Monitoreo Segregación Espacial en la superficie colonizadores microbianos Poblaciones

El objetivo general de este procedimiento es observar la distribución espacial de cepas microbianas durante la migración por escurrimiento, deslizamiento o formación de biopelículas mediante microscopía fluorescente. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la microbiología social, como cómo influye la segregación espacial en la interacción microbiana. La principal ventaja de esta técnica es que la aptitud y la distribución espacial de las cepas microbianas pueden evaluarse fácilmente mediante técnicas microscópicas y análisis de imágenes por subsegmentos.

La procedura será demostrada por Theresa Holscher, investigadora doctoral de mi laboratorio. El día anterior al experimento, agregue tres mililitros de medio LB a un tubo de cultivo e inóquelo a partir de un stock congelado de B.subtilis. Repita esta inoculación con un tubo separado para cada cepa de interés.

Coloque los tubos en un incubador con agitación horizontal a 37 grados Celsius durante la noche. Para preparar las placas para experimentos de migración colectiva y deslizamiento, vierta 20 mililitros de medio LB templado en una placa de Petri de poliestireno de 90 milímetros. Cierre inmediatamente la placa y colóquela a un lado de la cabina de flujo laminar para que enfríe durante al menos una hora.

A continuación, prepare placas para experimentos de biopelícula de colonias vertiendo 25 mililitros de medio SG con agar dos veces en una placa de Petri de 90 milímetros. Cierre inmediatamente las placas y déjelas enfriar en pilas de cuatro o menos durante al menos una hora. Para comenzar, coloque las placas de agar LB para enjambre y deslizamiento en una cabina de flujo laminar y retire las tapas.

Deje secar las placas durante 20 minutos. La humedad de las placas en estos experimentos es crítica. Mientras que el exceso de humedad permite que las bacterias naden, un secado prolongado impide el desplazamiento colectivo (swarming) y el deslizamiento (sliding).

De manera similar, la estructura del biofilm de la colonia depende de la sequedad del medio. Mediante un espectrofotómetro, determine las densidades ópticas de los cultivos iniciadores de la noche anterior a 600 nanómetros. En un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros, mezcle cantidades normalizadas por densidad de las cepas productoras de proteína verde y roja fluorescente para un volumen total de 200 microlitros.

Vortex la tubo durante tres segundos. Utilizando una micropipeta, coloque dos microlitros de la cultura mixta en el centro de una placa de agar LB de 90 milímetros previamente secada en la cabina de flujo laminar. Deje la placa secar durante 10 minutos.

Finalmente, incubar las placas a 37 grados Celsius en posición vertical para evitar que se acumule condensación en la superficie del agar. Primero, colocar las placas de agar SG al doble durante 15 minutos en una cabina de flujo laminar para secarlas. A continuación, añadir 100 microlitros de cada cultivo inicial de cepas de biopelícula productoras de proteína verde y roja fluorescente, B.subtilis 168, en un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros.

Vortex la tubo durante tres segundos. Prepare tubos con 100 microlitros de medio LB y, utilizando el cultivo mezclado, cree una serie de diluciones de diez veces de los inóculos. Utilizando una micropipeta, aplique dos microlitros del cultivo mezclado sin diluir sobre la placa de agar SG dos veces.

Repita esto con los inóculos para las diluciones de 10 a la uno, 10 a la dos, 10 a la tres y 10 a la cuatro, colocando las muestras a distancias iguales para permitir que crezcan de seis a nueve colonias en un solo plato. Incube las placas en posición vertical a 30 grados Celsius durante uno a tres días. Para comenzar, coloque las placas en la plataforma de imagen de un microscopio detector de fluorescencia.

Para los experimentos de deslizamiento y migración colectiva, coloque el origen de la inoculación, el centro de la placa de Petri, en la esquina del campo visible para permitir la medición de la expansión radial de la colonia. Ajuste la magnificación a la resolución más alta que permita la obtención de imágenes de la región más grande posible de la placa de 90 milímetros. Ajuste el tiempo de exposición de manera adecuada, según la intensidad de la señal fluorescente.

Para el análisis de biopelículas, coloque una colonia de interés en el centro del campo de visión. Ajuste el aumento a la resolución más alta que permita visualizar toda la colonia. Ahora las colonias están listas para la medición y el análisis.

Finalmente, analice los datos según se describe en el protocolo del texto. Esta figura muestra el crecimiento de una colonia típica de Bacillus subtilis coinoculada con dos cepas. El desplazamiento colectivo sobre superficies, conocido como swarming, que depende de los flagelos, da como resultado una población altamente mezclada.

En este video de lapso de tiempo, el inóculo inicial se colocó en el centro de la extensión de la placa. Se observa claramente el desplazamiento en capa delgada y, a medida que la colonia se desarrolla, las dos cepas fluorescentes roja y verde aparecen mezcladas y superpuestas. Por el contrario, las imágenes del comportamiento de deslizamiento muestran sectores definidos de crecimiento correspondientes a las cepas fluorescentes marcadas de forma diferente.

Este video muestra el crecimiento de una colonia co-inoculada deslizante en la que las cepas carecen de flagelos funcionales. Estas colonias aún pueden extenderse mediante una combinación de exopolisacárido secretado, hidrofobina y surfactina. Las colonias resultantes muestran una distribución espacial de crecimiento distinta en comparación con la cepa que forma enjambres.

Las densidades iniciales de células en colonias productoras de biopelícula influyeron fuertemente en la distribución espacial de las colonias resultantes. Las colonias iniciadas con alta densidad celular de poblaciones mezcladas mostraron poca o ninguna distribución espacial. En contraste, cuando la densidad celular al inicio era baja, se podían detectar sectores claramente verdes y rojos fluorescentes.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo determinar las abundancias relativas de cepas marcadas con fluorescencia en colonias microbianas, examinar la segregación espacial y estudiar la influencia de la densidad de células fundadoras.