Vascularizado de Bioprinting de microfluidos para la ingeniería de tejidos y organitas
11 de agosto de 2017
Proporcionamos un protocolo generalizado basado en una estrategia de bioprinting de microfluidos para la ingeniería de un lecho vascular de microfibra, donde un tipo de célula secundaria podría ser más sembrado en el espacio intersticial de esta estructura de microfibra para generar organoides y tejidos vascularizados.
El objetivo general de esta metodología de bioimpresión microfluídica es generar una construcción de tejido vascularizado. Este método puede resolver preguntas clave en la biofabricación de tejidos vascularizados. La principal ventaja de esta técnica es que es versátil en la generación de una tina vascular controlada de forma tridimensional para la ingeniería de tejidos vascularizados a través de un proceso de siembra de células secundarias.
Aunque este protocolo proporciona información sobre la ingeniería de tejidos cardíacos vascularizados, también se puede aplicar a muchos otros tipos de tejidos, como el hígado, la piel e incluso el cáncer. En general, las personas nuevas en este método pueden tener dificultades porque la configuración de la bioimpresora puede no ser sencilla. Para comenzar este procedimiento, construya un cabezal de impresión microfluídica concéntrico de doble capa insertando una aguja roma más pequeña, que sirve como núcleo, en el centro de la aguja roma más grande, que sirve como vaina.
Asegúrese de que la aguja central sobresalga de la carcasa exterior aproximadamente un milímetro. Después de eso, inserte una aguja de calibre 23 en el cilindro de la aguja central en la dirección inversa. Haga un agujero en el costado del cilindro de la aguja exterior e inserte un conector metálico del mismo tamaño.
Selle con pegamento epoxi. Monta el extrusor en el cabezal de una bioimpresora, utilizando un soporte de polimetacrilato de metilo o PMMA. A continuación, para la inyección de la biotinta y la solución de reticulación a través de dos tubos de PVC individualmente, conecte las entradas del cabezal de impresión a una bomba de jeringa de doble canal.
Haga la biotinta usando una mezcla de alginato, gelMA y fotoiniciador. Disuelto en tampón HEPES de 25 milimolares, que contiene un 10% de suero fetal bovino o FBS. A continuación, prepare una solución de cloruro de calcio 0,3 molar en tampón HEPES que contenga un 10% de FBS para que sirva como fluido portador de reticulación.
Justo antes de la bioimpresión, tripsinícese las células endoteliales de la vena umbilical humana o HUVEC durante cinco a 10 minutos. Centrifugar las celdas a 800 RPM durante cinco minutos en un tubo de 15 mililitros. Vuelva a suspender las células en la biotinta a una concentración de cinco a 10 veces, de 10 a seis células por mililitro, pipeteando lentamente de cinco a 10 veces.
A continuación, utilice una bomba de jeringa de doble canal para iniciar la inyección de la biotinta colocada de HUVEC a través de uno y el fluido de reticulación a través del otro canal a un caudal de cinco microlitros por minuto. Deje que los flujos corran continuamente hasta un minuto hasta que se estabilicen. Después de eso, comience el movimiento del cabezal de impresión manteniendo la velocidad de deposición de la bioimpresora de aproximadamente cuatro milímetros por segundo.
Esta bioimpresión debería dar lugar a una rápida gelificación iónica del componente de alginato y a la deposición de un andamio de microfibra. Una vez que se haya impreso el andamio, reticule el componente gelMA con cinco a 10 milivatios por centímetro cuadrado de luz ultravioleta durante 20 a 30 segundos para lograr la gelificación química. Luego, retire el exceso de cloruro de calcio del andamio enjuagándolo suavemente con PBS tibio a 37 grados centígrados.
Cultive este andamio en medio de crecimiento de células endoteliales a 37 grados Celsius en un cinco por ciento de CO2 volumétrico, durante un máximo de 16 días. Cambie el medio al menos cada dos días. Durante el período de cultivo, monitoree los HUVEC bajo un microscopio hasta que migren a las periferias de las microfibras del andamio y formen estructuras similares a un lumen.
A continuación, retire con cuidado todo el medio del espacio intrasticial del andamio con fuerza capilar utilizando un trozo de papel de filtro estéril. Agregue instantáneamente una gota de suspensión de un tipo de célula secundaria, como los cardiomiocitos, en la parte superior del andamio, lo que permite que las células se infiltren en todo el espacio intrasticial. Después de eso, incube este andamio en una incubadora durante 30 minutos a dos horas, permitiendo que las células se adhieran a las microfibras individuales.
Elimine las células no adherentes lavando suavemente el andamio con PBS. Cultive este andamio en un medio apropiado hasta que se forme el tejido vascularizado deseado. La bioimpresión microfluídica descrita aquí, permite la bioimpresión directa de andamios microfibrosos utilizando biotintas de baja viscosidad.
Un andamio de seis por seis por seis milímetros cuadrados de tamaño< que contiene más de 30 microfibras, podría bioimprimirse en 10 minutos. Las vistas superior y lateral de las micrografías de andamios muestran la excelente integridad estructural durante el proceso de bioimpresión. Se logra con la reticulación iónica inmediata del componente de alginato con cloruro de calcio.
Después de la extrusión microfluídica de la biotinta, la reticulación iónica y la reticulación fotorreticulada, los HUVEC mantuvieron una viabilidad relativamente alta. Las células proliferaron y migraron desde la distribución inicialmente aleatoria en el día cero, a las periferias de las microfibras en el día 16. Los cardiomiocitos de rata neonata que se sembraron en el andamio maduraron y poblaron el andamio.
Mostraron una fuerte expresión de biomarcadores cardíacos funcionales. Tales como la alfa actinina sarcomérica y la conexina 43. La microscopía confocal de un andamio microfibroso bioimpreso, poblado con cardiomiocitos, reveló la coexistencia de HUVEC y cardiomiocitos.
Los HUVEC están presentes principalmente en los límites de las microfibras, mientras que los cardiomiocitos rodean el exterior de las microfibras. Las células fueron capaces de mantener su latido espontáneo y sincronizado durante un máximo de nueve a 28 días. Dependiendo de la fuente de la célula y la configuración de los andamios.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo producir tejidos vascularizados utilizando la técnica de bioimpresión microfluídica, así como las operaciones de fabricación de cabezales de impresión y bioimpresoras. La demostración visual de este método es fundamental, ya que la fabricación del cabezal de impresión y las operaciones de la bioimpresora pueden ser complicadas para las personas que no han utilizado una antes. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que las dos agujas deben ser concéntricas en el cabezal de impresión y dejar que el flujo se estabilice antes de comenzar la bioimpresión.
Con el desarrollo de esta técnica, los investigadores en el campo de la ingeniería de tejidos y la biofabricación disponen ahora de otra herramienta que permite generar construcciones de tejido vascularizado con fines de regeneración in vivo o para modelar tejidos in vitro.
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Descripción general
Este artículo presenta una metodología de bioimpresión microfluídica destinada a generar estructuras de tejido vascularizadas. La técnica aborda los desafíos en la biofabricación al permitir la creación de una cama vascular tridimensional que puede poblarse con tipos de células secundarios.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Biofabricación
- Microfluídica
- Ingeniería de tejidos
Antecedentes
- La ingeniería de tejidos vascularizados es crucial para el desarrollo de organoides.
- Los métodos actuales enfrentan limitaciones en la creación de estructuras de tejido complejas.
- La bioimpresión microfluídica ofrece un enfoque versátil para superar estos desafíos.
- Esta técnica se puede adaptar para varios tipos de tejido, incluidos los tejidos cardíacos, hepáticos y cutáneos.
Propósito del estudio
- Desarrollar un protocolo para crear estructuras de tejido vascularizadas.
- Mejorar la comprensión de las técnicas de biofabricación.
- Proporcionar una base para futuras aplicaciones en ingeniería de tejidos.
Métodos utilizados
- Construcción de un cabezal de impresión microfluídico concéntrico de doble capa.
- Utilización de una aguja roma más pequeña como núcleo dentro de una aguja roma más grande.
- Siembra de tipos de células secundarios en la estructura microfibrosa.
- Aplicación del método a varios tipos de tejido más allá de los tejidos cardíacos.
Resultados principales
- El protocolo genera con éxito una estructura de tejido vascularizada.
- Demostró versatilidad en la creación de diferentes tipos de tejido.
- Proporcionó información sobre la ingeniería de estructuras de tejido complejas.
- Identificó posibles desafíos para los recién llegados al proceso de bioimpresión.
Conclusiones
- El método de bioimpresión microfluídica es eficaz para la ingeniería de tejidos vascularizados.
- Este enfoque puede facilitar los avances en la investigación de organoides.
- Los estudios futuros pueden ampliar su aplicación a otros tipos de tejido y condiciones.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Microfluidic bioprinting enables the engineering of vascularized tissue constructs with high structural fidelity, addressing a critical bottleneck in preclinical model development. By generating perfusable microvascular networks within hydrogel scaffolds, this method supports the creation of more physiologically relevant tissue models for drug screening and mechanistic studies. The approach enhances predictive confidence in early discovery by providing a tunable platform to study cell-cell interactions, tissue maturation, and functional responses under controlled conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of endothelial-pericyte or stromal cell interactions within a defined vascular niche to validate therapeutic targets involved in angiogenesis or vascular permeability.
- Operational Value: Provides a reproducible, microfluidically controlled system for generating vascularized scaffolds with consistent microfiber architecture and lumen formation.
- Predictive Value: Supports assessment of compound effects on vascular integrity and cell migration in a human-relevant, 3D microenvironment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized microfibrous scaffolds with encapsulated endothelial cells that form lumen-like structures, enabling quantitative assessment of vascular network formation over time.
- Operational Value: Compatible with dual-channel syringe pump bioprinting, allowing precise control over bioink and crosslinking fluid delivery for high-throughput scaffold fabrication.
- Assay Readiness: Produces scaffolds with >30 microfibers in a 6x6x6 mm volume within 10 minutes, supporting scalable preparation for downstream secondary cell seeding and compound screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables secondary seeding of cardiomyocytes or other parenchymal cells into the interstitial space, facilitating the study of vascularized tissue maturation and synchronized contractile function.
- Translational Continuity: Supports long-term culture (>16 days) with monitoring of cell migration, lumen formation, and biomarker expression (e.g., sarcomeric alpha actinin, connexin 43) to model tissue-level responses.
- Risk Mitigation: Allows evaluation of cell viability, proliferation, and functional maturation under perfusion-like conditions, reducing attrition due to poor vascular engraftment in later stages.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, providing a vascularized platform that bridges simple monocultures and complex in vivo models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on vascular-dependent pathways by enabling controlled co-culture of endothelial and parenchymal cells in a defined 3D geometry.
- Screening: Delivers assay-ready scaffolds with reproducible microstructure and endothelialization, suitable for evaluating compound effects on vascular stability and tissue organization.
- Analytics: Enables quantitative readouts via confocal microscopy of cell distribution, lumen formation, and biomarker co-localization to assess tissue quality and functional maturation.
- Translational Research: Models vascularized tissue development from early endothelial network formation to secondary cell integration, supporting preclinical validation of vascular-targeted or regenerative candidates.
- Enterprise Reuse: The microfluidic printhead design and bioink system (GelMA-alginate with ionic/photocrosslinking) represent a reusable platform adaptable to multiple tissue types (cardiac, liver, skin) and secondary cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence by generating vascularized tissues with perfusable lumen-like structures and sustained cellular function (e.g., synchronized beating up to 28 days).
- Operational Value: Enables standardization of scaffold fabrication through microfluidic flow control, reducing variability in microfiber diameter, crosslinking efficiency, and cell distribution.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing early insight into vascular compatibility and tissue-level responses, reducing late-stage failure due to inadequate vascularization.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of candidates based on their effects in a human-relevant, vascularized tissue model that recapitulates key structural and functional hallmarks.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device fabrication, including concentric needle assembly and epoxy sealing to prevent leakage.
- Dependent on dual-channel syringe pump systems and UV photocrosslinking equipment for precise bioink delivery and GelMA stabilization.
- Necessitates optimization of cell concentration (5–10×10⁶ HUVECs/mL) and flow rates (5 µL/min) to ensure cell viability and uniform encapsulation during printing.
- Requires aseptic handling and sterile filter paper for medium removal during secondary cell seeding to avoid contamination and ensure proper infiltration.
- Limited by the need for post-printing rinsing to remove excess calcium chloride, which adds a manual step that must be standardized across batches.
