Identificación del receptor de superficie celular mediante pantallas genéticas CRISPR/Cas9 de escala de genoma

La detección de interacciones de la superficie celular utilizando enfoques bioquímicos disponibles actualmente todavía plantea desafíos técnicos. Este protocolo proporciona una alternativa genética utilizando el enfoque de cribado celular a escala del genoma para identificar las interacciones del ligando del receptor en la superficie celular. A diferencia de la mayoría de los otros métodos existentes, este método no hace suposiciones con respecto a la biología de los receptores.

Proporciona oportunidades para identificar las interacciones mediadas por una amplia gama de moléculas de superficie celular. Las moléculas de superficie celular son directamente accesibles a fármacos como los anticuerpos monoclonales. Por lo tanto, la identificación de interacciones mediadas por estas moléculas puede tener importantes implicaciones terapéuticas.

Este método es generalmente aplicable a los investigadores interesados en explorar los procesos de señalización y reconocimiento celular se encuentra en una amplia gama de contextos biológicos, incluyendo interacciones neuronales e inmunológicas, así como interacciones de patógenos del huésped. El protocolo requiere una máquina de clasificación de celdas de alto rendimiento y máquinas de secuenciación de próxima generación. Asegúrese de que estas instalaciones estén disponibles antes de iniciar el protocolo.

Comience por hacer ocho diluciones en serie de las muestras de proteína biotiniladas en una placa de 96 pocillos asegurando que el volumen final de cada dilución sea de al menos 200 microlitros y que se incluya un control de solo etiqueta. Haga una placa duplicada de las muestras retirando 100 microlitros de cada pozo y transfiriéndolos a una nueva placa de 96 pozos. Incluya un control de proteínas de solo etiqueta que se usará como sondeo de control en todos los ensayos de unión.

Añadir 100 microlitros de 0,1 microgramos por mililitro estreptavidina-PE a los pocillos en una de las placas, y 100 microlitros de tampón de dilución a los pocillos de la otra placa. Incubar la placa durante 20 minutos a temperatura ambiente. Mientras tanto, bloquee los pocillos de la placa codificada con estreptavidina con el búfer de dilución durante 15 minutos.

Después de lavar la placa, asegúrese de que esté seca. A continuación, transfiera el volumen total de la muestra de ambas placas a pozos individuales de la placa codificada de estreptavidina e incubarlo durante una hora a temperatura ambiente. Después de la incubación, lave la placa tres veces con 200 microlitros de tampón de lavado.

Añadir 100 microlitros de ratón anti-rata Cd4d3+4 IgG E incubar la placa durante otra hora. Repita los lavados. Añadir 100 microlitros de un conjugado de fosfatasa alcalina antiratón y dejar la placa a temperatura ambiente durante una hora.

A continuación, lave los pozos tres veces con tampón de lavado y una vez con tampón de dilución. Preparar fosfato p-nitrofenilo a un miligramo por mililitro en tampón de etanolamina de tinte y añadir 100 microlitros a cada pozo. Después de una incubación de 15 minutos, medir la absorbancia tienen cada pocóter a 405 nanómetros.

Utilice la dilución mínima en la que no hay señal en la placa como el factor de dilución adecuado para crear tetrámeros. Incubar la estreptavidina-PE y la dilución adecuada de proteína biotinilada durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación, almacene las proteínas conjugadas en un tubo protegido contra la luz a cuatro grados centígrados hasta su uso posterior.

Gire los tubos cónicos con las muestras tratadas y controle a 200 veces G durante cinco minutos. Retire el sobrenadante y congele uno de los tubos a menos 20 grados Centígrados para su uso posterior. Vuelva a suspender el pellet en el otro tubo en 10 mililitros de PBS con 1%BSA y reserve 100 microlitros de células como control negativo en una placa de 96 pozos.

A continuación, agregue la proteína recombinante pre conjugada a la suspensión celular en el tubo cónico y en la placa de 96 pozos. Realice la tinción celular durante al menos una hora a cuatro grados Centígrados en un rotor de sobremesa con rotación suave. Luego pele las células a 200 veces G durante cinco minutos y retire el sobrenadante.

Después de lavar las células dos veces, re-suspenderlas en cinco mililitros de PBS. Tensar las células a través de un colador de 30 micrómetros para eliminar los cúmulos celulares. A continuación, analícelos con un sodor de flujo.

Utilice la muestra de control negativo para gatear para celdas positivas BFP y células negativas PE. Luego clasifera la muestra y recoja 500.000 a 1 millón de células positivas de BFP y células negativas de PE en un tubo de centrifugación de 1,5 mililitros. La jaula dolorida dependerá de la unión de las células a la proteína, pero normalmente se recogen de una a 5% de las muestras negativas de PE.

Ahora deje que las células ordenadas centrifugando durante 500 veces G durante cinco minutos, luego retire cuidadosamente el sobrenadante. El pellet se puede almacenar a menos 20 grados Centígrados durante un máximo de seis meses. Utilice la función count de magic para asignar secuencias del rellenado no ordenado y ordenado a la biblioteca de referencia, lo que producirá un archivo de recuento sin procesar.

Ejecute la función de prueba de magia utilizando recuentos sin procesar de la muestra de control no ordenada como control y los recuentos de la muestra ordenada como tratamiento. Abra el archivo de resumen de genes generado y clasifique la columna de clasificación de pausa en orden ascendente. A continuación, identifique los hits con una tasa de detección falsa inferior a 0,05.

El receptor se clasifica generalmente muy a menudo en la primera posición. Por último, utilice R o un software equivalente para trazar la sólida puntuación del algoritmo de clasificación para la selección positiva. Las pruebas de derribo a escala del genoma para la identificación del socio de unión de las células humanas TNFSF9 y P falciparum o H5 de TNFSF9 y P falciparum Rh5 se realizaron en células NCI-SNU-1 y HEC-293 respectivamente.

El comportamiento de encuadernación de Rh5 se vio afectado tanto por el sulfato de heparan como por su receptor conocido BSG, mientras que el TN-FRSF-9 no perdió la unión a su receptor conocido TN-FSF-9. Tras la pre-incubación con heparina soluble. La distribución de GNA en la biblioteca mutante de control reveló que la complejidad de la biblioteca se mantuvo durante el transcurso del experimento.

La calidad técnica de las pantallas se evaluó examinando la distribución de los cambios observados de G-RNA dirigidos a un conjunto de referencia de genes no esenciales, en comparación con la distribución de un conjunto de referencia de genes esenciales. Además, el enriquecimiento a nivel de vía reveló que las vías esenciales esperadas fueron identificadas y enriquecidas significativamente en la población de deserción escolar. Al comparar la muestra de control con la biblioteca de plásmidos original.

El algoritmo de rango robusto o la puntuación RRA proporciona una medida de qué ARN G se clasifica constantemente más alto de lo esperado. En la pantalla de TNFRSF9, el mejor éxito fue TNFSF9, que es un socio de enlace conocido. Además, también se identificaron varios genes relacionados con la vía TP53.

En el caso de RH5, además del receptor conocido, y el gen necesario para la producción de gags sulfatados, también se identificó el gen SLC16A1. El enfoque de cribado suele ser muy robusto y el receptor que interactúa directamente debe estar altamente clasificado en la lista de genes enriquecidos en este orden de población. Es crucial validar los golpes obtenidos de la pantalla.

Si la interacción está mediada por proteínas, los enfoques bioquímicos diseñados para estudiar las interacciones binarias de proteínas proteicas, por ejemplo, podrían utilizarse para estudios de validación adicionales. Debido a la naturaleza imparcial de la escala del genoma de este enfoque, anticipamos que ayudará a explorar las interacciones mediadas por moléculas celulares difíciles de estudiar como lípidos, proteínas de membrana multipaso y glicanos. También puede revelar nuevas vías necesarias para el tráfico de receptores y la biología.