Viabilidad de Bioprinted celulares Construye El uso de un Tres Impresora cartesiana dispensador
22 de septiembre de 2015
Una bioimpresora cartesiana fue diseñada y fabricada para permitir la deposición de múltiples materiales en geometrías precisas y reproducibles, al tiempo que permite el control de factores ambientales. Utilizando la bioimpresora tridimensional, se pueden imprimir y reproducir fácilmente construcciones complejas y viables.
El objetivo general de este procedimiento es generar construccos viables cargados con células y con una geometría compleja utilizando una biopresora 3D. Esto se logra primero aislado células estromales de tejido adiposo humano a partir de cultivo. A continuación, las células se mezclan con tinta biológica de alginato conjugada con RGD oxidado recién preparada.
En el paso final, la celda LA en el biomaterial se extruye mediante bioprintado. Finalmente, se utiliza microscopía confocal para analizar la viabilidad, proliferación y migración de las celdas impresas en 3D. La ventaja principal de este procedimiento frente a los existentes, como la formación de andamios y siembra celular, es que con nuestro método se pueden colocar directamente las celdas y agregados celulares exactamente donde deben estar para formar el tejido.
El procedimiento de hoy será demostrado por Sarah Grace Dennis, una estudiante de posgrado de mi laboratorio. Comience sembrando 350,000 células estromales de tejido adiposo humano en un matraz T75 tratado con 15 mililitros de TMEM de baja glucosa para su expansión en un incubador de cultivo celular. Cuando el cultivo alcance el 80% de confluencia, retire el medio y lave las células con cinco mililitros de DPBS sin calcio ni magnesio.
Luego, incubar las células en cinco mililitros de tripsina y DPBS durante dos minutos a 37 grados Celsius; cuando las células se hayan desprendido, detener la reacción enzimática con tres mililitros de medio de cultivo celular y transferir las células a un tubo cónico de 50 mililitros. A continuación, centrifugar las células y resuspender el sedimento en dos mililitros de medio de cultivo celular. Luego, contar las células, transferir un alícuota celular de 1,3 veces 10 a la seis a un tubo cónico de 15 mililitros y centrifugar nuevamente las células.
Suspenda el sedimento en un mililitro de tinta biológica recién preparada, teniendo cuidado de distribuir homogéneamente las células a través de la solución acuosa de alginato. A continuación, cargue las células en una jeringa estéril compatible con impresora de tres mililitros y coloque firmemente una punta plástica estéril de calibre 22. Encienda ahora la impresora biológica, cada uno de los ordenadores del dispensador y el baño de agua con recirculación.
Configure manualmente la temperatura del baño a cuatro grados Celsius para el mecanismo de acción y los parámetros de impresión para cada dispensador en el ordenador del dispensador correspondiente. Establezca el volumen dispensado en 230 nanolitros, el número de pasos hacia atrás en cero y la velocidad de dispensación en 10 microlitros por segundo. A continuación, abra el software de diseño y el programa para ver la visualización de la cámara USB en el ordenador.
A continuación, ingrese manualmente las coordenadas para una matriz de puntos de cinco por cinco con un espacio de 2,4 milímetros entre las gotas. Guarde el programa y envíelo al robot. Luego, coloque una placa de Petri que contenga gelatina y dióxido de titanio sobre la plataforma de impresión a cuatro grados Celsius y cierre y bloquee la puerta de la cámara.
Utilizando el controlador lógico programable, encendió las fuentes de luz ultravioleta para esterilizar la cámara. Después de 90 segundos, abra la cámara y cargue la jeringa que contiene la suspensión de células estromales del tejido adiposo humano en la pistola uno, cierre y bloquee la puerta de la cámara, y utilice el controlador lógico programable para encender el sistema de ventiladores. Espere 30 segundos para que la presión interna se equilibre y luego ejecute el programa que contiene la trayectoria geométrica y los parámetros de impresión durante todo el proceso de impresión.
Observe la pantalla de la cámara USB en el ordenador para confirmar una impresión precisa y uniforme. Para cuantificar la viabilidad de los constructos bioprintados, sumérjalos en una solución de tinción recién preparada. Luego coloque los constructos en el refrigerador durante 15 minutos en la oscuridad para permitir que la tinción se fije.
Luego, mediante una imagen de microscopio confocal, si las construcciones teñidas muestran células de color amarillo o verde, clasifíquelas como vivas; si son rojas, las células están muertas. Como demuestran estos resultados, la bioimpresión facilita la deposición de células y hidrogeles en ubicaciones tridimensionales específicas de forma precisa y constante, utilizando software computarizado. El software determina la colocación de cada gota y controla muchos de los parámetros para la dispensación.
Uno de los requisitos de una técnica de bioprintado exitosa es que las células permanezcan viables aquí. Las células impresas en tinta bioalgínica como se acaba de demostrar fueron analizadas una hora y ocho días después de la impresión, con el 98 % de las células apareciendo verdes y viables en el día cero y el 95 % en el día ocho. Como indica la tinción roja, se observaron pocas células muertas en cualquiera de los dos puntos temporales, confirmando la idoneidad de la tinta alternativa para el bioprintado.
Además, la tinta de alginato conjugada con RGD mejora la adhesión de las células a los constructos impresos, lo que conduce a una mayor expansión y proliferación celular, cuantificada en tres áreas separadas del hidrogel en el día cero y en el día ocho. Aquí, se comparó la calidad de la conjugación del péptido RGD en la tinta bioactiva Ginnet con el uso de la tinta bioactiva Ginnet sola el día ocho. La expansión celular observada en la muestra teñida de Ginnet conjugado con RGD indicó la incorporación exitosa del péptido en el Ginnet, un fenómeno que estuvo notablemente ausente en las muestras de biotinta no conjugada tras su desarrollo.
Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la ingeniería de tejidos exploraran la fabricación aditiva como un medio para ensamblar construcciones vivas diseñadas.
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Descripción general
Este estudio presenta un procedimiento para generar construccos viables cargados con células y con geometrías complejas utilizando una impresora biológica 3D. El método consiste en aislar células estromales del tejido adiposo humano y mezclarlas con una tinta biológica antes de su extrusión a través de la impresora biológica.
Componentes Clave del Estudio
Área de la Ciencia
- Bioprinting
- Biología celular
- Ingeniería de tejidos
Antecedentes
- La bioimpresión 3D permite la colocación precisa de células.
- Los métodos tradicionales implican la formación de andamios y la siembra celular.
- La colocación directa de células puede mejorar la formación de tejidos.
- Se utiliza microscopía confocal para el análisis de la viabilidad celular.
Objetivo del estudio
- Crear construcciones complejas y viables utilizando una impresora biológica 3D.
- Mejorar la precisión en la colocación de células en la ingeniería de tejidos.
- Analizar el comportamiento de las células impresas en 3D después de la impresión.
Métodos Utilizados
- Aislamiento de células estromales del tejido adiposo humano.
- Preparación de bio-tinta de alginato conjugada con RGD oxidado.
- Extrusión de biomaterial cargado con células mediante bioprintado.
- Análisis de viabilidad, proliferación y migración celular mediante microscopía confocal.
Resultados principales
- Generación exitosa de construcciones viables cargadas con células.
- Mayor control sobre la colocación celular en comparación con los métodos tradicionales.
- Viabilidad y proliferación demostradas de células bioprintadas.
- La microscopía confocal confirmó los patrones de migración celular.
Conclusiones
- La biopresora 3D permite una colocación precisa y reproducible de células.
- Este método podría avanzar potencialmente en aplicaciones de ingeniería de tejidos.
- Estudios futuros podrían explorar aplicaciones adicionales de esta técnica de biopresión.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este método de bioimpresión permite una organización espacial precisa de células dentro de geometrías 3D complejas, abordando un desafío clave en la ingeniería de tejidos para medicina regenerativa y modelado de enfermedades. Al mantener una viabilidad celular alta y apoyar la proliferación, el enfoque proporciona una plataforma reproducible para evaluar candidatos terapéuticos en construcciones fisiológicamente relevantes. Esta capacidad facilita la validación temprana de objetivos y la reducción mecanicista de riesgos al permitir la colocación directa de agentes bioactivos en microentornos definidos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante la deposición celular controlada espacialmente en arquitecturas biomiméticas.
- Valor operativo: Apoya la validación funcional de objetivos al mantener la viabilidad celular (>95 % al octavo día) y la proliferación en los constructos impresos.
- Valor predictivo: Mejora la confianza en la interacción con el objetivo al replicar una organización similar a la del tejido nativo para la selección de compuestos.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Produce construcciones estandarizadas y viables cargadas con células, con resultados cuantificables mediante microscopía confocal para viabilidad, proliferación y migración.
- Valor operativo: Permite la reproducibilidad del ensayo mediante parámetros de impresión controlables y fabricación asistida por diseño computarizado.
- Escalabilidad: Facilita la reutilización de la plataforma para la evaluación de compuestos posteriores mediante colocación precisa de gotas y control ambiental.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Continuidad Translacional: Permite la progresión desde el descubrimiento hasta la validación preclínica al mantener la función celular en tinta biológica de alginato conjugada con RGD.
- Reducción Mecanística de Riesgos: Mejora la confianza predictiva mediante una mayor adhesión y expansión celular gracias a la conjugación del péptido RGD.
- Sistema Relevante para la Enfermedad: Genera construcciones de tejido biomimético que imitan de cerca la organización nativa de la matriz extracelular.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento, desde la validación inicial del blanco hasta la identificación del fármaco líder, al proporcionar lecturas biológicas reproducibles y cuantificables en tejidos modificados genéticamente.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías mediante la colocación precisa de células e hidrogeles en ubicaciones tridimensionales definidas.
- Selección: Proporciona disponibilidad para ensayos mediante la producción estandarizada de construcciones e imágenes confocales cuantitativas del comportamiento celular.
- Análisis: Permite el análisis comparativo de condiciones utilizando métricas de viabilidad, proliferación y migración obtenidas de construcciones teñidas.
- Investigación Traductiva: Se conecta con trabajos preclínicos al mantener la función celular en tinta biológica durante más de ocho días tras la impresión.
- Reutilización Empresarial: Establece una capacidad reutilizable para generar geometrías complejas en múltiples proyectos mediante dispensación programable y control por software.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva en la validación de objetivos mediante la reducción de la ambigüedad mecanicista en las interacciones célula-entorno.
- Valor operativo: Normalización y reproducibilidad mediante parámetros controlados de dispensación y un entorno de cámara estéril.
- Valor estratégico: Mejora en las decisiones de avance o interrupción al permitir la evaluación temprana de las respuestas celulares en contextos similares a tejidos.
- Impacto en la cartera: Priorización ajustada al riesgo mediante datos cuantitativos de viabilidad y proliferación que respaldan los criterios de avance.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en aislamiento celular, preparación de bio-tinta y microscopía confocal para la evaluación de viabilidad.
- Depende del hardware de la biopresora, sistemas de jeringas estériles y etapas de impresión con control de temperatura.
- Necesita estandarización entre equipos de trabajo en diseños CAD, tasas de dispensación y controles ambientales.
- Las consideraciones para la adaptación incluyen la composición de la bio-tinta y la compatibilidad del tipo celular con matrices basadas en alginato.
- Las limitaciones prácticas incluyen el riesgo de obstrucción de la boquilla y la necesidad de protocolos de tinción posteriores a la impresión para cuantificar la viabilidad.
