Name: Identificación del receptor de superficie celular mediante pantallas genéticas CRISPR/Cas9 de escala de genoma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-06T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Aprende a identificar receptores de superficie celular mediante pantallas genéticas CRISPR/Cas9 de escala de genoma. Este método permite descubrir interacciones receptor-ligando sin requerir conocimiento previo de la biología receptora.

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Este trabajo fue apoyado por la subvención Wellcome Trust número 206194 otorgada a GJW. Agradecemos a las instalaciones de Cytometry Core: Bee Ling Ng, Jennifer Graham, Sam Thompson y Christopher Hall por ayuda con FACS.

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Los autores no tienen nada que revelar.

Se describe una estrategia de cribado basada en CRISPR para identificar genes que codifican componentes celulares involucrados en el reconocimiento celular. Un enfoque similar mediante la activación de CRISPR también proporciona una alternativa genética para identificar los receptores que interactúan directamente con las proteínas recombinantes sin la necesidad de generar grandes bibliotecas de proteínas26. Sin embargo, una ventaja importante de este enfoque es que es aplicable a las interacciones mediadas por moléculas de superficie que se muestran de forma nativa en la célula y no depende de la sobreexpresión de los receptores, que puede influir en la avidez de unión del receptor. A diferencia de otros métodos, por lo tanto, esta técnica no hace suposiciones con respecto a la naturaleza bioquímica o la biología celular de los receptores y proporciona una oportunidad para estudiar interacciones mediadas por proteínas que normalmente son difíciles de estudiar utilizando enfoques bioquímicos, tales como proteínas muy grandes, o aquellos que atraviesan la membrana varias veces o forman complejos con otras proteínas, y moléculas distintas de proteínas como glicanos, glucólidos y fofolípidos. Dada la naturaleza a escala del genoma del método, este enfoque también tiene la ventaja de no sólo identificar el receptor, sino también los componentes celulares adicionales que se requieren para el evento de unión, proporcionando así información sobre la biología celular del receptor.
Una de las principales limitaciones de este método cuando se utiliza para identificar el receptor de una proteína huérfana es el requisito inicial de identificar primero una línea celular que se une a la proteína. Esto no siempre es fácil e identificar una línea celular que muestra un fenotipo de unión que también es permisivo para las pantallas genéticas puede ser el paso de limitación de tiempo para implementar este ensayo. Algunas líneas celulares tienden a unirse a más proteínas que otras. Esto es especialmente relevante para las proteínas que unen el HS, ya que estas proteínas tienden a unirse a cualquier línea celular que muestre las cadenas laterales del HS, independientemente del contexto de unión nativo. Además, hemos observado que la regulación ascendente de los sindecanos (es decir, los proteoglicaces que contienen ELC) en las líneas celulares conduce a una mayor unión de proteínas de unión al HS26. Esto podría ser un factor a tener en cuenta al seleccionar la línea celular para el cribado. Sin embargo, también es importante tener en cuenta que la unión aditiva del SE no interfiere con la unión a un receptor específico. Esto significa que si se observa la unión, es posible que esté mediada únicamente por el SE porque la unión mediada por el HS en este ensayo es aditiva y no codependiente19. En tal escenario, el enfoque de bloqueo de heparina descrito puede identificar tales comportamientos sin tener la necesidad de realizar una pantalla genética completa.
Un recurso útil para elegir líneas celulares es Cell Model Passport, que contiene información sobre genómica, transcriptómica y condición de cultivo para 1.000 líneas celulares de cáncer27. Dependiendo del contexto biológico, las células se pueden elegir en función de sus perfiles de expresión. Para ayudar a la selección de líneas celulares, agrupamos 1.000 líneas de celda en Cell Model Passport de acuerdo con la expresión de 1.500 glicoproteínas de superficie de células humanas preanotadas28 (Figura complementaria 2; información de clúster para cada línea de celda junto con las condiciones de crecimiento se proporcionan en la Tabla suplementaria 2). Al probar la unión de una proteína con función desconocida, es útil seleccionar un panel de líneas celulares representativas de cada clúster para aumentar la posibilidad de cubrir una amplia gama de receptores. Dada la elección, se recomienda elegir líneas celulares que sean fáciles de cultivar y fáciles de transducir. Dado que estas líneas celulares se utilizarán en el cribado a escala del genoma, es preferible que se puedan cultivar fácilmente en grandes cantidades y sean permisivas para la transducción lentiviral, ya que es el método más comúnmente disponible para la entrega de sgRNA para el cribado genético basado en CRISPR en los pasos posteriores.
Generalmente, las selecciones de fenotipo se llevan a cabo en una sola ordenación. Sin embargo, esto viene determinado por el brillo de la población de células manchadas en comparación con el control. Se podrían adoptar rondas iterativas de selecciones para escenarios en los que la relación señal-ruido del fenotipo deseado es baja, o cuando el objetivo de la pantalla es identificar mutantes que tienen fenotipos fuertes. Cuando se utiliza un enfoque de selección iterativa para pantallas basadas en FACS, es importante tener en cuenta que el proceso de clasificación puede causar la muerte celular, principalmente debido a la fuerza del clasificador. Por lo tanto, no todas las celdas recogidas se representarán en la siguiente ronda de clasificación.
La complejidad de la biblioteca es un factor muy importante para realizar pruebas genéticas exitosas, especialmente para las pantallas de selección negativas, ya que el grado de agotamiento en estos sólo se puede determinar comparando los resultados con lo que estaba presente en la biblioteca inicial. Para las pantallas de selección negativas, es común mantener bibliotecas de 500-1.000 x complejidad. Las pantallas de selección positivas, sin embargo, son más robustas para los tamaños de biblioteca, porque en tales pantallas sólo se espera que se seleccione un pequeño número de mutantes para un fenotipo en particular. Por lo tanto, en la pantalla de selección positiva descrita aquí, el tamaño de la biblioteca se puede reducir a 50-100x complejidad sin comprometer la calidad de la pantalla. Además, en estas pantallas también es posible utilizar una biblioteca de control para una línea celular determinada en un día determinado como un "control general" para todas las muestras ordenadas en el día para esa línea celular dada. Esto reducirá el número de bibliotecas de control que deben producirse y secuenciarse.
Otra consideración importante para el uso de este enfoque son las limitaciones de las pantallas de pérdida de función en la identificación de genes que son esenciales para el crecimiento celular in vitro. El momento de las pantallas es crucial en este sentido, ya que cuanto más tiempo se mantienen las células mutantes en el cultivo, mayor es la probabilidad de que las células con mutaciones en genes esenciales se vuelvan inviables y ya no estén representadas en la biblioteca mutante. Las recientes pruebas genéticas realizadas como parte de la iniciativa Project Score en más de 300 líneas celulares muestran que múltiples genes en la secreción de proteínas anotadas por KEGG y la vía de glicosilación N a menudo se identifican como esenciales para una serie de líneas celulares (Figura complementaria 3)29. Esto se puede tener en cuenta al diseñar pantallas si se debe investigar el efecto de los genes necesarios para la proliferación y la viabilidad en el contexto del proceso de reconocimiento celular. En este caso, la realización de pantallas en un punto de tiempo temprano (por ejemplo, el día 9 después de la traducción) sería generalmente apropiado. Sin embargo, si el enfoque se utiliza para identificar algunos objetivos con efectos de tamaño fuerte en lugar de vías celulares generales, podría ser apropiado realizar pantallas en un momento posterior (por ejemplo, día 15-16 después de latransducción).
Los resultados del cribado son muy robustos; en ocho pantallas de unión a proteínas recombinantes realizadas en el pasado, el receptor de superficie celular fue el principal golpeado en cada caso19. Al utilizar este enfoque para identificar al socio de interacción, por lo tanto, uno debe esperar que el receptor y los factores que contribuyen a su presentación en la superficie se identifiquen con una alta confianza estadística. Una vez que se realiza la pantalla y se valida un golpe utilizando un solo knockout de gRNA, se pueden realizar seguimientos adicionales utilizando métodos bioquímicos existentes como AVEXIS4 y la unión saturable directa de proteínas purificadas utilizando resonancia de plasmon superficial. El enfoque descrito aquí es aplicable a todas las proteínas para las que es posible generar una sonda de unión recombinante soluble.
En resumen, se trata de un enfoque CRISPR knockout a escala del genoma para identificar interacciones mediadas por proteínas de superficie celular. Este método es generalmente aplicable para identificar las vías celulares necesarias para el reconocimiento de la superficie celular en una amplia gama de contextos biológicos diferentes, incluso entre las propias células de un organismo (por ejemplo, reconocimiento neuronal e inmunológico), así como entre las células huésped y las proteínas patógenas. Este método proporciona una alternativa genética a los enfoques bioquímicos diseñados para la identificación de receptores, y debido a que no requiere ninguna suposición previa con respecto a la naturaleza bioquímica o biología celular de los receptores tiene un gran potencial para hacer descubrimientos completamente inesperados.

Las interacciones extracelulares por las proteínas receptoras de superficie celular dirigen procesos biológicos importantes como la organización del tejido, el reconocimiento del patógeno huésped y la regulación inmune. Investigar estas interacciones es de interés para la comunidad biomédica más amplia, porque los receptores de membrana son objetivos procesables de terapias entregadas sistemáticamente como anticuerpos monoclonales. A pesar de su importancia, el estudio de estas interacciones sigue siendo técnicamente difícil. Esto se debe principalmente a que los receptores incrustados en membrana son anfipáticos, lo que dificulta el aislamiento de las membranas biológicas para la manipulación bioquímica, y sus interacciones se caracterizan por las débiles afinidades de interacción(KDs en el rango de M-mM)1. En consecuencia, muchos métodos de uso común no son adecuados para detectar esta clase de interacciones proteicas1,2.
Una gama de métodos se ha desarrollado para investigar específicamente las interacciones extracelulares receptor-ligand que tienen en cuenta sus propiedades bioquímicas únicas3. Algunos de estos enfoques implican expresar todo el ectodominio de un receptor como proteína recombinante soluble en sistemas basados en mamíferos o células de insectos para asegurarse de que estas proteínas contienen modificaciones posttranslacionales que son estructuralmente importantes, como los glicanos y los enlaces disulfuros. Para superar el enlace de baja afinidad, los ectodominios a menudo se oligomerizan para aumentar su avidez de enlace. Los ectodominios proteicos ávidos se han utilizado con éxito como sondas de unión para identificar socios de interacción en pantallas de interacción proteína-proteína recombinante directa4,5,6,7. Si bien son ampliamente exitosos, los métodos basados en proteínas recombinantes requieren que el ectodominio de un receptor de membrana se produzca como una proteína soluble. Por lo tanto, sólo es generalmente aplicable a proteínas que contienen una región extracelular contigua (por ejemplo, de paso único tipo I, tipo II o anclado A GPI) y no es generalmente adecuado para complejos receptores y proteínas de membrana que abarcan la membrana varias veces.
Las técnicas de clonación de expresiones en las que una biblioteca de DNA complementarios (cDNAs) se transfecta en las células y se ha probado para un fenotipo de ganancia de unión también se han utilizado para identificar interacciones proteínas y proteínas extracelulares8. La disponibilidad de grandes colecciones de plásmidos de expresión de ADNc clonados y secuenciados en los últimos años ha facilitado métodos en los que las líneas celulares que sobreexpresan los cDNAs que codifican los receptores de superficie celular se examinan para la unión de proteínas recombinantes para identificar interacciones9,,10. Los enfoques basados en la sobreexpresión de ADNn. a diferencia de los métodos basados en proteínas recombinantes, ofrecen la posibilidad de identificar interacciones en el contexto de la membrana plasmática. Sin embargo, el éxito del uso de construcciones de expresión de ADNc depende de la capacidad de las células para sobreexpresar la proteína en la forma correctamente doblada, pero esto a menudo requiere factores accesorios celulares como transportadores, chaperones y el ensamblaje oligomérico correcto. Por lo tanto, la transfectación de un solo ADNc podría no ser suficiente para lograr la expresión de la superficie celular.
Las técnicas de cribado que utilizan construcciones de ADNc o sondas de proteína recombinante consumen muchos recursos y requieren grandes colecciones de ADNb o bibliotecas de proteínas recombinantes. Recientemente se han utilizado métodos basados en espectrometría de masas diseñados específicamente para identificar interacciones extracelulares que no requieren el montaje de bibliotecas grandes. Sin embargo, estas técnicas requieren manipulación química de la superficie celular, que puede alterar la naturaleza bioquímica de las moléculas presentes en la superficie de las células y actualmente sólo son aplicables para interacciones mediadas por proteínas glicosiladas11,12. La mayoría de los métodos actualmente disponibles también se centran en gran medida en las interacciones entre proteínas, ignorando en gran medida la contribución del microambiente de membrana, incluyendo moléculas como glicanos, lípidos y colesterol.
El reciente desarrollo de la focalización bialélica altamente eficiente utilizando enfoques basados en CRISPR ha permitido bibliotecas a escala del genoma de células que carecen de genes definidos en un solo grupo que se pueden examinar de manera sistemática e imparcial para identificar los componentes celulares implicados en diferentes contextos, incluyendo la disección de procesos de señalización celular, la identificación de perturbaciones que confieren resistencia a fármacos, toxinas y patógenos, y la determinación de la especificidad de los anticuerpos13,14,15,16. Aquí, describimos un ensayo de cribado de células eliminatorias basado en CRISPR a escala genómico que proporciona una alternativa a los enfoques bioquímicos actuales para identificar interacciones extracelulares entre receptores y ligand. Este enfoque de identificación de interacciones mediadas por receptores de membrana por pantallas genéticas es particularmente adecuado para los investigadores que tienen un interés centrado en los ligandos individuales porque evita la necesidad de compilar grandes bibliotecas de cDNAs o proteínas recombinantes.
Este ensayo consta de tres pasos principales: 1) Las sondas de unión a proteínas recombinantes altamente ávidas que consisten en las regiones extracelulares de un receptor de interés se producen y se utilizan en ensayos de unión basados en fluorescencia de flujo basados en fluorescencia; 2) Los ensayos de unión se utilizan para identificar una línea celular que expresa el socio de interacción de la sonda de proteína recombinante; 3) Se produce una versión que expresa Cas9 de la línea celular que interactúa con la proteína de interés y se realiza una pantalla eliminatoria basada en CRISPR/Cas9 a escala del genoma (Figura 1). En esta pantalla genética, la unión de una proteína recombinante a las líneas celulares se utiliza como un fenotipo medible en el que las células dentro de la biblioteca knockout que han perdido la capacidad de unir la sonda se ordenan mediante la clasificación celular activada basada en fluorescencia (FACS) y los genes que causaron la pérdida del fenotipo de unión identificado por la secuenciación. En principio, se identifican los genes que codifican el receptor responsable de la unión de la sonda ávida y los necesarios para su visualización de la superficie celular.
El primer paso de este protocolo implica la producción de ávidas sondas de proteína recombinante que representan el ectodominio de los receptores unidos a la membrana. Se sabe que estos receptores conservan con frecuencia sus funciones de unión extracelular cuando sus ectodominios se expresan como una proteína soluble recombinante1. Para una proteína de interés, las proteínas recombinantes solubles se pueden producir en cualquier sistema de expresión de proteínas eucariotas adecuado en cualquier formato, siempre que se puedan oligomerizar para una mayor avidez de unión, y contiene etiquetas que se pueden utilizar en ensayos de unión basados en citometría de flujo basado en fluorescencia (por ejemplo, etiqueta FLAG, etiqueta de biotina). Los protocolos detallados para la producción de ectodominios solubles de receptores de membrana utilizando el sistema de expresión de proteínas HEK293, así como diferentes técnicas de multimerización y las construcciones de expresión de proteínas para la producción de proteínas pentaméricas y monoméricas se han descrito previamente1,,17. El protocolo aquí describirá los pasos para generar sondas fluorescentes ávidas a partir de proteínas biotiniladas monoméricas conjugandolas con estreptavidina conjugada con un fluorocromo (por ejemplo, fitoerytrina o PE), que se pueden utilizar directamente en ensayos de unión basados en células y tiene la ventaja de no requerir un anticuerpo secundario para la detección. Los protocolos generales para realizar pantallas de escala genómico ya se han descrito20,21, por lo tanto, el protocolo se centra principalmente en los detalles de la realización de pantallas de unión a proteínas recombinantes basadas en citometría de flujo utilizando el sistema de cribado knockout CRISPR/Cas9 utilizando la biblioteca Human V1 ("Yusa")18.

<table><tbody><tr><td>Fosfatasa alcalina anti-ratón</td><td>Sigma</td><td>A4656</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidina</td><td>Chem-Cruz</td><td>SC-204655</td><td></td></tr><tr><td>Sangre & Kit Maxi de ADN de cultivo celular</td><td>Qiagen</td><td>13362</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A9647-100G</td><td></td></tr><tr><td>Dietanolamina</td><td>Sigma</td><td>398179</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>Dneasy Kit de sangre y tejidos</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-96 Imán lateral</td><td>Invitrogen</td><td>12331D</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T embalaje células</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Sigma</td><td>H4784-1G</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix</td><td>Kapa</td><td>KK2602</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina LTX con reactivo PLUS</td><td>Invitrogen</td><td>15338100</td><td></td></tr><tr><td>MoFlo XDP clasificador de células</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ni2+-NTA perlas de agarosa</td><td>Jena Bioscience</td><td>AC-501-25</td><td></td></tr><tr><td>OPTI-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo OX-68</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA1022R</td><td></td></tr><tr><td>p-nitrofenil fosfato</td><td>Sigma</td><td>1040-506</td><td></td></tr><tr><td>PD-10 Columnas de desalinización</td><td>GE healthcare</td><td>17085101</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de polipropileno con volumen de lecho de 5 mL</td><td>Qiagen</td><td>34964</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasa K, recombinante, grado PCR</td><td>Roche</td><td>3115879001</td><td></td></tr><tr><td>Puromicina</td><td>Gibco</td><td>A11138-03</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Hot Start de alta fidelidad 2 veces; Master Mix</td><td>NEB</td><td>M0494L</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Kit de purificación PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Filtro SCFA</td><td>Nalgene</td><td>190-2545</td><td></td></tr><tr><td>Sony Clasificador de células</td><td>Sony</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spri (Agencourt AMPure XP beads)</td><td>Beckman</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Placas de microtitulación recubiertas de estreptavidina</td><td>Nalgene</td><td>734-1284</td><td></td></tr><tr><td>Estreptavidina-PE</td><td>Biolegend</td><td>405204</td><td></td></tr></tbody></table>

identificación del receptor de superficie celular mediante pantallas genéticas crispr/cas9 de escala de genoma

Cell Surface Receptor Identification Using Genome-Scale CRISPR/Cas9 Genetic Screens

La comunicación intercelular mediada por interacciones directas entre receptores de superficie celulares incrustados en membrana es crucial para el desarrollo normal y el funcionamiento de organismos multicelulares. Sin embargo, la detección de estas interacciones sigue siendo técnicamente difícil. Este manuscrito describe un enfoque sistemático de detección genética de knockout CRISPR/Cas9 a escala del genoma que revela las vías celulares necesarias para eventos específicos de reconocimiento de superficie celular. Este ensayo utiliza proteínas recombinantes producidas en un sistema de expresión de proteínas de mamíferos como ávidas sondas de unión para identificar socios de interacción en una pantalla genética basada en células. Este método se puede utilizar para identificar los genes necesarios para las interacciones de la superficie celular detectadas por sondas de unión recombinantes correspondientes a los ectodominios de los receptores incrustados en la membrana. Es importante destacar que, dada la naturaleza a escala del genoma de este enfoque, también tiene la ventaja de no sólo identificar el receptor directo, sino también los componentes celulares que se requieren para la presentación del receptor en la superficie celular, proporcionando así información valiosa sobre la biología del receptor.

Este manuscrito describe un enfoque de cribado basado en células a escala del genoma para identificar interacciones extracelulares entre receptores y ligand.

Identificación del receptor de superficie celular mediante pantallas genéticas CRISPR/Cas9 de escala de genoma

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and ...

La detección de interacciones de la superficie celular utilizando enfoques bioquímicos disponibles actualmente todavía plantea desafíos técnicos. Este protocolo proporciona una alternativa genética utilizando el enfoque de cribado celular a escala del genoma para identificar las interacciones del ligando del receptor en la superficie celular. A diferencia de la mayoría de los otros métodos existentes, este método no hace suposiciones con respecto a la biología de los receptores.Proporciona oportunidades para identificar las interacciones mediadas por una amplia gama de moléculas de superficie celular. Las moléculas de superficie celular son directamente accesibles a fármacos como los anticuerpos monoclonales. Por lo tanto, la identificación de interacciones mediadas por estas moléculas puede tener importantes implicaciones terapéuticas.Este método es generalmente aplicable a los investigadores interesados en explorar los procesos de señalización y reconocimiento celular se encuentra en una amplia gama de contextos biológicos, incluyendo interacciones neuronales e inmunológicas, así como interacciones de patógenos del huésped. El protocolo requiere una máquina de clasificación de celdas de alto rendimiento y máquinas de secuenciación de próxima generación. Asegúrese de que estas instalaciones estén disponibles antes de iniciar el protocolo.Comience por hacer ocho diluciones en serie de las muestras de proteína biotiniladas en una placa de 96 pocillos asegurando que el volumen final de cada dilución sea de al menos 200 microlitros y que se incluya un control de solo etiqueta. Haga una placa duplicada de las muestras retirando 100 microlitros de cada pozo y transfiriéndolos a una nueva placa de 96 pozos. Incluya un control de proteínas de solo etiqueta que se usará como sondeo de control en todos los ensayos de unión.Añadir 100 microlitros de 0,1 microgramos por mililitro estreptavidina-PE a los pocillos en una de las placas, y 100 microlitros de tampón de dilución a los pocillos de la otra placa. Incubar la placa durante 20 minutos a temperatura ambiente. Mientras tanto, bloquee los pocillos de la placa codificada con estreptavidina con el búfer de dilución durante 15 minutos.Después de lavar la placa, asegúrese de que esté seca. A continuación, transfiera el volumen total de la muestra de ambas placas a pozos individuales de la placa codificada de estreptavidina e incubarlo durante una hora a temperatura ambiente. Después de la incubación, lave la placa tres veces con 200 microlitros de tampón de lavado.Añadir 100 microlitros de ratón anti-rata Cd4d3+4 IgG E incubar la placa durante otra hora. Repita los lavados. Añadir 100 microlitros de un conjugado de fosfatasa alcalina antiratón y dejar la placa a temperatura ambiente durante una hora.A continuación, lave los pozos tres veces con tampón de lavado y una vez con tampón de dilución. Preparar fosfato p-nitrofenilo a un miligramo por mililitro en tampón de etanolamina de tinte y añadir 100 microlitros a cada pozo. Después de una incubación de 15 minutos, medir la absorbancia tienen cada pocóter a 405 nanómetros.Utilice la dilución mínima en la que no hay señal en la placa como el factor de dilución adecuado para crear tetrámeros. Incubar la estreptavidina-PE y la dilución adecuada de proteína biotinilada durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación, almacene las proteínas conjugadas en un tubo protegido contra la luz a cuatro grados centígrados hasta su uso posterior.Gire los tubos cónicos con las muestras tratadas y controle a 200 veces G durante cinco minutos. Retire el sobrenadante y congele uno de los tubos a menos 20 grados Centígrados para su uso posterior. Vuelva a suspender el pellet en el otro tubo en 10 mililitros de PBS con 1%BSA y reserve 100 microlitros de células como control negativo en una placa de 96 pozos.A continuación, agregue la proteína recombinante pre conjugada a la suspensión celular en el tubo cónico y en la placa de 96 pozos. Realice la tinción celular durante al menos una hora a cuatro grados Centígrados en un rotor de sobremesa con rotación suave. Luego pele las células a 200 veces G durante cinco minutos y retire el sobrenadante.Después de lavar las células dos veces, re-suspenderlas en cinco mililitros de PBS. Tensar las células a través de un colador de 30 micrómetros para eliminar los cúmulos celulares. A continuación, analícelos con un sodor de flujo.Utilice la muestra de control negativo para gatear para celdas positivas BFP y células negativas PE. Luego clasifera la muestra y recoja 500.000 a 1 millón de células positivas de BFP y células negativas de PE en un tubo de centrifugación de 1,5 mililitros. La jaula dolorida dependerá de la unión de las células a la proteína, pero normalmente se recogen de una a 5% de las muestras negativas de PE.Ahora deje que las células ordenadas centrifugando durante 500 veces G durante cinco minutos, luego retire cuidadosamente el sobrenadante. El pellet se puede almacenar a menos 20 grados Centígrados durante un máximo de seis meses. Utilice la función count de magic para asignar secuencias del rellenado no ordenado y ordenado a la biblioteca de referencia, lo que producirá un archivo de recuento sin procesar.Ejecute la función de prueba de magia utilizando recuentos sin procesar de la muestra de control no ordenada como control y los recuentos de la muestra ordenada como tratamiento. Abra el archivo de resumen de genes generado y clasifique la columna de clasificación de pausa en orden ascendente. A continuación, identifique los hits con una tasa de detección falsa inferior a 0,05.El receptor se clasifica generalmente muy a menudo en la primera posición. Por último, utilice R o un software equivalente para trazar la sólida puntuación del algoritmo de clasificación para la selección positiva. Las pruebas de derribo a escala del genoma para la identificación del socio de unión de las células humanas TNFSF9 y P falciparum o H5 de TNFSF9 y P falciparum Rh5 se realizaron en células NCI-SNU-1 y HEC-293 respectivamente.El comportamiento de encuadernación de Rh5 se vio afectado tanto por el sulfato de heparan como por su receptor conocido BSG, mientras que el TN-FRSF-9 no perdió la unión a su receptor conocido TN-FSF-9. Tras la pre-incubación con heparina soluble. La distribución de GNA en la biblioteca mutante de control reveló que la complejidad de la biblioteca se mantuvo durante el transcurso del experimento.La calidad técnica de las pantallas se evaluó examinando la distribución de los cambios observados de G-RNA dirigidos a un conjunto de referencia de genes no esenciales, en comparación con la distribución de un conjunto de referencia de genes esenciales. Además, el enriquecimiento a nivel de vía reveló que las vías esenciales esperadas fueron identificadas y enriquecidas significativamente en la población de deserción escolar. Al comparar la muestra de control con la biblioteca de plásmidos original.El algoritmo de rango robusto o la puntuación RRA proporciona una medida de qué ARN G se clasifica constantemente más alto de lo esperado. En la pantalla de TNFRSF9, el mejor éxito fue TNFSF9, que es un socio de enlace conocido. Además, también se identificaron varios genes relacionados con la vía TP53.En el caso de RH5, además del receptor conocido, y el gen necesario para la producción de gags sulfatados, también se identificó el gen SLC16A1. El enfoque de cribado suele ser muy robusto y el receptor que interactúa directamente debe estar altamente clasificado en la lista de genes enriquecidos en este orden de población. Es crucial validar los golpes obtenidos de la pantalla.Si la interacción está mediada por proteínas, los enfoques bioquímicos diseñados para estudiar las interacciones binarias de proteínas proteicas, por ejemplo, podrían utilizarse para estudios de validación adicionales. Debido a la naturaleza imparcial de la escala del genoma de este enfoque, anticipamos que ayudará a explorar las interacciones mediadas por moléculas celulares difíciles de estudiar como lípidos, proteínas de membrana multipaso y glicanos. También puede revelar nuevas vías necesarias para el tráfico de receptores y la biología.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

La técnica de determinación del genotipo se describe aquí, que las parejas de reacción en cadena de la polimerasa fluorescente (PCR) para electroforesis capilar en gel, permite para el genotipado de alto rendimiento de clones knockout nucleasa mediada. Se evita limitaciones que enfrentan las otras técnicas de genotipificación y es más rentable que los métodos de secuenciación.

Usando una técnica fluorescente PCR-capilar Electroforesis en gel con el genotipo CRISPR / Cas9 mediada Knockout mutantes en un formato de alto rendimiento

Este protocolo describe los pasos necesarios para diseñar y realizar targeting multiplexados de potenciadores con la desactivación proteína de fusión SID4X-dCas9-Cascarudo, también conocido como interferencia de enhancer (potenciador-i). Este protocolo permite la identificación de los reforzadores que regulan la expresión génica y facilita la disección de las relaciones entre los potenciadores de regulación de un gen de destino común.

Disección de la función del reforzador mediante Multiplex basados en CRISPR potenciador de interferencia en líneas celulares

Aquí, presentamos un protocolo para optimizar CRISPR Cas9 para lograr una mayor especificidad sin la pérdida de actividad en el blanco. Utilizamos un enfoque de evolución dirigida llamado Sniper-pantalla para encontrar a un mutante Cas9 con las características deseadas. Sniper-Cas9 es compatible con truncado solo guía RNAs y entrega en un formato de ribonucleoproteína, conocidas estrategias para lograr mayor especificidad.

Uso de francotirador Cas9 para minimizar efectos Off-target de CRISPR Cas9 sin la pérdida de actividad en blanco mediante evolución dirigida

Una biblioteca CRISPR/sgRNA ha sido aplicada a interrogar a genes de la proteína-codificación. Sin embargo, la factibilidad de una biblioteca sgRNA para descubrir la función de un límite CTCF en Regulación génica sigue siendo inexplorada. Aquí, describimos una biblioteca de sgRNA específicos HOX loci para aclarar la función de los límites CTCF en loci HOX .

HOX Loci enfocado CRISPR/sgRNA biblioteca proyección identificación crítica CTCF límites

La tecnología CRISPR-Cas9 proporciona un método eficiente para editar con precisión el genoma de mamíferos en cualquier tipo de célula y representa un medio novedoso para realizar pantallas genéticas en todo el genoma. Aquí se proporciona un protocolo detallado que analiza los pasos necesarios para el buen rendimiento de las pantallas CRISPR-Cas9 agrupadas para todo el genoma.

Pantallas genéticas basadas en CRISPR en células de mamíferos

La Biotinilación Mejorada por Iluminación Restringida por Localización específica (ALIBi) es un método novedoso activado optogenéticamente desarrollado para marcar y purificar afinidad poblaciones subcelulares de ribosomas para secuenciación posterior y análisis proteómico.

Aislamiento de subpoblaciones subcelulares de ribosomas basadas en biotinilación potenciada por iluminación restringida por etiquetas péptidas específicas de péptidos recombinantes

Un obstáculo importante para tecnologías como CRISPR son los eventos fuera del objetivo que pueden alterar genes vitales. La «circularización para la notificación in vitro de los efectos de la escisión mediante secuenciación» (CIRCLE-seq) es una técnica diseñada para identificar los sitios de escisión no intencionados. Este método mapea la actividad de CRISPR-Cas9 en todo el genoma con alta sensibilidad y sin sesgos.

CIRCLE-SEQ para la interrogación de la edición de genes fuera del objetivo

El artículo describe un protocolo para la aplicación de un modelo in vitro de agotamiento para completar un cribado de knockout de CRISPR en todo el genoma en células T receptoras de antígenos quiméricos de donantes sanos.

Realización de un cribado de knockout CRISPR en todo el genoma in vitro en células T receptoras de antígenos quiméricos

Aquí, presentamos un protocolo que integra la tecnología CRISPR/Cas9 con el ensayo Cell Counting Kit-8 (CCK-8) para identificar genes candidatos que son cruciales para la capacidad proliferativa anormal de las células madre y progenitoras hematopoyéticas.

Evaluación de genes anormales relacionados con el crecimiento de células madre y progenitoras hematopoyéticas mediante la combinación de la tecnología CRISPR/Cas9 con el recuento de células

Se ofrece un enfoque meticuloso y estructurado para seleccionar genes resistentes y sensibles a la radiación mediante la aplicación de un método de cribado CRISPR/Cas9 de todo el genoma. Este protocolo también tiene el potencial de servir como un marco versátil para otros esfuerzos de investigación que investigan los mecanismos de resistencia a los medicamentos químicos administrados clínicamente.

Cribado CRISPR de todo el genoma para revelar genes radiosensibles y radiorresistentes

Desarrollamos un protocolo optimizado de cribado knockout CRISPR-Cas9 para células CAR T primarias. Al reducir la retención de ADNgDNA mediante la digestión enzimática y la reducción de la extracción de casetes de ARNg, este enfoque minimiza los artefactos de PCR, asegurando una detección precisa de ARNsgDNA y una identificación robusta de dianas génicas funcionales.

Mejorando las pantallas CRISPR-Cas9 en células CAR T: un método refinado para la preparación de bibliotecas

Aprende a identificar receptores de superficie celular mediante pantallas genéticas CRISPR/Cas9 de escala de genoma. Este método permite descubrir interacciones receptor-ligando sin requerir conocimiento previo de la biología receptora.

Identificación del receptor de superficie celular mediante pantallas genéticas CRISPR/Cas9 de escala de genoma

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