Viabilidad de Bioprinted celulares Construye El uso de un Tres Impresora cartesiana dispensador

El objetivo general de este procedimiento es generar construcciones cargadas de células viables con una geometría compleja utilizando una bioimpresión 3D. Esto se logra aislando primero las células estromales de tejido adiposo humano del cultivo. A continuación, las células se mezclan con biotinta de alginato conjugado RGD oxidado recién preparado.

En el paso final, la célula LA en el biomaterial se extruye mediante bioimpresión. En última instancia, la microscopía confocal se utiliza para analizar la viabilidad, proliferación y migración de las células bioimpresas. La principal ventaja de este procedimiento sobre los procedimientos existentes, como la formación de andamios y la siembra de células, es que con nuestro procedimiento, puede colocar directamente las células y los agregados celulares exactamente donde deben estar para formar el tejido.

Hoy hará una demostración del procedimiento Sarah Grace Dennis, una estudiante graduada de mi laboratorio. Comience sembrando 350.000 células estromales de tejido adiposo humano en un matraz T 75 tratado en 15 mililitros de TMEM de baja glucosa para su expansión en una incubadora de cultivo celular. Cuando el cultivo alcance el 80% de fluidez, retire el medio y enjuague las células con cinco mililitros de DPBS sin calcio ni magnesio.

A continuación, incubar las células en cinco mililitros de tripsina y DPBS durante dos minutos a 37 grados centígrados cuando las células se hayan desprendido, detener la reacción enzimática con tres mililitros de medio de cultivo celular y transferir las células a un tubo cónico de 50 mililitros. A continuación, centrifugar las células y volver a suspender el pellet en dos mililitros de medio de cultivo celular. A continuación, cuenta las células, transfiere 1,3 veces 10 de las alícuotas de seis células a un tubo cónico de 15 mililitros y vuelve a girar las células.

Suspenda el pellet en un mililitro de tinta biológica recién preparada, teniendo cuidado de distribuir homogéneamente las células por toda la solución acuosa de alginato. A continuación, cargue las células en una jeringa estéril de tres mililitros compatible con una impresora y enrosque una punta de plástico estéril de calibre 22. Ahora encienda el bioprint, cada uno de los ordenadores dispensadores y el baño de agua recirculante.

Ajuste manualmente la temperatura del baño a cuatro grados centígrados para el mecanismo de encendido y los parámetros de impresión para cada dispensador en la computadora dispensadora correspondiente. Establezca el volumen de dispensación en 230 nanolitros, el número de pasos de retroceso en cero y la tasa de dispensación en 10 microlitros por segundo. A continuación, abra el software de diseño y el programa para ver la pantalla de la cámara USB en el ordenador.

A continuación, introduzca manualmente las coordenadas de una matriz de puntos de cinco por cinco con 2,4 milímetros de espacio entre las gotas. Guarde el programa y envíelo al robot. A continuación, coloque una placa de Petri que contenga gelatina y dióxido de titanio en la platina de la impresora a cuatro grados centígrados y cierre y bloquee la puerta de la cámara.

Usando el controlador lógico programable, inicializó las fuentes de luz ultravioleta para esterilizar la cámara. Después de 90 segundos, abra la cámara y cargue la jeringa que contiene la suspensión de células estromales de tejido adiposo humano en la pistola, cierre y bloquee la puerta de la cámara y use el controlador lógico programable para encender el sistema de ventilador. Espere 30 segundos para que la presión interna se equilibre y luego ejecute el programa que contiene la trayectoria geométrica y los parámetros de impresión durante todo el proceso de impresión.

Observe la pantalla USB de la cámara del ordenador para confirmar una impresión precisa y uniforme. Para cuantificar la viabilidad de las construcciones bioimpresas, sumérjalas en una solución de tinte recién preparada. A continuación, coloque los constructos en la nevera durante 15 minutos en la oscuridad para permitir que la mancha se fije.

Luego, usando una imagen de microscopio confocal, las construcciones teñidas si las células parecen amarillas o verdes, las clasifican como vivas si son rojas, las células están muertas. Como demuestran estos resultados, la bioimpresión facilita la deposición de ayuda celular e hidrogeles en ubicaciones tridimensionales específicas de manera precisa y consistente utilizando software computarizado. El software de la computadora determina la ubicación de cada gota y controla muchos de los parámetros para la dispensación.

Uno de los requisitos para el éxito de una técnica de bioimpresión es que las células permanezcan viables aquí. Las células impresas en biotinta algínica, como se acaba de demostrar, se analizaron una hora y ocho días después de la impresión, con el 98% de las células apareciendo verdes y viables en el día cero y hasta el 95% en el día ocho. Como indica la tinción roja, se observaron pocas células muertas en ambos momentos, lo que confirma la idoneidad de la tinta alternativa para la bioimpresión.

Además, la tinta de algina conjugada RGD mejora la unión de las células a las construcciones impresas, lo que conduce a una mejor propagación y proliferación celular, como se cuantifica en tres áreas separadas del hidrogel en un cero y un ocho. Aquí, se comparó una comparación de la calidad de la conjugación del péptido RGD en la biotinta Ginnet con el uso de la biotinta Ginnet sola en el octavo día. La dispersión celular observada en la muestra teñida con ginnet conjugada con RGD indicó la incorporación exitosa del péptido en la ginnet, un fenómeno que estuvo notablemente ausente en las muestras bioprint no conjugadas después de su desarrollo.

Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la ingeniería de tejidos exploraran la fabricación aditiva como un medio para ensamblar construcciones de ingeniería vivas.