Monitoreo Segregación Espacial en la superficie colonizadores microbianos Poblaciones

El objetivo general de este procedimiento es observar la distribución espacial de las cepas microbianas durante el enjambre, el deslizamiento o la formación de biopelículas mediante microscopía fluorescente. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la microbiología social, como cómo la segregación espacial influye en la interacción microbiana. La principal ventaja de esta técnica es que la aptitud y la distribución espacial de las cepas microbianas pueden evaluarse fácilmente mediante técnicas microscópicas y análisis de imágenes de subsegmentos.

La demostración del procedimiento estará a cargo de Theresa Holscher, investigadora doctoral de mi laboratorio. El día antes del experimento, agregue tres mililitros de medio LB a un tubo de cultivo e inocule de un stock de congelador de B. subtilis. Repita esta inoculación con un tubo separado para cada cepa de interés.

Coloque los tubos en una incubadora de agitación horizontal a 37 grados centígrados durante la noche. Para preparar placas para experimentos de enjambre y deslizamiento, vierta 20 mililitros de medio LB templado en una placa de Petri de poliestireno de 90 milímetros. Cierre el plato inmediatamente y colóquelo a un lado de la campana estéril para que se enfríe durante al menos una hora.

A continuación, prepare las placas para los experimentos de biopelícula de colonias vertiendo 25 mililitros de agar dos veces el medio SG en una placa de Petri de 90 milímetros. Cierre las placas inmediatamente y configúrelas para que se enfríen en pilas de cuatro o menos durante al menos una hora. Para comenzar, coloque las placas deslizantes y de enjambre de agar LB en una campana de flujo laminar y retire las tapas.

Deje que los platos se sequen durante 20 minutos. La humedad de las placas en estos experimentos es crítica. Mientras que el exceso de humedad permite que las bacterias naden, el secado prolongado evita los enjambres y el deslizamiento.

Del mismo modo, la estructura de la biopelícula de la colonia depende de la sequedad del medio. Usando un espectrofotómetro, determine las densidades ópticas de los cultivos iniciadores durante la noche a 600 nanómetros. En un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros, la densidad de mezcla normalizó las cantidades de las cepas productoras de proteínas fluorescentes verde y roja para un total de 200 microlitros.

Agita el tubo durante tres segundos. Con una micropipeta, coloque dos microlitros de cultivo mezclado en el centro de una placa de agar LB de 90 milímetros preseca en la campana de flujo laminar. Coloque el plato para que se seque durante 10 minutos.

Por último, incubar las placas a 37 grados centígrados en posición vertical para evitar que se acumule condensación en la superficie del agar. Primero, coloque las placas de agar dos veces SG en una campana de flujo laminar durante 15 minutos para que se sequen. A continuación, agregue 100 microlitros de cada una de las cepas de biopelícula productoras de proteínas fluorescentes verde y roja, B.subtilis 168 cultivos iniciadores, en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.

Agita el tubo durante tres segundos. Prepare tubos con 100 microlitros de medio LB y, utilizando el cultivo mixto, cree una serie de inoculados de dilución de 10 veces. Con una micropipeta, coloque dos microlitros de cultivo mezclado no diluido en la placa de agar dos veces SG.

Repita esto con inoculados para las diluciones de 10 a uno, 10 a dos, 10 a tres y 10 a cuatro diluciones, espaciando los puntos a distancias iguales para permitir que crezcan de seis a nueve colonias en un solo plato. Incube las placas en posición vertical a 30 grados centígrados durante uno a tres días. Para comenzar, coloque placas en la plataforma de imágenes de un microscopio de detección de fluorescencia.

Para experimentos de deslizamiento y enjambre, establezca el origen de la inoculación, el centro de la placa de Petri, en la esquina del campo visible para permitir la medición de la expansión radial de la colonia. Ajuste el aumento a la resolución más alta que permita obtener imágenes de la región más grande posible de la placa de 90 milímetros. Ajuste el tiempo de exposición de forma adecuada, en función de la intensidad de la señal fluorescente.

Para el análisis de biopelículas, coloque una colonia de interés en el centro del campo de visión. Establezca la ampliación en la resolución más alta que permita ver toda la colonia. Las colonias ya están listas para la medición y el análisis.

Por último, analice los datos tal y como se describen en el protocolo de texto. Esta figura muestra el crecimiento de una colonia típica de Bacillus subtilis co-inoculada de dos cepas. El enjambre, que es un movimiento colectivo de superficie dependiente de flagelantes, da como resultado una población altamente mezclada.

En este video de lapso de tiempo, el inoculante inicial se colocó en el centro de la placa extendida. Se observa claramente un enjambre de capas delgadas y, a medida que se desarrolla la colonia, las dos cepas fluorescentes rojas y verdes aparecen mezcladas y superpuestas. Por el contrario, las imágenes del comportamiento de deslizamiento muestran sectores definidos de crecimiento que corresponden a las cepas fluorescentes marcadas de manera diferente.

Este video muestra el crecimiento de una colonia co-inoculada deslizante en la que las cepas carecen de flagelos funcionales. Estas colonias todavía son capaces de propagarse utilizando una combinación de exopolisacáridos, hidrofobina y surfactina secretados. Las colonias resultantes muestran una variedad de crecimiento espacial distinta en comparación con la cepa de enjambre.

Las colonias productoras de biopelículas iniciaron densidades celulares influyeron en gran medida en la variedad espacial de las colonias resultantes. Las colonias iniciadas con alta densidad de celdillas de las poblaciones mixtas, mostraron una variedad espacial menor o nula. Por el contrario, cuando la densidad celular al inicio era baja, se podían detectar sectores fluorescentes claros, verdes y rojos.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo determinar las abundancias relativas de las cepas marcadas con fluorescencia en colonias microbianas, examinar la segregación espacial y estudiar la influencia de la densidad de células fundadoras.