Vascularizado de Bioprinting de microfluidos para la ingeniería de tejidos y organitas

El objetivo general de esta metodología de bioimpresión microfluídica es generar una construcción de tejido vascularizado. Este método puede resolver preguntas clave en la biofabricación de tejidos vascularizados. La principal ventaja de esta técnica es que es versátil en la generación de una tina vascular controlada de forma tridimensional para la ingeniería de tejidos vascularizados a través de un proceso de siembra de células secundarias.

Aunque este protocolo proporciona información sobre la ingeniería de tejidos cardíacos vascularizados, también se puede aplicar a muchos otros tipos de tejidos, como el hígado, la piel e incluso el cáncer. En general, las personas nuevas en este método pueden tener dificultades porque la configuración de la bioimpresora puede no ser sencilla. Para comenzar este procedimiento, construya un cabezal de impresión microfluídica concéntrico de doble capa insertando una aguja roma más pequeña, que sirve como núcleo, en el centro de la aguja roma más grande, que sirve como vaina.

Asegúrese de que la aguja central sobresalga de la carcasa exterior aproximadamente un milímetro. Después de eso, inserte una aguja de calibre 23 en el cilindro de la aguja central en la dirección inversa. Haga un agujero en el costado del cilindro de la aguja exterior e inserte un conector metálico del mismo tamaño.

Selle con pegamento epoxi. Monta el extrusor en el cabezal de una bioimpresora, utilizando un soporte de polimetacrilato de metilo o PMMA. A continuación, para la inyección de la biotinta y la solución de reticulación a través de dos tubos de PVC individualmente, conecte las entradas del cabezal de impresión a una bomba de jeringa de doble canal.

Haga la biotinta usando una mezcla de alginato, gelMA y fotoiniciador. Disuelto en tampón HEPES de 25 milimolares, que contiene un 10% de suero fetal bovino o FBS. A continuación, prepare una solución de cloruro de calcio 0,3 molar en tampón HEPES que contenga un 10% de FBS para que sirva como fluido portador de reticulación.

Justo antes de la bioimpresión, tripsinícese las células endoteliales de la vena umbilical humana o HUVEC durante cinco a 10 minutos. Centrifugar las celdas a 800 RPM durante cinco minutos en un tubo de 15 mililitros. Vuelva a suspender las células en la biotinta a una concentración de cinco a 10 veces, de 10 a seis células por mililitro, pipeteando lentamente de cinco a 10 veces.

A continuación, utilice una bomba de jeringa de doble canal para iniciar la inyección de la biotinta colocada de HUVEC a través de uno y el fluido de reticulación a través del otro canal a un caudal de cinco microlitros por minuto. Deje que los flujos corran continuamente hasta un minuto hasta que se estabilicen. Después de eso, comience el movimiento del cabezal de impresión manteniendo la velocidad de deposición de la bioimpresora de aproximadamente cuatro milímetros por segundo.

Esta bioimpresión debería dar lugar a una rápida gelificación iónica del componente de alginato y a la deposición de un andamio de microfibra. Una vez que se haya impreso el andamio, reticule el componente gelMA con cinco a 10 milivatios por centímetro cuadrado de luz ultravioleta durante 20 a 30 segundos para lograr la gelificación química. Luego, retire el exceso de cloruro de calcio del andamio enjuagándolo suavemente con PBS tibio a 37 grados centígrados.

Cultive este andamio en medio de crecimiento de células endoteliales a 37 grados Celsius en un cinco por ciento de CO2 volumétrico, durante un máximo de 16 días. Cambie el medio al menos cada dos días. Durante el período de cultivo, monitoree los HUVEC bajo un microscopio hasta que migren a las periferias de las microfibras del andamio y formen estructuras similares a un lumen.

A continuación, retire con cuidado todo el medio del espacio intrasticial del andamio con fuerza capilar utilizando un trozo de papel de filtro estéril. Agregue instantáneamente una gota de suspensión de un tipo de célula secundaria, como los cardiomiocitos, en la parte superior del andamio, lo que permite que las células se infiltren en todo el espacio intrasticial. Después de eso, incube este andamio en una incubadora durante 30 minutos a dos horas, permitiendo que las células se adhieran a las microfibras individuales.

Elimine las células no adherentes lavando suavemente el andamio con PBS. Cultive este andamio en un medio apropiado hasta que se forme el tejido vascularizado deseado. La bioimpresión microfluídica descrita aquí, permite la bioimpresión directa de andamios microfibrosos utilizando biotintas de baja viscosidad.

Un andamio de seis por seis por seis milímetros cuadrados de tamaño< que contiene más de 30 microfibras, podría bioimprimirse en 10 minutos. Las vistas superior y lateral de las micrografías de andamios muestran la excelente integridad estructural durante el proceso de bioimpresión. Se logra con la reticulación iónica inmediata del componente de alginato con cloruro de calcio.

Después de la extrusión microfluídica de la biotinta, la reticulación iónica y la reticulación fotorreticulada, los HUVEC mantuvieron una viabilidad relativamente alta. Las células proliferaron y migraron desde la distribución inicialmente aleatoria en el día cero, a las periferias de las microfibras en el día 16. Los cardiomiocitos de rata neonata que se sembraron en el andamio maduraron y poblaron el andamio.

Mostraron una fuerte expresión de biomarcadores cardíacos funcionales. Tales como la alfa actinina sarcomérica y la conexina 43. La microscopía confocal de un andamio microfibroso bioimpreso, poblado con cardiomiocitos, reveló la coexistencia de HUVEC y cardiomiocitos.

Los HUVEC están presentes principalmente en los límites de las microfibras, mientras que los cardiomiocitos rodean el exterior de las microfibras. Las células fueron capaces de mantener su latido espontáneo y sincronizado durante un máximo de nueve a 28 días. Dependiendo de la fuente de la célula y la configuración de los andamios.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo producir tejidos vascularizados utilizando la técnica de bioimpresión microfluídica, así como las operaciones de fabricación de cabezales de impresión y bioimpresoras. La demostración visual de este método es fundamental, ya que la fabricación del cabezal de impresión y las operaciones de la bioimpresora pueden ser complicadas para las personas que no han utilizado una antes. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que las dos agujas deben ser concéntricas en el cabezal de impresión y dejar que el flujo se estabilice antes de comenzar la bioimpresión.

Con el desarrollo de esta técnica, los investigadores en el campo de la ingeniería de tejidos y la biofabricación disponen ahora de otra herramienta que permite generar construcciones de tejido vascularizado con fines de regeneración in vivo o para modelar tejidos in vitro.