Vascularizado de Bioprinting de microfluidos para la ingeniería de tejidos y organitas
11 de agosto de 2017
Proporcionamos un protocolo generalizado basado en una estrategia de bioprinting de microfluidos para la ingeniería de un lecho vascular de microfibra, donde un tipo de célula secundaria podría ser más sembrado en el espacio intersticial de esta estructura de microfibra para generar organoides y tejidos vascularizados.
El objetivo general de esta metodología de bioprintado microfluídico es generar un constructo de tejido vascularizado. Este método puede resolver preguntas clave en la biofabricación de tejidos vascularizados. La principal ventaja de esta técnica es que es versátil para generar un depósito vascular con forma tridimensional controlada para la ingeniería de tejidos vascularizados mediante un proceso secundario de siembra celular.
Aunque este protocolo proporciona información sobre la ingeniería de tejidos cardíacos vascularizados, también puede aplicarse a muchos otros tipos de tejidos, como el hígado, la piel e incluso los cánceres. Las personas en general que sean nuevas en este método podrían tener dificultades, ya que la configuración de la biopresora podría no ser sencilla. Para comenzar este procedimiento, construya una boquilla de impresión microfluídica concéntrica de doble capa insertando una aguja roma más pequeña, que sirve como núcleo, en el centro de una aguja roma más grande, que sirve como manguito.
Asegúrese de que la aguja central sobresalga del manguito exterior aproximadamente un milímetro. A continuación, inserte una aguja de calibre 23 en el cilindro de la aguja central en sentido inverso. Haga un orificio en el lateral del cilindro de la aguja exterior e inserte un conector metálico del tamaño correspondiente.
Selle con pegamento epoxi. Monte el extrusor en la cabeza de una biopresora, utilizando un soporte de metacrilato de polimetilo o PMMA. A continuación, para la inyección del bioencre y la solución de reticulación a través de dos tubos de PVC individualmente, conecte las entradas de la cabeza impresora a una bomba de jeringa de canal dual.
Prepare el bioink utilizando una mezcla de alginato, gelMA e iniciador fotocurado. Disuelto en tampón HEPES 25 milimolar, que contiene 10% de suero bovino fetal o FBS. Luego prepare una solución de cloruro de calcio 0,3 molar en tampón HEPES que contenga 10% de FBS para usar como líquido portador de entrecruzamiento.
Inmediatamente antes de la bioimpresión, someta las células endoteliales de vena umbilical humana o HUVECs a tripsinización durante cinco a 10 minutos. Centrifugue las células a 800 RPM durante cinco minutos en un tubo de 15 mililitros. Reuspenda las células en la bio-tinta a una concentración de cinco a 10 veces 10 a la seis células por mililitro, pipeteando lentamente de cinco a 10 veces.
A continuación, utilice una bomba de jeringa de doble canal para iniciar la inyección de la bio-tinta cargada con HUVEC a través de un canal, y del fluido de reticulación a través del otro canal, a un caudal de cinco microlitros por minuto. Permita que los flujos continúen durante hasta un minuto hasta que se estabilicen. Después, inicie el movimiento del cabezal de impresión manteniendo una velocidad de deposición del bioprinter de aproximadamente cuatro milímetros por segundo.
Esta bioprinting debe provocar una gelificación iónica rápida del componente de alginato y la deposición de un andamio de microfibras. Una vez impreso el andamio, realice la reticulación fotográfica del componente gelMA con cinco a 10 milivatios por centímetro cuadrado de luz UV durante 20 a 30 segundos para lograr la gelificación química. A continuación, elimine el exceso de cloruro de calcio del andamio lavándolo suavemente con PBS tibio a 37 grados Celsius.
Cultive este andamio en medio de crecimiento para células endoteliales a 37 grados Celsius en un 5 % de volumen de CO2, durante hasta 16 días. Cambie el medio al menos cada dos días. Durante el período de cultivo, supervise las HUVECs bajo un microscopio hasta que migren hacia las periferias de las microfibras del andamio y formen estructuras similares a lúmenes.
Luego, retire cuidadosamente todo el medio del espacio intersticial del andamiaje mediante la fuerza capilar utilizando un trozo de papel filtro estéril. Inmediatamente, agregue una gota de suspensión de un tipo celular secundario, como cardiomiocitos, encima del andamiaje, permitiendo que las células se infiltren en todo el espacio intersticial. A continuación, incube este andamiaje en una incubadora durante 30 minutos a dos horas, permitiendo que las células se adhieran a las microfibras individuales.
Elimine las células no adherentes lavando suavemente el andamio con PBS. Cultive este andamio en medio adecuado hasta que se forme el tejido vascularizado deseado. La bioprinting microfluídica descrita aquí permite la bioprinting directa de andamios microfibrosos utilizando biotintas de baja viscosidad.
Un andamio de seis por seis por seis milímetros cuadrados de tamaño que contiene más de 30 microfibras podría ser biopresionado dentro de 10 minutos. Las vistas superior y lateral de micrografías del andamio muestran la excelente integridad estructural durante el proceso de biopresión. Logrado mediante la reticulación iónica inmediata del componente de alginato con cloruro de calcio.
Después de la extrusión microfluídica del bioink, el entrecruzamiento iónico y el entrecruzamiento fotoinducido, las HUVECs mantuvieron una viabilidad relativamente alta. Las células proliferaron y migraron desde la distribución inicialmente aleatoria en el día cero hasta los periferias de las microfibras en el día 16. Los cardiomiocitos de rata neonatal que se sembraron sobre el andamiaje maduraron y colonizaron el andamiaje.
Mostraron una fuerte expresión de biomarcadores cardíacos funcionales, como la alfa actinina sarcómera y la conexina 43. La microscopía confocal de un andamio microfibrilar bioprintado, poblado con cardiomiocitos, reveló la coexistencia de ambos HUVECs y cardiomiocitos.
Las HUVEC se encuentran principalmente en los bordes de las microfibras, mientras que los cardiomiocitos rodean el exterior de las microfibras. Las células pudieron mantener su contracción espontánea y sincronizada durante un período de nueve a 28 días, dependiendo de la fuente celular y la configuración de los andamios.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo producir tejidos vascularizados utilizando la técnica de bioprintado microfluídico, así como de la fabricación del cabezal de impresión y el funcionamiento del bioprinter. La demostración visual de este método es fundamental, ya que la fabricación del cabezal de impresión y el manejo del bioprinter pueden resultar complicados para personas que no lo han utilizado antes. Al intentar este procedimiento, es importante recordar colocar las dos agujas de forma concéntrica en el cabezal de impresión y permitir que el flujo se estabilice antes de comenzar el bioprintado.
Con el desarrollo de esta técnica, los investigadores en el campo de la ingeniería de tejidos y la biofabricación ahora cuentan con otra herramienta habilitadora para generar construcciones de tejidos vascularizados, ya sea con fines de regeneración in vivo o para modelar tejidos in vitro.
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Resumen
Este artículo presenta una metodología de bioprintado microfluídico destinada a generar construccos de tejidos vascularizados. La técnica aborda los desafíos en biofabricación al permitir la creación de un lecho vascular tridimensional que puede ser poblado con tipos celulares secundarios.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biofabricación
- Microfluídica
- Ingeniería de tejidos
Antecedentes
- La ingeniería de tejidos vascularizados es fundamental para el desarrollo de organoides.
- Los métodos actuales presentan limitaciones para crear estructuras tisulares complejas.
- La bioimpresión microfluídica ofrece un enfoque versátil para superar estos desafíos.
- Esta técnica puede adaptarse para diversos tipos de tejidos, incluidos los tejidos cardíaco, hepático y cutáneo.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un protocolo para la creación de construcciones de tejidos vascularizados.
- Mejorar la comprensión de las técnicas de biofabricación.
- Proporcionar una base para aplicaciones futuras en ingeniería de tejidos.
Métodos Utilizados
- Construcción de una boquilla de impresión microfluídica concéntrica de doble capa.
- Uso de una aguja roma más pequeña como núcleo dentro de una aguja roma más grande.
- Siembra de tipos celulares secundarios en la estructura microfibrilar.
- Aplicación del método a diversos tipos de tejidos más allá de los tejidos cardíacos.
Resultados Principales
- El protocolo genera con éxito un constructo de tejido vascularizado.
- Demuestra versatilidad para crear diferentes tipos de tejidos.
- Proporciona conocimientos sobre la ingeniería de estructuras tisulares complejas.
- Identifica desafíos potenciales para quienes se inician en el proceso de bioprinting.
Conclusiones
- El método de bioprintado microfluídico es eficaz para la ingeniería de tejidos vascularizados.
- Este enfoque puede facilitar avances en la investigación de organoides.
- Estudios futuros pueden ampliar su aplicación a otros tipos de tejidos y condiciones.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La bioimpresión microfluídica permite la ingeniería de construccos de tejidos vascularizados con alta fidelidad estructural, abordando un cuello de botella crítico en el desarrollo de modelos preclínicos. Al generar redes microvasculares perfusables dentro de andamiajes de hidrogel, este método apoya la creación de modelos de tejidos más fisiológicamente relevantes para la selección de fármacos y estudios mecanicistas. El enfoque mejora la confianza predictiva en las primeras etapas del descubrimiento al proporcionar una plataforma ajustable para estudiar interacciones célula-célula, maduración del tejido y respuestas funcionales bajo condiciones controladas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar las interacciones entre células endoteliales y pericitos o células estromales dentro de un nicho vascular definido para validar dianas terapéuticas implicadas en angiogénesis o permeabilidad vascular.
- Valor operativo: Proporciona un sistema reproducible y controlado microfluídicamente para generar andamiajes vascularizados con una arquitectura de microfibras y formación de lumen consistentes.
- Valor predictivo: Facilita la evaluación de los efectos de compuestos sobre la integridad vascular y la migración celular en un microentorno tridimensional relevante para el ser humano.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera andamios microfibrilares estandarizados con células endoteliales encapsuladas que forman estructuras similares a lúmenes, lo que permite la evaluación cuantitativa de la formación de redes vasculares a lo largo del tiempo.
- Valor operativo: Compatible con la bioprintado por bomba de jeringas de doble canal, lo que permite un control preciso sobre la entrega de bioink y fluido de reticulación para la fabricación de andamios de alto rendimiento.
- Preparación para ensayos: Produce andamios con más de 30 microfibras en un volumen de 6x6x6 mm en 10 minutos, facilitando la preparación escalable para la siembra posterior de células secundarias y el cribado de compuestos.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Permite la siembra secundaria de cardiomiocitos u otras células parenquimatosas en el espacio intersticial, facilitando el estudio de la maduración del tejido vascularizado y de la función contráctil sincronizada.
- Continuidad traslacional: Permite el cultivo a largo plazo (>16 días) con monitoreo de la migración celular, formación de lumen y expresión de biomarcadores (por ejemplo, alfa actinina sarcomérica, connexina 43) para modelar respuestas a nivel tisular.
- Mitigación de riesgos: Permite evaluar la viabilidad celular, proliferación y maduración funcional en condiciones similares a la perfusión, reduciendo la pérdida celular debido a un mal engraftamiento vascular en etapas posteriores.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación del blanco hasta la optimización del fármaco líder, proporcionando una plataforma vascularizada que sirve de puente entre monocultivos simples y modelos complejos in vivo.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis sobre vías dependientes del sistema vascular al permitir el cultivo conjunto controlado de células endoteliales y parenquimatosas en una geometría tridimensional definida.
- Selección: Proporciona andamios listos para ensayos con microestructura y endotelización reproducibles, adecuados para evaluar los efectos de compuestos sobre la estabilidad vascular y la organización del tejido.
- Análisis: Permite lecturas cuantitativas mediante microscopía confocal de la distribución celular, formación de lúmenes y co-localización de biomarcadores para evaluar la calidad del tejido y su maduración funcional.
- Investigación Traducional: Modela el desarrollo del tejido vascularizado desde la formación inicial de redes endoteliales hasta la integración de células secundarias, apoyando la validación preclínica de fármacos dirigidos al sistema vascular o de candidatos regenerativos.
- Reutilización Empresarial: El diseño del cabezal microfluídico y el sistema de biotinta (GelMA-alginato con reticulación iónica y fotoquímica) representan una plataforma reutilizable adaptable a múltiples tipos de tejidos (cardíaco, hepático, cutáneo) y tipos celulares secundarios.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Mejora la confianza predictiva mediante la generación de tejidos vascularizados con estructuras similares a lúmenes perfusables y función celular sostenida (por ejemplo, contracción sincronizada hasta 28 días).
- Valor operativo: Permite la estandarización de la fabricación de andamios mediante el control del flujo microfluídico, reduciendo la variabilidad en el diámetro de las microfibras, la eficiencia de reticulación y la distribución celular.
- Valor estratégico: Mejora la toma de decisiones de avance o interrupción del desarrollo al proporcionar información temprana sobre la compatibilidad vascular y las respuestas a nivel tisular, reduciendo los fracasos en fases avanzadas debido a una vascularización inadecuada.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de candidatos basándose en sus efectos en un modelo de tejido vascularizado, relevante para el ser humano, que reproduce características estructurales y funcionales clave.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la fabricación de dispositivos microfluídicos, incluyendo el ensamblaje de agujas concéntricas y el sellado con epoxi para prevenir fugas.
- Depende de sistemas de bombas de jeringa de doble canal y equipo de fotoentrecruzamiento UV para una entrega precisa del bioink y la estabilización de GelMA.
- Necesita la optimización de la concentración celular (5–10×10⁶ HUVECs/mL) y de las tasas de flujo (5 µL/min) para garantizar la viabilidad celular y una encapsulación uniforme durante la impresión.
- Requiere manipulación aséptica y papel filtro estéril para la eliminación del medio durante la siembra secundaria de células, con el fin de evitar contaminación y asegurar una infiltración adecuada.
- Está limitado por la necesidad de un lavado posterior a la impresión para eliminar el exceso de cloruro de calcio, lo cual añade un paso manual que debe estandarizarse entre lotes.
