Técnica robótica automatizada de dispensación de Orientación de la superficie de las células y Bioprinting

Este protocolo describe una metodología de bioimpresión que utiliza un sistema de depósito robótico automatizado que incorpora señales de guía topográficas grabadas con la deposición de precisión de una célula que contiene biotinta de hidrogel. Las células impresas se entregan directamente a las características grabadas y son capaces de detectar y orientarse con ellas.

El objetivo general de esta técnica de dispensación robótica automatizada es crear una superficie para la guía topográfica de la célula y luego entregar las células a estas características siguiendo un patrón programado, lo que permite el control sobre el comportamiento y la distribución de la célula. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la ingeniería biomédica, como por ejemplo cómo las topologías de superficie pueden afectar al comportamiento de las células, tanto en monocultivo como en cocultivo. La principal ventaja de esta técnica es que requiere menos tiempo programar e imprimir el patrón de guía de celdas en comparación con los métodos más establecidos.

También incluye un paso de administración de celdas para una dispensación controlada. La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando nos dimos cuenta de que los patrones 2D de las células depositadas en hidrogeles podrían beneficiarse de la guía de la superficie. Como tal, desarrollamos esta técnica para imprimir hidrogeles de una manera que coincidiera con las características de la superficie.

Este protocolo describe el uso del sistema de dispensación robótica asistido por contrapresión como bioimpresora basada en grabado y extrusión de superficies. Para preparar una superficie de poliestireno para el grabado y la impresión, seleccione una lámina de poliestireno de un milímetro de grosor. Las sábanas más gruesas se arquearán más.

Luego, trate la hoja con plasma de oxígeno. Ajuste el regulador de gas oxígeno a dos barras. A continuación, encienda la máquina de plasma y encienda la bomba de vacío.

Proceda a programar la máquina para 150 vatios y 30 centímetros cúbicos estándar por minuto de flujo de gas oxígeno, y exponga la lámina a estas condiciones durante 10 minutos. Luego, evacúe la cámara y selle la puerta e inicie el ciclo. A continuación, sumerja la lámina tratada en suero fetal bovino puro e incube a 37 grados centígrados durante dos horas con agitación.

Después del tratamiento con suero, lave la sábana tres veces con 1X PBS y esterilice la sábana. Después del lavado final, deje la hoja en un horno a 37 grados centígrados para que se seque durante la noche durante aproximadamente 12 horas. Primero prepare un lápiz de impresión para el grabado.

Con mucho cuidado, inserte una aguja textil de 1,5 milímetros de diámetro en la boquilla de una jeringa dispensadora hasta que quede encajada y asegurada. Cuando intente crear por primera vez un arreglo bioimpreso, dibuje el patrón deseado en papel cuadriculado con ejes numerados para generar las coordenadas x, y. A continuación, introduce las coordenadas del patrón en una hoja de cálculo.

A continuación, en el software de impresión, seleccione Programa, Agregar programa, seguido de Editar, Agregar punto para establecer el programa. A continuación, copie los valores de las coordenadas x e y de la hoja de cálculo en el software de dispensación de impresión. Antes de cada ejecución, calibre la altura z del robot para establecer la posición de contacto del lápiz óptico.

Primero, seleccione la opción Robot. Luego, haga clic en Cambiar modo y habilite la opción Modo de enseñanza. Esto habilita la función JOG del robot.

Para JOG el robot, primero coloque el robot en su posición predeterminada seleccionando Robot, Meca Initialize. Luego, Robot, JOG. A continuación, en las ranuras x e y, introduzca la distancia en milímetros necesaria para colocar el lápiz óptico exactamente en el origen del patrón.

Luego, también en milímetros, ingrese un valor numérico en la ranura z para colocar el lápiz óptico o la boquilla en contacto con la superficie sin flexionar ni indentar la superficie. Esto se designa como el valor inicial de z. La profundidad de cada ranura se puede variar utilizando la altura z.

Por ejemplo, las ranuras de corte pueden tener 40, 80 o 170 micras de profundidad. Se necesita concentración y observación minuciosa para encontrar un punto de contacto de modo que no haya flexión del lápiz óptico ni hendiduras notables en la superficie. Para garantizar el éxito, recomendamos preparar varias hojas y ejecutar el programa a diferentes alturas z para encontrar la posición inicial ideal.

El siguiente paso es definir la instrucción de impresión para cada uno de los puntos de coordenadas. Utilice Inicio de línea Dispensar para definir el primer punto y el inicio de la impresión. Utilice el paso de línea para designar los puntos intermedios y, por último, utilice la dispensación de fin de línea para indicar al robot que finalice la tirada.

Para comunicar el programa al robot, seleccione Robot, Enviar datos de C&T. Luego, inicie la ejecución seleccionando Robot, Cambiando modo, Cambiar modo de ejecución y cambiando la configuración a Ejecutar. Finalmente, inicie la impresión.

Para hacer la biotinta, disuelva un 2% de gelatina en Alpha MEM complementado con un 10% de FBS y un 2% de antimicótico antibiótico. Coloque el medio a 60 grados centígrados durante dos horas para permitir que la gelatina se disuelva en el medio. Cultive las células para la biotinta al 70% de confluencia en platos de 10 centímetros.

Se puede utilizar cualquier célula que responda a las características de guía de la superficie y debe expresar una etiqueta fluorescente para que puedan verse durante el proceso de incrustación. Libere las células adheridas en la suspensión retirando el medio, lavando las células con PBS y recubriendo las células con una solución de tripsina-EDTA 1X durante cinco minutos a 37 grados centígrados. Después de neutralizar la tripsina con medio, recoja las células en una suspensión y péguelas a 1.000 g durante cinco minutos.

Describa el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 0,5 mililitros de medio. Después de medir la densidad de celdas, mezcle la suspensión en la solución de biotinta enfriada para hacer una solución con cinco millones de celdas por milímetro. A continuación, vierta la biotinta que contiene células en una jeringa de impresión preparada bloqueada por un tapón de señuelo.

Enfríe la jeringa cargada a cuatro grados centígrados para obtener una viscosidad imprimible. A continuación, saque la jeringa cargada y refrigerada, retire la tapa de la jeringa y coloque la boquilla de impresión. Luego, conecte la jeringa cargada al sistema dispensador y conéctela a las líneas de presión de aire.

Para imprimir la biotinta en el patrón prediseñado, los bordes y las líneas deben ser distintos. En realidad, la impresión precisa se obtiene optimizando la contrapresión del dispensador y el calibre de la aguja de la boquilla de impresión. Ajuste la contrapresión del dispensador a 0,05 megapascales para una jeringa de 10 mililitros con una aguja cónica de calibre 34.

Luego, en el software, ajuste la velocidad de escritura a cinco milímetros por segundo sobre una superficie de película de poliestireno. Ahora, siguiendo el patrón programado, deposite la biotinta celular en las ranuras pregrabadas. Después de depositar las celdas, deje que la hoja se incube durante 20 minutos a temperatura ambiente.

Más tarde, cubra el andamiaje celular impreso en el medio de crecimiento apropiado e incube las células durante 24 horas para que las células se adhieran antes de seguir experimentando. Las células madre sembradas por bioimpresión dentro de la biotinta finalmente se sedimentaron en la superficie y se detectaron y alargaron a lo largo de una dirección de las líneas discretamente grabadas. Las células sembradas en medio de cultivo sin bioimpresión también se alinearon en la dirección de las características.

Sin embargo, también cubrían toda la superficie, por lo tanto, la biotinta restringía las células al rastro impreso. Cuando se sembraron en hojas sin las características grabadas, las celdas no mostraron orientación ni alineación. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo grabar con precisión las ranuras en la lámina de poliestireno y luego bioimprimir con precisión las células en las ranuras.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en aproximadamente dos o tres horas. Es muy útil para los investigadores en el campo de la bioingeniería exponer las interacciones de la superficie celular en modelos donde se requiere anisotropía y posicionamiento celular. No olvide que la biotinta contiene células vivas y es muy importante utilizar una técnica estéril a la hora de imprimir las hojas.