Una sola célula de la expresión génica utilizando multiplex RT-qPCR para caracterizar heterogeneidad de las poblaciones linfoides Raras

Este protocolo describe la forma de evaluar la expresión de una gran variedad de genes a nivel clonal. Una sola célula de RT-qPCR produce resultados altamente fiables con una fuerte sensibilidad para cientos de muestras y los genes.

El objetivo general de este experimento es observar la expresión génica múltiple en células individuales. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunología, como la heterogeneidad de las firmas moleculares dentro de una población celular o una firma molecular rara. La principal ventaja de esta técnica es que se pueden evaluar firmas moleculares específicas con al menos 48 genes diferentes en muchas células al mismo tiempo.

Comience este procedimiento preparando una mezcla de preamplificación para 48 reacciones en un tubo de 1,5 mililitros. Añadir al tubo 240 microlitros de tampón de retrotranscripción específico, 62,4 microlitros de tampón TE bajo en EDTA y 9,6 microlitros de ADN polimerasa Taq. Con una pipeta electrónica, distribuya 6,5 microlitros de la mezcla de preamplificación a cada uno de los 48 pocillos en una placa de celda única de 96 pocillos.

A continuación, prepare una mezcla de ensayo de 0,2x en un tubo de 1,5 mililitros. Añadir al tubo 1,4 microlitros de cada cebador. Ajuste el volumen final a 140 microlitros con tampón EDTA TE bajo.

Con una pipeta electrónica, distribuya 2,5 microlitros de la mezcla de ensayo 0,2x a los 48 pocillos de la placa clasificadora de celda única de 96 pocillos, que contiene la mezcla de preamplificación. Selle la placa con una película de cubierta. Agite el plato y gírelo a 280 veces g durante un minuto.

Las células linfoides innatas hepáticas individuales, o ILC, se clasificarán mediante clasificación de células activadas por fluorescencia. Comience este procedimiento utilizando una placa vacía de 96 pocillos como prueba. Coloque la placa de prueba en el soporte de la placa con el pocillo a la izquierda y hacia el experimentador.

Ajuste el soporte de la placa para obtener una gota en el centro del pozo con cuentas de verificación. Cuando esté correctamente ajustado, coloque la placa clasificadora de celda única de 96 pocillos que contiene la mezcla de ensayo y la preamplificación en el soporte de la placa. Dibuje el diseño de la placa y ordene una celda por pocillo de la población cerrada.

El posicionamiento adecuado de cada celda en la placa clasificadora de celda única de 96 pocillos es esencial, y el diseño de la placa debe mantenerse en un software de hoja de cálculo. Deje un pocillo que contenga una mezcla de ensayo de 0,2x y una mezcla de preamplificación sin celdas, como control sin entrada. Opcionalmente, deje dos filas de seis pocillos para la dilución de ADNc como controles para la eficiencia del cebador.

Inmediatamente después de la clasificación de una sola célula, vórtice y gire hacia abajo la placa de clasificación de una sola célula de 96 pocillos. Coloque la placa en el termociclador. Realice la transcripción inversa y la preamplificación como se indica.

Se requiere la preamplificación de genes diana específicos en células individuales clasificadas para tener suficiente material. Diluya las muestras preamplificadas añadiendo 36 microlitros de tampón TE de bajo EDTA en cada pocillo. Para comenzar este procedimiento, prepare 191 microlitros de una mezcla maestra pipeteando 175 microlitros de una mezcla maestra de qPCR y 17,5 microlitros del reactivo de carga de muestras en un tubo de 1,5 mililitros.

En una nueva placa de 96 pocillos, distribuya 3,6 microlitros de la mezcla maestra a cada uno de los 48 pocillos. Esta es la placa de muestra de 96 pocillos. Transfiera 2,9 microlitros de ADNc preamplificado de la placa de clasificación de una sola célula de 96 pocillos a la nueva placa de muestra de 96 pocillos, manteniendo la misma posición para cada muestra entre las dos placas.

Prepare una placa de ensayo de 96 pocillos distribuyendo tres microlitros de reactivo de carga de ensayo a cada uno de los 48 pocillos en una nueva placa de 96 pocillos. Agregue tres microlitros de cebadores a cada pocillo. Es esencial la posición adecuada de cada cebador en la placa de ensayo de 96 pocillos.

Mantenga un diseño de placa en un software de hoja de cálculo. Para comenzar este procedimiento, coloque el circuito microfluídico integrado, o IFC, en el banco y revise las válvulas con una jeringa. Retire la tapa de la jeringa, colóquela perpendicular a una válvula y presione firmemente.

La junta tórica debe moverse. Llene el chip con líquido de línea de control. Después de repetir los pasos anteriores con la segunda válvula, retire la película negra de la parte inferior del chip.

Cargue el chip en el controlador IFC. En la pantalla del controlador IFC, seleccione prime y, a continuación, ejecute. A continuación, expulse el chip y vuelva a sellar la película negra en la parte inferior del chip.

Con una pipeta de ocho canales, transfiera cinco microlitros de la placa de ensayo de 96 pocillos al lado uno o izquierdo del chip. Cambie las puntas para cada pocillo de la ficha. Evite crear burbujas, y si aparecen burbujas, use puntas de 10 microlitros para eliminarlas.

Llene el lado izquierdo del chip como se indica. De la misma manera, llene el lado derecho del chip con cinco microlitros de la placa de muestra de 96 pocillos. Para el éxito de este experimento, es esencial que el chip IFC esté correctamente llenado para una carga adecuada en el controlador IFC.

Retire la película azul de la parte inferior del chip y cargue el chip en el controlador IFC. En la pantalla del controlador IFC, seleccione cargar combinación y, a continuación, ejecutar. Cuando haya terminado, expulse el chip y vuelva a sellar la película azul en la parte inferior del chip.

Para ejecutar el chip, primero seleccione el software de recopilación de datos en la computadora qPCR microfluídica. Una vez que se inicie, seleccione nueva ejecución. Seleccione expulsar y cargue el chip.

Después de configurar el software como se describe en el protocolo de texto, seleccione iniciar ejecución. La reacción tardará aproximadamente 90 minutos. Para comenzar el análisis de datos, abra el software de análisis de PCR en tiempo real, seleccione archivo y abra, busque la carpeta del experimento y seleccione chip run dot b m un archivo.

Haga clic en la vista de análisis, la tabla de resultados y la vista de mapa de calor. Las cajas marcadas con una x están por debajo del nivel de detección del umbral y/o tenían curvas de amplificación incorrectas. Asigne un nombre a las muestras.

Vaya a la configuración de muestra y seleccione el nuevo SBS 96. Haga clic en mapeo y seleccione el diseño de muestra de acuerdo con el diseño de placa de muestra de 96 pocillos. Copie y pegue el diseño de diseño de muestra del software de hoja de cálculo.

Defina el diseño pegado como nombre de muestra. Utilice el mismo procedimiento para nombrar los ensayos. Introduzca los nombres de los cebadores en la configuración del detector y defina el diseño pegado como nombre del detector.

Haga clic en análisis, ver y analizar. Seleccione el archivo, exporte y guarde como resultados del mapa de calor. Mediante citometría de flujo, las poblaciones hepáticas de ILC se clasificaron en función de los marcadores de ILC ampliamente expresados, y se definieron tres poblaciones distintas.

Un chip de expresión génica multiplex de una sola célula correctamente cargado debe aparecer con líneas rectas y filas, con cada cámara de reacción llena y en la misma dimensión. Un chip cargado incorrectamente tendrá líneas vacías y filas de cámaras de reacción, así como líneas de doblado. Esta figura de amidita de fluoresceína de un chip correctamente cargado muestra diferencias en el brillo de la cámara de reacción que aparecen después de unos pocos ciclos.

Las cámaras de reacción con una señal de amplificación parecen más brillantes que las cámaras de reacción con señales de amplificación bajas o nulas. Después de la clasificación celular adecuada, la preamplificación y la carga, la población de ILC parecía heterogénea para la expresión génica en el hígado de ratones adultos de tipo salvaje. A la izquierda hay un mapa de calor sin modificaciones.

A la derecha se muestra el mapa de calor modificado obtenido después de la definición de la muestra y el nombre del ensayo. Mediante el uso de software en línea, se identificaron las firmas de expresión génica específicas de las células y las relaciones de la población celular. Cada línea representa un gen, y cada fila representa la misma célula, y las tres poblaciones de células están representadas en azul, rojo y verde.

Una vez dominada, esta técnica se puede hacer en nueve horas, si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante realizar un seguimiento cuidadoso de la orientación de la placa para las distribuciones de celdas y cebadores. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores exploraran firmas moleculares raras y específicas en poblaciones celulares.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo evaluar la expresión génica múltiple en muchas células individuales al mismo tiempo, después de la clasificación, preamplificación y carga celulares adecuadas.