Fagosoma Migración y velocidad medida en vivo primaria macrófagos humanos infectados con VIH-1

El objetivo general de este análisis es cuantificar la velocidad del fagosoma en macrófagos infectados por VIH-1 utilizando un método de seguimiento manual sencillo. La ventaja de este protocolo es proporcionar un método fácil para calcular los movimientos relativos de grupos de objetos dentro de una celda que pueden estar en movimiento o deformados. Este método proporciona información sobre el movimiento de los fagosomas en los macrófagos infectados positivos para GFP, pero podría utilizarse para otros compartimentos intercelulares en células marcadas con fluorescencia.

Después de infectar macrófagos derivados de monocitos humanos y opsonizar células sanguíneas criadas en ovejas, de acuerdo con el protocolo de texto, configure un ensayo de fagocitosis utilizando un sistema de imágenes confocal, como un microscopio de disco giratorio, equipado con una cámara de calentamiento a 37 grados Celsius, con dióxido de carbono. Antes del experimento, encienda la cámara de calentamiento para calentar la platina del microscopio a 37 grados centígrados. Luego encienda el microscopio y la computadora, y cargue el software de imágenes.

Optimice la configuración de la imagen, como la velocidad de escaneo, la ampliación, la resolución, etc., para que tenga al menos una celda por campo y para obtener una imagen de un fotograma por minuto entre 60 y 120 minutos. Coloque la antena de imágenes en la platina del microscopio. Ajuste el enfoque y la ubicación para encontrar solo un macrófago entero infectado con VIH-1 en el campo.

Utilice los ajustes de excitación y emisión adecuados en función del sistema de imagen y la sonda utilizados. Incluye un canal de campo claro. Optimiza su aspecto ajustando el tiempo de exposición.

A continuación, retire la placa de imágenes y agregue un mililitro de glóbulo sanguíneo criado en ovejas, o suspensión de SRBC, a siete veces la décima parte de la sexta SRBC por mililitro, a la placa. Centrifugar la placa a 500 veces g durante dos minutos a temperatura ambiente para sincronizar la fagocitosis, luego registre el tiempo al final de la centrifugación y devuelva la placa a la etapa. Optimice el enfoque y establezca la parte superior e inferior de la pila con una distancia de paso de 0,3 micrómetros.

Inicie la adquisición de las pilas Z de imágenes GFP y BF en todo el grosor de la celda y guarde el video de lapso de tiempo en el formato de archivo nativo del sistema de imágenes. Para realizar la edición de video, en el software de edición de video, haga clic en el menú desplegable Aplicaciones y en la pestaña Revisar datos multidimensionales. Para abrir el archivo, haga clic en Seleccionar archivo base, luego en Seleccionar directorio.

En el cuadro Conjuntos de datos, seleccione la adquisición a analizar y haga clic en Ver. Para representar la infección en una proyección Z, en el cuadro Longitudes de onda, seleccione la longitud de onda de 491 nanómetros y haga clic en la pestaña de proyección Z con todos los planos. A continuación, para analizar una secuencia de tiempo, en el cuadro Longitudes de onda, seleccione Longitud de onda BF y elija el plano óptimo en el eje Z para distinguir los SRBC externos, los SRBC internos y el núcleo.

Guarde los montajes de video haciendo clic en la pestaña Selección Xs y luego en Cargar imágenes. Por último, guarde las imágenes cargadas en formato tif. Después de descargar el complemento de seguimiento manual de Image J, abra el complemento en Image J y, a continuación, abra la secuencia de imágenes que se va a analizar.

Introduzca la configuración, como el intervalo de tiempo, que representa la cantidad de tiempo entre fotogramas adyacentes, y la calibración XY, que representa la distancia por píxel. Para iniciar el seguimiento, haga clic en Agregar pista y haga clic en un centro SRBC la primera vez que se internalice. El siguiente fotograma aparece automáticamente.

Para mayor comodidad, para ver los SRBC en el canal BF, utilice la ventana de brillo y contraste durante el seguimiento. Continúe haciendo clic en el centro SRBC en todos los fotogramas para tener diferentes posiciones durante el tiempo. Entre cada seguimiento de SRBC, haga clic en Finalizar pista y, a continuación, en Agregar pista para comenzar una nueva pista.

El número de seguimiento cambiará en la segunda columna de la tabla de resultados. Comience a rastrear el núcleo para que tenga su posición en todos los fotogramas haciendo clic en su centro como se realizó anteriormente. Guarde los datos en una hoja de cálculo, luego ábrala en el software de hoja de cálculo y cree un nuevo archivo de hoja de cálculo.

Transfiera a este nuevo archivo la hora y las coordenadas X e Y del SRBC y del núcleo. Por último, utilice el software de hoja de cálculo para calcular la distancia recorrida de los fagosomas que contienen SRBC hacia el núcleo, y la velocidad de los fagosomas durante los primeros cinco minutos después de la internalización de los SRBC de acuerdo con el protocolo de texto. Aquí se muestra el análisis del movimiento de los fagosomas en macrófagos vivos infectados por el VIH en tiempo real utilizando microscopía confocal de disco giratorio.

Los ajustes del canal de campo claro son críticos para ver el núcleo y para discriminar los SRBC externos de los internalizados. Este gráfico traza la distancia recorrida por un fagosoma en HMDM no infectados en los primeros cinco minutos después de la internalización de un SRBC en comparación con el tiempo. La velocidad del fagosoma es la pendiente de la curva de regresión lineal que se muestra aquí.

Finalmente, en este estudio, se observó que la velocidad del fagosoma durante los primeros cinco minutos después de la internalización en los HMDM infectados por el VIH es menor en comparación con los HMDM no infectados. Estos métodos demostraron que el movimiento del fagosoma hacia el centro de la célula y, por lo tanto, la maduración del fagosoma en fagolisosomas, se veía afectado en los macrófagos infectados por el VIH. Después de su adquisición, una célula puede ser procesada posteriormente para microscopía electrónica correlativa o la población de células enteras puede ser fijada para la microscopía de inmunofluorescencia clásica y el análisis estadístico.

La fagocitosis es muy sensible a la temperatura y, por lo tanto, la temperatura dentro de la cámara de calentamiento y el medio de la placa de cultivo debe mantenerse constante a 37 grados centígrados durante todo el procedimiento. No olvide que trabajar con patógenos puede ser peligroso y se deben tomar precauciones como trabajar en una sala de bioseguridad y usar equipo de protección personal de acuerdo con la legislación local.