Name: Fagosoma Migración y velocidad medida en vivo primaria macrófagos humanos infectados con VIH-1 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Aprende a medir la velocidad de fagosomas en macrófagos humanos infectados con VIH-1 mediante microscopía confocal de disco giratorio. Este método permite analizar la dinámica celular durante infecciones virales.

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Agradecemos al Dr. Jamil Jubrail por leer el manuscrito. Este trabajo ha contado con el apoyo de subvenciones del CNRS, el Inserm, la Université Paris Descartes, la Agence Nationale de la Recherche (2011 BSV3 025 02), la Fondation pour la Recherche Médicale (FRM DEQ20130326518 incluyendo una beca doctoral para GLB) y la Agence Nationale de Recherche sur le SIDA et les hépatites virales (ANRS, incluyendo una beca postdoctoral para CD) a FN. A. Dumas ha sido apoyado por becas doctorales de la Université Paris Descartes y Sidaction.

El protocolo tiene que ser llevado a cabo en estricta conformidad con las legislaciones nacionales e internacionales y reglamentos locales. La sangre de donantes sanos que dieron su consentimiento para donar sangre con fines de investigación se ha obtenido a partir de los centros de transfusión de sangre con la que las instituciones han firmado un acuerdo. protecciones especiales se deben tomar cuando se utiliza la sangre humana. Los experimentos con VIH-1 deberán efectuarse en un nivel de bioseguridad 3 o 2 (BSL-3 o 2) de laboratorio de acuerdo con la legislación local. 1. Preparación de macrófagos derivados de monocitos humanos (hMDMs) por centrifugación en gradiente de densidad y selección por adherencia <ol><li> Comience con la sangre fresca de donantes sanos (9 ml). Diluir todo el volumen de la sangre fresca con 1x estéril salina tamponada con fosfato (PBS) sin Ca2 + y Mg2 + para obtener un volumen final de 70 ml y añadir suavemente la sangre diluida en dos tubos de 50 ml cónicos (35 ml por tubo) , en la parte superior de 15 ml de unaeutral, muy ramificado, de gran masa, polisacárido hidrófilo en la solución ya está en cada tubo. </li><li> Centrifugar los dos tubos de sangre en 537 xg durante 20 min a 20 ° C sin freno. Luego recoger las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) contenidos en el anillo de células nublado en la interfase y transferirlos a un nuevo tubo de 50 ml que contiene 15 ml de 1x PBS sin Ca2 + y Mg2 +. </li><li> Centrifugar las células a 218 xg durante 5 min a 20 ° C y resuspender el precipitado en 45 ml de 1x PBS sin Ca2 + y Mg2 +. </li><li> Centrifugar las células a 218 xg durante 5 min a 20 ° C, resuspender el precipitado en 10 ml de 1x PBS sin Ca2 + y Mg2 +, y recuento de las células mediante la dilución a una dilución final de 1/200 en Trypan Blue. </li><li> Centrifugar las células a 218 xg durante 5 min a 20 ° C y resuspender el sedimento en medio RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 suplementado con 2 mM L-glutamina y 100 mg / ml Penicillin-estreptomicina tener 7 x 10 6 PBMCs por pocillo en 2 ml de medio en cada pocillo de una placa de pocillos 6. </li><li> Incubar las placas a 37 ° C con 5% de CO2 durante 2 hr. Después de 2 horas los monocitos se han adherido al plástico. </li><li> Para permitir aislados recién monocitos de diferenciarse en hMDMs, aspirar el medio y lo reemplazan con 2 ml HMDM medio (RPMI 1640, 10% descomplementado suero de ternera fetal (FCS), 2 mM de L-glutamina y 1% de penicilina-estreptomicina) suplementado con colonias de macrófagos factor estimulante (RHM-CSF) a una concentración final de 10 ng / ml. </li><li> Se incuban las células a 37 ° C con 5% de CO 2 durante 11 días (Figura 1). </li><li> En el día 11 se elimina el medio y se lava 2 veces con 2 ml de medio HMDM frío por pocillo. A continuación lavar cada pocillo 2 veces con 1 ml de PBS 1x frío. </li><li> Para separar hMDMs completamente diferenciadas, lavar cada vez que el pozo 1 con 1 ml de PBS frío 1x con ácido ethylenediaminetetraacetatic 2 mM (EDTA) e incubar las células en 2 ml de PBS frío 1x con EDTA 2 mM por pocillo durante 15 a 60 min a 4 ° C. NOTA: Los métodos alternativos para desprender las células existen (por ejemplo, tripsina o actividades similares a la tripsina) que podrían dar buenos resultados 11. </li><li> Después de la separación (terminado pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo en el pozo), recoger las células y los puso en un tubo de 50 ml en hielo que contiene 10 ml de medio HMDM frío. </li><li> Centrifugar las células a 218 xg durante 5 min a 20 ° C, resuspender el precipitado en 10 ml de medio HMDM frío y el recuento de las células mediante la dilución de 1/20 en Trypan Blue. </li><li> Sembrar las células a 1 x 10 6 hMDMs por microscopía de cristal del grado 35 mm placa de fondo y se incuban las placas a 37 ° C con 5% de CO 2 durante 1 día. </li></ol> 2. Producción y cuantificación de VIH-1 reservas virales NOTA: NLR4.3 VIH-1 Gag-IGFP (proteína verde fluorescente) que lleva un sobre R5-trópico, obsequio de M. Schindler 10 se usa para infectar a los macrófagos y para ver las células infectadas en tiempo real. <ol><li> Producir reservas virales mediante la transfección de las células humanas embrionarias de riñón 293T (2 x 10 6 en 100 mm de plato) con 6 g de ADN proviral correspondiente usando un reactivo de transfección comercial. </li><li> Cuantificar la infectividad de las reservas de virus usando las células indicadoras HeLa TZM-bl (que llevan el gen de ß-galactosidasa bajo el control del VIH-1 LTR) utilizando diluciones seriadas de las reservas de virus, seguido de una coloración ß-galactosidasa de las células y contando de células azules 12. </li></ol> 3. La infección de hMDMs con VIH-1 <ol><li> Añadir el virus a una multiplicidad de infección (MOI) 0,02 a 0,03 en 1 ml de medio de HMDM a hMDMs (células en placas en 1,13). Para los pocillos de control sólo añadir 1 ml de medio de HMDM e incubar los platos a 37 ° C con 5% de CO 2 durante 2 días (Figura 1). </li><li> En el día 2 se lavan las células con HMDM medIUM 3 veces y se añade 1 ml de medio fresco HMDM por plato. Se incuban las células a 37 ° C con 5% de CO 2 durante 6 días (Figura 1). </li></ol> 4. La opsonización de ovejas Glóbulos rojos <ol><li> Para la preparación de 7 x 10 6 SRBCs por placa, lavar los SRBC dos veces en 100 l de solución que contenía 0,1% albúmina de suero bovino (BSA) en PBS 1x con centrifugación a 600 xg durante 4 min. </li><li> Resuspender las SRBC lavadas en 500 l de 1x PBS / BSA 0,1% con IgG de conejo anti-SRBC a una concentración sub-aglutinantes por 5 l de SRBC y se incuba con la rotación a TA durante 30 min. NOTA: Para determinar la concentración sub-aglutinantes de IgG anti-SRBC, se preparan diluciones seriadas de la IgG (concentración de reserva a 13,1 mg / ml) a partir de 1/50 a 1 / 25.600 en 20 l en una placa de 96 pocillos. Añadir 2 x 10 6 SRBCs en 20 l en cada pocillo y colocar la placa en una habitación oscura durante varias horas. La concentración sub-aglutinante es ladilución de la bien justo antes de la aglutinación bien con (+ SRBCs IgG formación de una red). </li><li> Después de la rotación, centrifugar los eritrocitos de cordero-opsonized-IgG a 600 xg durante 4 minutos y se lava con 100 l de 1x PBS / BSA 0,1% con centrifugación a 600 g durante 4 min. </li><li> Resuspender las-SRBC opsonizadas-IgG en un medio de pre-calentado libre de rojo fenol RPMI suplementado con 2 mM L-glutamina y 1% de penicilina-estreptomicina (1 ml / placa). </li></ol> 5. Ensayo en vivo de la célula microscopía de vídeo fagocitosis <ol><li> Utilice un sistema de imagen confocal, tal como un sistema de disco giratorio equipado con una cámara de calentamiento a 37 ° C con CO 2 pasa a través de una botella con agua para la humidificación. </li><li> Encienda la cámara de calentamiento antes del experimento para tener la platina del microscopio a 37 ° C antes del comienzo del ensayo de fagocitosis. Encienda el microscopio y el ordenador, y cargar el software de imágenes. </li><li> Optimizar los ajustes de imagen como la velocidad de exploración, magnífication, la resolución, etc. para tener al menos una célula por campo y a la imagen un fotograma cada minuto entre 60 a 120 min. NOTA: En este caso, la muestra se forma la imagen de un marco de cada minuto durante 60 min con 63x lente. </li><li> Coloque el recipiente de formación de imágenes en la platina del microscopio. Ajustar el enfoque y la ubicación para encontrar sólo un conjunto de VIH-1 de macrófagos infectados en el campo. Use la configuración de excitación / emisión apropiados basados ​​en el sistema de imagen utilizado y la sonda. Incluir un canal brillante campo (BF) para observar los fagosomas (Figura 1II). Optimizar la aparición de las diferentes imágenes del canal ajustando el porcentaje de tiempo de la luz y la exposición transmitida. NOTA: En este caso, NLR4.3 VIH-1 Gag-IGFP estaba excitada usando un láser de 491 nm con 50 ms de tiempo de exposición con 20% de láser (Figura 1i). </li><li> Retirar la cápsula de imágenes y añadir 1 ml de suspensión de SRBC en 7 x 10 6 / ml a SRBC el plato (Figura 1). </li><li> Centrifugar a 500 xg durante2 min a TA para sincronizar la fagocitosis, registrar el tiempo al final de esta centrifugación y devolver el plato a la etapa. </li><li> Optimizar la GFP enfoque y la captura y las imágenes BF en Z-pilas (en todo el espesor de la celda con un paso a la distancia de 0,3 m - por lo general 20 aviones) cada minuto durante al menos 1 hr. Guardar el vídeo de lapso de tiempo en el formato de archivo nativo del sistema de imagen utilizado. NOTA: En este caso, las películas a intervalos fueron salvados en el formato nativo, archivos * .stk. </li></ol> 6. Análisis de las películas a intervalos <ol><li> Para la edición de vídeo, haga clic en el menú desplegable &quot;Aplicaciones&quot; y en la ficha &quot;Revisión multidimensional de datos&quot; en el software de edición de vídeo. <ol><li> Para abrir el archivo, haga clic en &quot;Seleccionar archivo de la base&quot;, luego en &quot;Seleccionar directorio&quot;. En el &quot;conjuntos de datos&quot;, seleccione la adquisición de analizar (en formato .nd) y haga clic en &quot;Ver&quot;. Los datos se representan en una tabla con el tiempo en una columnad Z de planta en la línea. </li><li> Representar a la infección en un Z-proyección (Figura 2, paneles de la izquierda), seleccione 491 nm de longitud de onda en el cuadro de &quot;Las longitudes de onda&quot; y haga clic en la pestaña &quot;proyección Z&quot; con &quot;todos los planos&quot;. </li><li> Para analizar una secuencia de tiempo, seleccione la longitud de onda de BF en el cuadro de &quot;Las longitudes de onda&quot; y seleccione el plano óptima en el eje Z para distinguir los eritrocitos de cordero externos (Figura 2, punta de flecha roja), SRBC internos (Figura 2, círculo rojo) y el núcleo ( La figura 2, círculo azul). </li><li> Para guardar los montajes de vídeo, haga clic en la pestaña &quot;Selección [X]&quot; y después en &quot;Load Image (s)&quot;. Por último, guardar las imágenes cargadas en formato tif y abrirlos al lado en el software ImageJ. </li></ol></li><li> Utilizar el plugin &quot;Tracking Manual&quot; en el software ImageJ para medir la posición del núcleo y las diferentes fagosomas observados en el canal BF (Figura 3). <ol><li> Download el plugin &quot;Manual de seguimiento&quot; en la página web ImageJ. En ImageJ, abren el plugin y la secuencia de imágenes a analizar (figura 3, paso 1 y 2). </li><li> Introduzca los ajustes tales como &quot;Intervalo de tiempo&quot;, que representa la cantidad de tiempo entre tramas adyacentes, y la &quot;x / y de calibración&quot;, que representa la distancia por píxel (figura 3, paso 3). NOTA: Aquí, guardar la secuencia de imágenes con un intervalo de tiempo de 1 min entre cada fotograma y x / y de calibración de 0,205 micras porque se utilizan el zoom 63X y una cámara con tamaño de píxel de 6,45 x 6,45 m 2. </li><li> Para iniciar el seguimiento, haga clic en &quot;Añadir pista&quot; (figura 3, paso 4) y hacer clic en un centro de SRBC en el primer momento en que se internaliza. La siguiente trama aparece automáticamente. </li><li> Continúe haciendo clic en el centro de SRBC en todos los marcos que tienen diferentes posiciones durante el tiempo (figura 3, paso 6 en el cuadro rojo). <ol><li> Comenzará a realizar el seguimiento del núcleo que su posición en todos los marcos haciendo clic en su centro. Tema siguiente los fagosomas (haciendo clic en su centro), uno por uno en el momento (marco) de su internalización, diferentes en función de los eritrocitos de cordero. Para una mayor comodidad para ver SRBC en el canal BF, utilice la ventana de &quot;Brillo y contraste&quot; durante el seguimiento (figura 3, paso 5). </li></ol></li><li> Entre cada SRBC de seguimiento, haga clic en &quot;Añadir pista&quot; (figura 3, paso 4) para tener una nueva pista. El número de seguimiento será cambiado en la segunda columna, &quot;Pista n °&quot; de la tabla de resultados (figura 3, paso 6). </li><li> Guardar los datos en una hoja de cálculo para continuar con el siguiente paso del análisis. </li></ol></li><li> Utilice el software de hoja de cálculo para calcular la distancia recorrida de los fagosomas que contienen SRBCs hacia el núcleo y la velocidad de los fagosomas durante los primeros 5 minutos después de la internalización de los eritrocitos de cordero (Fifigura 4). <ol><li> Abra la tabla de hoja de cálculo y un nuevo archivo de hoja de cálculo. Transferencia en este nuevo archivo sólo los siguientes parámetros, el tiempo, la X e Y de coordenadas del núcleo y todos los SRBC (figura 4A). </li><li> Para calcular la distancia entre SRBC y el núcleo con sólo sus coordenadas, considere el núcleo y un SRBC en un plano de coordenadas xy (Figura 4B). NOTA: La distancia entre dos puntos es la longitud de la trayectoria de conectarlos. En el plano, la distancia entre SRBC y el núcleo está dado por el teorema de Pitágoras. <ol><li> Si c (la distancia entre el núcleo y el SRBC) denota la longitud de la hipotenusa y a y b indican las longitudes de los otros dos lados, expresar el teorema de Pitágoras como la ecuación de Pitágoras: <img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/54568/54568eq1.jpg" /> NOTA: Al mismo tiempo, en la ortonormal, la distancia horizontala es (x -x núcleo SRBC) y la distancia vertical b es (y núcleo -y SRBC). </li><li> Por lo tanto, calcular la distancia entre el núcleo y el SRBC (Figura 4A, caja púrpura) por: <img alt="Ecuación 2" src="/files/ftp_upload/54568/54568eq2.jpg" /> NOTA: Multiplicar el valor de la distancia obtenida (en píxeles) por x / y de calibración para tener la distancia en micras. Aquí, el x / y de calibración es 0,205 m. </li><li> En cada tiempo, se resta la distancia entre el núcleo y el SRBC a la distancia inicial (Figura 4C). </li><li> Trazar la medición en función del tiempo para los primeros 5 minutos. Aplique una línea de tendencia lineal (Figura 5A) a la trama y determinar la pendiente de la línea de tendencia lineal que representa la velocidad fagosoma hacia el núcleo durante los primeros 5 minutos después de la internalización SRBC. </li><li> Cotejar los datos para calcular el error medio y estadístico delos valores de velocidad y representarlos en una forma apropiada con el software adecuado (Figura 5B). </li></ol></li></ol></li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Esta técnica tiene varios pasos críticos. En primer lugar, la preparación de hMDMs y su infección por el VIH-1 es muy importante ya que el porcentaje de infección depende de los donantes. Es de destacar, que hemos decidido utilizar los macrófagos que no están polarizados in vitro antes de la infección, debido a que el estado de los macrófagos potencialmente encontradas por el virus in vivo no ha sido bien caracterizado hasta ahora. Se verificó la expresión de varios marcadores de la superficie, lo que ...

Los macrófagos desempeñan un papel importante en el sistema inmunitario innato y en la homeostasis. Son fagocitos profesionales que internalizan y eliminan patógenos y desechos mediante un proceso llamado fagocitosis 1,2. El fagosoma, el compartimento cerrado que se forma después de la inmersión del material particulado, sufre una serie de eventos de fusión y fisión con compartimentos endocíticos, lo que conduce a un compartimento degradativo llamado fagolisosoma. Este compartimento tiene un pH ácido, debido a la adquisición de v-ATPasas que bombean protones, contiene enzimas hidrolíticas y está enriquecido en proteínas de membrana asociadas a lisosomales (LAMP). La maduración de los fagosomas se acompaña de su migración en los microtúbulos 3,4 hacia el centro celular para llegar a una localización perinuclear donde se acumulan los lisosomas.
Se ha reportado que muchos patógenos secuestran la maduración del fagosoma, incluyendo bacterias con estilos de vida intracelulares que modifican el ambiente vacuolar donde residen 5. El Virus de Inmunodeficiencia Humana (VIH)-1 se dirige a los macrófagos además de a las células T. Como los macrófagos son resistentes a los efectos citopáticos del virus, a diferencia de las células T, pueden considerarse como un reservorio del virus. Además, los macrófagos infectados con el VIH-1 muestran funciones fagocíticas defectuosas y contribuyen a la aparición de enfermedades oportunistas. En particular, la enfermedad invasiva grave por Salmonella no tifoidea causada por Salmonella Typhimurium ST313 ha sido prevalente durante las últimas tres décadas en niños o adultos del África subsahariana infectados por el VIH 6. Se ha estimado que el riesgo de contraer tuberculosis es más de 20 veces mayor en las personas que viven con el VIH que en las que no están infectadas por el VIH. 
Por todas estas razones, es importante definir mejor los mecanismos moleculares que subyacen a los defectos fagocíticos en los macrófagos infectados por el VIH. Hemos demostrado que la absorción de material particulado, partículas opsonizadas, bacterias u hongos, se inhibió en los macrófagos infectados por el VIH 7. Dado que esta inhibición es parcial, nos propusimos analizar el destino de los fagosomas internalizados en macrófagos humanos infectados por VIH 8. Debido a que la maduración del fagosoma está estrechamente relacionada con la migración al centro celular y la fusión con los lisosomas, un defecto en la maduración del fagosoma puede deberse a modificaciones de las modalidades de tráfico en la célula infectada. El método descrito aquí utiliza glóbulos rojos de oveja opsonizados con IgG (IgG-SRBC) como modelo para dirigirse a la fagocitosis mediada por receptores y, en particular, a los receptores de la porción Fc de las inmunoglobulinas (FcR). Estas partículas son más fáciles de visualizar en campo claro (BF) que las perlas de látex porque los SRBC extracelulares e intracelulares muestran diferentes propiedades de refracción. Para medir la velocidad de los fagosomas que se mueven hacia el núcleo en los macrófagos infectados por el VIH, utilizamos un virus fluorescente 10 y establecimos un método de seguimiento manual simple que se describe aquí. El método no requiere programación avanzada y simplemente utiliza ImageJ. Es susceptible a las células adherentes y a cualquier tipo de partícula o patógeno que pueda visualizarse con microscopía de campo claro o con imágenes fluorescentes.

<table><tbody><tr><td>Placa de cultivo celular tratada con TC Falcon de 100 mm</td><td>Corning</td><td>353003</td><td>Para la producción viral</td></tr><tr><td>Placas con fondo de vidrio de 35 mm sin recubrimiento 1.5</td><td>Corporación MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C Caja</td><td>Para adquisición</td></tr><tr><td>Placas de cultivo de tejidos Falcon Thermo</td><td>Fischer Scientific</td> Corning de 6 pocillos<td>. Inc. 353934</td><td>Para macrófagos derivados de monocitos humanos</td></tr><tr><td>Ficoll-Plaque PLUS</td><td>Dominique Dutscher</td><td>17-1440-03</td><td>un polisacárido hidrofílico neutro, muy ramificado, de alta masa, en solución para centrifugación por densidad</td></tr><tr><td>DPBS, sin calcio, sin magnesio</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>14190-094</td><td>RT</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 1x, líquido (alta glucosa)</td><td>GIBCO, Sondas moleculares</td><td>31966-021</td><td>Conservado a 4 & grados; C ; para el cultivo de células HEK</td></tr><tr><td>RPMI 1640 medio GLUTAMAX&nbsp; Suplemento</td><td>Life technologies</td><td>61870-010</td><td>Conservado en 4 &deg; C; para la cultura de hMDMs</td></tr><tr><td>F&oelig; suero de pantorrilla (FCS)&nbsp;</td><td>Eurobio</td><td>CVFSVF0001</td><td>Conservado a -20 &deg; C ; </td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina descomplementada (10.000 U/ml)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>15140-122</td><td>Conservado a -20 &deg; C ; para hMDMs cultivo</td></tr><tr><td>RPMI 1640 medio, sin rojo fenol (10x 500 ml)</td><td>Life technologies</td><td>11835-105</td><td>Warm in 37 &deg; C baño de agua antes de usar; para ensayo de fagocitosis</td></tr><tr><td>FuGENE6 Reactivo de transfección</td><td>Promega</td><td>E2692</td><td>Conservado a 4 & grados; C ; para la producción viral</td></tr><tr><td>Glóbulos rojos de oveja (SRBC)</td><td>Eurobio</td><td>DSGMTN00-0Q</td><td>Conservado en tampón Alsever a 4 & grados; C antes</td></tr><tr><td>de usar Glóbulos rojos anti-ovejas IgG</td><td>MP Biomedicals</td><td>55806</td><td>Conservado a 4 & deg; C</td></tr><tr><td>Fracción de choque térmico de albúmina sérica bovina, pH 7, &ge; 98%&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td>Conservado a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Microscopio invertido DMI600</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocal Spinning Disk Unit&nbsp; CSU-X1M1</td><td>Yokogawa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>491 nm 50 mW láser</td><td>COBOLT CALYPSO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCX PL APO CS Objectif</td><td>Leica</td><td></td><td>Lente de objetivo ; Aumento 100X ; Apertura numérica 1,40 ; Aceite de inmersión</td></tr><tr><td>CoolSnap HQ2 (FireWire) Cámara</td><td>Fotometría</td><td></td><td>Tamaño de píxel 6.45 y micro; m x 6,45 y micro; m ; Definición 1.392 x 1.040 ; Codificación de la imagen en el</td></tr><tr><td>software Metamorph 7.7.5</td> de 14 bits <td>Molecular Devices</td><td></td><td>Para el control del microscopio</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td> GraphPad Prism <td>Para el análisis estadístico</td></tr></tbody></table>

fagosoma migración y velocidad medida en vivo primaria macrófagos humanos infectados con vih-1

Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1

Los macrófagos son células fagocíticas que desempeñan un papel importante en la encrucijada entre la inmunidad innata y la específica. Pueden ser infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)-1 y, debido a su resistencia a sus efectos citopáticos, pueden considerarse reservorios virales persistentes. Además, los macrófagos infectados por el VIH exhiben funciones defectuosas que contribuyen al desarrollo de enfermedades oportunistas.
Se desconoce el mecanismo exacto por el cual el VIH-1 altera la respuesta fagocítica de los macrófagos. Anteriormente habíamos demostrado que la absorción de diversos materiales particulados por parte de los macrófagos se inhibía cuando estaban infectados con el VIH-1. Esta inhibición fue solo parcial y se formaron fagosomas dentro de los macrófagos infectados por el VIH. Por lo tanto, nos centramos en analizar el destino de estos fagosomas. La maduración de los fagosomas se acompaña de la migración de estos compartimentos hacia el centro celular, donde se fusionan con los lisosomas, generando fagolisosomas, responsables de la degradación del material ingerido. Utilizamos glóbulos rojos de oveja opsonizados con IgG como diana para la fagocitosis. Para medir la velocidad del movimiento centrípeto de los fagosomas en macrófagos individuales infectados por el VIH, utilizamos una combinación de microscopía confocal de campo claro y fluorescencia. Establecimos un método para calcular la distancia de los fagosomas hacia el núcleo, y luego para calcular la velocidad de los fagosomas. Las células infectadas por el VIH se identificaron gracias a un virus que expresa GFP, pero el método es aplicable a células no infectadas o a cualquier tipo de infección o tratamiento.

Fagocitosis mediada por FcR hMDMs infectados por el VIH-1 y no infectados se describe aquí usando SRBCs opsonized-IgG como objetivos modelo (Figura 1). Los pasos críticos de este protocolo son la preparación de hMDMs y la infección con el VIH-1. De hecho, el rendimiento y la calidad de macrófagos diferenciados varía entre los donantes, así como la tasa de infección con eficiencias en el rango de 10-40%. Además, la preparación de IgG-opsonizado-SRBC también es importante ...

Describimos un método para medir la velocidad de los fagosomas que se mueven hacia el centro celular en células vivas infectadas con o sin el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) tipo 1, utilizando microscopía de fluorescencia confocal de disco giratorio para identificar células infectadas fluorescentes y microscopía de campo claro para detectar fagosomas.

Fagosoma Migración y velocidad medida en vivo primaria macrófagos humanos infectados con VIH-1

Macrophages are phagocytic cells that play a major role at the crossroads between innate and specific immunity. They can be infected by the human ...

El objetivo general de este análisis es cuantificar la velocidad de los fagosomas en macrófagos infectados con VIH-1 mediante un método sencillo de seguimiento manual. La ventaja de este protocolo consiste en proporcionar un método fácil para calcular los movimientos relativos de grupos de objetos dentro de una célula, que pueden estar en movimiento o deformándose. Este método permite obtener información sobre el desplazamiento de los fagosomas en macrófagos infectados positivos para GFP, aunque también podría utilizarse para otros compartimentos intracelulares en células marcadas con fluorescencia.Después de infectar macrófagos derivados de monocitos humanos y opsonizar glóbulos rojos de oveja, según el protocolo descrito, prepare un ensayo de fagocitosis utilizando un sistema de imágenes confocales, como un microscopio de disco giratorio, equipado con una cámara de calentamiento a 37 grados Celsius y dióxido de carbono. Antes del experimento, encienda la cámara de calentamiento para calentar la platina del microscopio a 37 grados Celsius. Luego encienda el microscopio y la computadora, y cargue el software de imágenes.Optimice la configuración de imagen, como la velocidad de escaneo, el aumento, la resolución, entre otros, para obtener al menos una célula por campo y para capturar un cuadro cada minuto entre los 60 y los 120 minutos. Coloque la placa de imagen en la platina del microscopio. Ajuste el enfoque y la ubicación para encontrar solo un macrófago infectado con VIH-1 completo en el campo.Utilice configuraciones adecuadas de excitación y emisión según el sistema de imagen y la sonda utilizados. Incluya un canal de campo brillante. Optimice su apariencia ajustando el tiempo de exposición.A continuación, retire el platillo de imágenes y agregue un mililitro de suspensión de eritrocitos de sangre de oveja, o SRBC, a siete por diez a la sexta SRBC por mililitro, al platillo. Centrifugue el platillo a 500 × g durante dos minutos a temperatura ambiente para sincronizar la fagocitosis, luego registre el tiempo al final de la centrifugación y regrese el platillo al portaobjetos. Optimice el enfoque y establezca la parte superior e inferior del corte con una distancia de paso de 0,3 micrómetros.Inicie la adquisición de las series en Z de imágenes de GFP y de campo claro a lo largo del grosor completo de la célula, y guarde el video de lapso de tiempo en el formato de archivo nativo del sistema de imágenes. Para realizar la edición del video, en el software de edición de video, haga clic en el menú desplegable Aplicaciones y en la pestaña Revisar Datos Multidimensionales. Para abrir el archivo, haga clic en Seleccionar Archivo Base y luego en Seleccionar Directorio.En el cuadro Conjuntos de datos, seleccione la adquisición que desea analizar y haga clic en Ver. Para representar la infección en una proyección Z, en el cuadro Longitudes de onda, seleccione la longitud de onda de 491 nanómetros y haga clic en la pestaña Proyección Z con todos los planos. A continuación, para analizar una secuencia temporal, en el cuadro Longitudes de onda seleccione la longitud de onda de contraste de fase (BF) y elija el plano óptimo en el eje Z para distinguir los GRCE externos, los GRCE internos y el núcleo.Guarde los montajes de video haciendo clic en la pestaña Selección Xs y luego en Cargar imágenes. Finalmente, guarde las imágenes cargadas en formato tif. Después de descargar el complemento de seguimiento manual de Image J, abra el complemento en Image J y luego abra la secuencia de imágenes que se analizará.Ingrese los ajustes, como el intervalo de tiempo, que representa la cantidad de tiempo entre cuadros adyacentes, y la calibración XY, que representa la distancia por píxel. Para comenzar el seguimiento, haga clic en Agregar seguimiento y luego haga clic en el centro de un GRBS en el primer momento en que es internalizado. El siguiente cuadro aparece automáticamente.Por comodidad, para ver los SRBC en el canal de BF, utilice la ventana de brillo y contraste durante el seguimiento. Continúe haciendo clic en el centro del SRBC en todos los fotogramas para obtener diferentes posiciones a lo largo del tiempo. Entre cada seguimiento de SRBC, haga clic en Finalizar seguimiento y luego en Agregar seguimiento para comenzar un nuevo seguimiento.El número de seguimiento cambiará en la segunda columna de la tabla de resultados. Comience a rastrear el núcleo para obtener su posición en todos los fotogramas haciendo clic en su centro, como se realizó anteriormente. Guarde los datos en una hoja de cálculo, ábrala con un software de hojas de cálculo y cree un nuevo archivo de hoja de cálculo.Transfiera a este nuevo archivo el tiempo, y las coordenadas X e Y del SRBC y del núcleo. Finalmente, utilice el software de hoja de cálculo para calcular la distancia recorrida por los fagosomas que contienen SRBC hacia el núcleo, y la velocidad de los fagosomas durante los primeros cinco minutos después de la internalización de los SRBC según el protocolo descrito en el texto. Aquí se muestra el análisis del movimiento de fagosomas en macrófagos vivos infectados con VIH, en tiempo real, utilizando microscopía confocal de disco giratorio.La configuración del canal de campo brillante es fundamental para observar el núcleo y para distinguir los eritrocitos ovinos (SRBC) externos de los internalizados. Esta gráfica representa la distancia recorrida por un fagosome en HMDM no infectados durante los primeros cinco minutos tras la internalización de un SRBC en función del tiempo. La velocidad del fagosome corresponde a la pendiente de la curva de regresión lineal mostrada aquí.Finalmente, en este estudio, se observó que la velocidad del fagosome durante los primeros cinco minutos tras la internalización en HMDM infectados con VIH es menor en comparación con HMDM no infectados. Estos métodos demostraron que el movimiento del fagosome hacia el centro de la célula, y por lo tanto, la maduración del fagosome en fagolisosomas, estaba alterado en macrófagos infectados con VIH. Tras su adquisición, una célula puede procesarse adicionalmente para microscopía electrónica correlativa o bien puede fijarse toda la población celular para microscopía de inmunofluorescencia clásica y análisis estadístico.La fagocitosis es muy sensible a la temperatura, por lo tanto, la temperatura dentro de la cámara de calentamiento y del medio del cultivo en la placa debe mantenerse constantemente a 37 grados Celsius durante todo el procedimiento. No olvide que trabajar con patógenos puede ser peligroso y que deben tomarse precauciones, como trabajar en una sala de bioseguridad y usar equipo de protección personal, de acuerdo con la legislación local.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este experimento visualizado es una guía para la utilización de un clon de fluorescencia molecular del VIH para vivir experimentos de imagen confocal.

Visualización de la célula a célula de Transmisión del VIH utilizando clones fluorescente del VIH y la microscopía confocal en vivo

El ensayo de motilidad phagokinetic track es un método usado para evaluar el movimiento de las células. Específicamente, el ensayo mide la quimiocinesis (motilidad celular aleatoria) en el tiempo de una manera cuantitativa. El ensayo se aprovecha de la capacidad de las células para crear una pista medible de su movimiento en coloidales de oro revestido con cubreobjetos.

Una evaluación cuantitativa de la migración celular mediante el ensayo de la canción Motilidad Phagokinetic

Source: Lê-Bury, G., et al. Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates live confocal imaging of HIV-1-infected human macrophages to visualize and quantify phagosome migration using GFP fluorescence and bright field tracking, providing insights into how HIV alters intracellular trafficking during Fc receptor–mediated phagocytosis.

Live Imaging of Phagosome Migration in HIV-1-Infected Human Macrophages

Este video muestra un ensayo para cuantificar el crecimiento intracelular de parásitos en macrófagos derivados de la médula ósea (BMM). Las células macrófagas están infectadas con los estadios invasivos móviles y no móviles de Leishmania, promastigotes metacíclicos y amastigotes, respectivamente. Los parásitos invaden los macrófagos, se internalizan en una vacuola parasitófora y se multiplican en su interior. El crecimiento intracelular del parásito se cuantifica utilizando un microscopio tras...

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