces 10 en la quinta celda de la segunda población de interés en la parte superior de los insertos en un mililitro de medio fresco y devuelva la placa a la incubadora.
24, 48 y 96 horas después, reemplace el medio en la parte superior de cada inserto con un mililitro de medio completo fresco. Y el medio en el fondo de cada pocillo con dos mililitros de medio completo fresco. Después de 120 horas de cocultivo, transfiera un inserto a la vez a placas individuales de cultivo celular de 35 milímetros que contengan un mililitro de PBS.
Y lave la parte inferior y superior de los insertos con un mililitro de PBS. Para recoger las células cultivadas en la parte inferior del inserto, coloque los insertos con la parte inferior hacia abajo en 200 microlitros de tripsina-EDTA a temperatura ambiente. Después de dos minutos a temperatura ambiente, detenga la reacción con 800 microlitros de medio de crecimiento completo.
Luego, sosteniendo el inserto en un ligero ángulo, pipetee suavemente el sobrenadante sobre la superficie de las células 10 veces, recogiendo las células en la placa. Cuando se hayan quitado todos los insertos, vuelva a suspender las células a una concentración de dos veces 10 a la quinta célula por mililitro de medio de crecimiento. Y agregue 250 microlitros de células en cubreobjetos de vidrio individuales estériles.
Coloque los cubreobjetos en la incubadora humidificada durante una hora. Al final de la incubación, en una cabina de seguridad biológica de flujo laminar, agregue cuidadosamente dos mililitros de medio de crecimiento completo al plato e incube a 37 grados centígrados y 5% por ciento de dióxido de carbono con humedad durante 48 horas. A continuación, lave las células tres veces con PBS.
Después del tercer lavado, fije las células en formaldehído al 4% en PBS durante diez minutos a temperatura ambiente, seguido de cinco lavados con solución salina tamponada con Tris. Después del último lavado, permeabilizar las células con Triton X-100 al 0,25% suplementado con saponina al 0,1 durante cinco minutos a temperatura ambiente, seguido de la incubación en solución de bloqueo durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, etiquete las muestras con el anticuerpo primario de interés en la solución bloqueante a cuatro grados centígrados durante la noche.
A la mañana siguiente, retire el anticuerpo no unido con lavados de tres minutos en solución de lavado, seguidos de una incubación a temperatura ambiente de una hora en el anticuerpo secundario apropiado en solución de bloqueo. Al final de la incubación, lave el anticuerpo secundario no unido como se acaba de demostrar y monte los cubreobjetos en portaobjetos individuales con un medio de montaje antidecoloración que contenga DAPI. Selle los bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas transparente.
A continuación, obtenga imágenes de las células con un aumento de aceite de 63x en un microscopio invertido equipado con una fuente de luz externa para la excitación de fluorescencia. Este sistema permite cultivar dos poblaciones celulares diferentes a cada lado de las membranas porosas de los insertos de cultivo celular durante al menos 120 horas, manteniendo una pureza superior al 99% en las poblaciones celulares a ambos lados de la membrana, cuando se utilizan insertos con poros de 0,4 o una micra. Sin embargo, los insertos con poros de tres micras son lo suficientemente grandes como para permitir que las células migren a través de la membrana, como se observó en este experimento utilizando una línea celular de cáncer de mama humano GFP positivo.
Los insertos de poro de 0,4 micras también limitan la formación de uniones de brecha funcionales entre los cultivos celulares a ambos lados del inserto, lo que restringe la comunicación a los factores secretados. Sin embargo, los insertos con poros de una y tres micras permiten el acoplamiento funcional de las células a través de las uniones de brecha, como lo indica la transferencia de la etiqueta fluorescente a través de la membrana en estos cocultivos. Es importante destacar que este sistema se puede utilizar para generar eficazmente fibroblastos asociados al cáncer a partir de fibroblastos diploides humanos normales después de su cocultivo con células de cáncer de mama, como lo demuestra la expresión reducida de caveolina-1 en los fibroblastos cocultivados con las células de cáncer de mama humano.
Al intentar este procedimiento, es importante seleccionar insertos con un tamaño de poro adecuado para la pregunta que se está explorando. Y ver la primera población de células en la parte inferior del inserto en medio que facilita su fijación. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la inmunotransferencia, la inmunofluorescencia in situ o la mayoría de los otros ensayos basados en células para responder preguntas adicionales sobre las alteraciones de la expresión de proteínas, los cambios en la invasión y la migración o las diferencias en las respuestas a los agentes terapéuticos.
Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología del cáncer y la biología de la radiación exploraran los factores que contribuyen al desarrollo, la evolución del microambiente tumoral y, en nuestro caso, a la propagación de los efectos nocivos de la radiación ionizante desde las células objetivo con radiación a las células transeúntes en las cercanías. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo preparar un cocultivo de células mixtas, mantener el cocultivo y cosechar poblaciones de células enriquecidas de alta pureza del cocultivo para su posterior análisis. No olvide que trabajar con cepas de células humanas o líneas celulares puede ser peligroso y que se debe usar el equipo de protección personal adecuado y se deben cumplir las normas de bioseguridad adecuadas mientras se realiza este procedimiento.
Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.
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Visión general
Este estudio presenta un modelo simple de cocultivo in vitro diseñado para replicar el microambiente tumoral (MET). El modelo facilita el enriquecimiento de poblaciones celulares individuales y permite la investigación de la comunicación intercelular bajo diversas condiciones.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Biología del cáncer
- Radiobiología
- Técnicas de cultivo celular
Fundamentos
- El microambiente tumoral juega un papel crucial en la progresión del cáncer.
- Entender la comunicación intercelular es vital para los avances terapéuticos.
- Los métodos tradicionales a menudo implican técnicas que generan estrés.
- Este estudio tiene como objetivo simplificar el proceso de estudio de las interacciones celulares.
Propósito del estudio
- Imitar las características in vivo del MET.
- Enriquecer poblaciones celulares individuales a partir de cultivos mixtos.
- Investigar modos de comunicación intercelular.
Métodos utilizados
- Utilización de un inserto de membrana microporosa permeable.
- Enfoque de cultivo celular mixto.
- Desprendimiento de células usando tripsina-EDTA.
- Inactivación de la reacción con medio de crecimiento completo.
Resultados principales
- Generación exitosa de poblaciones celulares individuales enriquecidas.
- Facilitación de estudios de comunicación intercelular.
- Reducción del estrés asociado con el marcado fluorescente.
- Conocimientos sobre el comportamiento de los fibroblastos asociados al cáncer.
Conclusiones
- El modelo imita efectivamente el MET.
- Proporciona una herramienta valiosa para la investigación del cáncer.
- El método mejora la comprensión de las interacciones celulares en el cáncer.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
This in vitro tumor microenvironment model enables biopharma R&D teams to study early cancer-stroma interactions without perturbing cell physiology, supporting mechanistic de-risking in target validation. By generating highly enriched cancer-associated fibroblast populations and controlling intercellular communication modes, the method provides quantitative insights into stromal modulation of tumor behavior and therapeutic response. It addresses a critical gap in preclinical models by allowing isolation of viable, functional cell populations for downstream analysis, thereby improving predictive confidence in early discovery stages.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by elucidating heterotypic signaling between carcinoma cells and stromal precursors.
- Operational Value: Supports biological de-risking through functional validation of stromal targets without fluorescent tagging or cell sorting artifacts.
- Predictive Value: Enhances portfolio triage by identifying stromal mediators that influence cancer cell responses to therapeutic agents.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for compound screening by maintaining physiologically relevant co-culture conditions over extended periods.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through controlled pore-size selection that defines communication modes (secreted factors vs. gap-junction).
- Scalability: Enables platform reuse across multiple cancer-stroma pairings for consistent intercellular communication studies.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease relevance by modeling early TME evolution using human breast carcinoma and normal diploid fibroblasts.
- Operational Value: Provides continuity from discovery to preclinical validation by yielding harvestable, high-purity cell populations for protein expression, migration, and drug response assays.
- Risk-Adjusted Decisions: Supports advancement criteria by quantifying stromal impact on tumor cell behavior under therapeutic pressure.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, particularly for stroma-modulating therapeutics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling controlled co-culture of cancer and stromal cells to isolate communication-dependent phenotypes.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs via enriched cell populations suitable for immunoblotting, immunofluorescence, and functional assays after 120-hour co-culture.
- Analytics: Generates measurable readouts such as caveolin-1 downregulation in fibroblasts, enabling statistical comparison of stromal activation states.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by providing stromal cells that reflect in vivo-like activation states for drug response studies.
- Enterprise Reuse: Functions as a modular platform adaptable to various cancer types and stromal lineages, reducing redundant model development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in cancer-stroma signaling.
- Operational Value: Delivers standardization and scalability through defined pore-size parameters and stress-free cell harvesting.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by revealing stromal-mediated resistance or sensitivity early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on their modulation by tumor-associated stroma.
Implementation Considerations
- Requires expertise in sterile cell culture techniques and microporous membrane handling.
- Depends on access to multi-well dishes, cell culture inserts with defined pore sizes (0.4, 1, 3 μm), and standard incubation equipment.
- Necessitates cross-team standardization of co-culture duration, medium composition, and insert orientation for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when extending to non-fibroblastic stromal cells or alternative cancer models.
- Limited by the inability to study direct cell migration unless using inserts with pore sizes ≥3 μm, as smaller pores restrict physical cell movement.
