Medir la funcionalidad de la placa neuromuscular

El objetivo general de este procedimiento es estudiar la funcionalidad de la unión neuromuscular mediante un enfoque experimental ex vivo. Esto se logra estimulando la preparación del nervio muscular de dos maneras: directamente sobre la membrana muscular y a través del nervio. Dado que la estimulación de la membrana evita la señalización de la transmisión nerviosa, cualquier diferencia entre las dos respuestas contráctiles puede considerarse una medición indirecta de la funcionalidad de la unión neuromuscular.

Aquí presentamos este procedimiento en la preparación del nervio ciático del sóleo. El músculo se disecciona junto con su nervio y se coloca en un baño de tejidos perfundido. Se fija a un controlador de fuerza y longitud, y se colocan un par de electrodos de platino paralelos al músculo.

Un electrodo de succión de vidrio se acerca entonces al extremo seccionado del nervio. A continuación, se aplica un protocolo exhaustivo de pruebas para evaluar minuciosamente tanto la unión neuromuscular como la funcionalidad muscular. La conexión funcional entre el músculo y el nervio es concluyente tanto para la parte como para la fracción sobreviviente dos.

En la primera región del nivel de cada uno de los dos tejidos, se comunica que estas uniones neuromusculares, que normalmente presentan una morfología similar a la de una placa motora. Sin embargo, en varias condiciones patológicas, la funcionalidad interactiva entre el músculo y el nervio se ve gravemente comprometida y las uniones neuromusculares pierden la organización morfológica compleja. El objetivo general de nuestro procedimiento es estudiar la funcionalidad de las uniones neuromusculares mediante un enfoque experimental ex vivo.

Esto se logra estimulando la preparación del nervio muscular de dos maneras: una mediante la estimulación directa de la membrana muscular y la otra estimulando el nervio y analizando las propiedades musculares. Encienda el baño de agua con circulación y ajuste la temperatura a 30 grados Celsius.

Llene el baño con la solución de Krebs-Ringer. Permita que fluya 0,4 bar de la mezcla de gas a través del oxitubo y hacia el baño. Encienda el transductor del actuador y los dos estimuladores de pulso.

Establezca los valores de corriente en 300 millones de pares para la estimulación de la membrana y en cinco millones de pares para la estimulación del nervio. Después de sacrificar el ratón mediante dislocación cervical, retire la piel de las patas. Ahora corte el tendón de Aquiles y, mientras sujeta firmemente el tendón con una pinza, tire hacia arriba del músculo gastrocnemio y del sóleo juntos.

Una vez expuesto el tendón proximal del sóleo, corte toda la pantorrilla por encima de este y coloque rápidamente la muestra en el baño de tejidos preparatorio ubicado bajo el microscopio estereoscópico. Utilizando un par de pinzas, sujete firmemente el tendón proximal del sóleo y tire suavemente para exponer la inervación ciática. Una vez expuesta la inervación, elimine los tejidos circundantes para revelar unos cinco milímetros del nervio.

Luego, use un par de tijeras finas para cortar cuidadosamente el nervio. Complete la extirpación del músculo y el nervio cortando el tendón de Aquiles para separar el sóleo del gastrocnemio. Ahora, la preparación del músculo y el nervio está lista para ser montada en el aparato de prueba.

Cree un nudo corredizo en el extremo del hilo de nailon y apriételo alrededor del tendón de Aquiles. Sujete el tendón proximal dentro del sujetador fijo y ate el hilo de nailon al brazo de palanca del transductor de fuerza. Deje que el músculo se equilibre en la solución.

Para determinar la longitud inicial óptima, estimule el músculo con una serie de pulsos individuales mientras ajusta suavemente el valor de la carga de fluencia. La longitud óptima se alcanza cuando la fuerza del espasmo es máxima. Coloque los electrodos de succión cerca del músculo y tire del nervio hacia adentro.

Luego, mientras se modifica suavemente el valor de la corriente de pulso, estimule el músculo con una serie de pulsos individuales. La fuerza de contracción generada por el músculo al ser estimulado a través del nervio debe ser igual a los valores medidos al estimularlo en la membrana. Una vez determinado el valor óptimo de corriente, retire el nervio del electrodo y aplique algunos pulsos de corriente.

Si la cantidad de corriente previamente seleccionada es excesiva, los pulsos de corriente entregados a través del electrodo de succión provocan la contracción muscular al conducir la corriente a través del baño. Mediante un software casero, ideamos un protocolo automatizado de pruebas para el estudio de la funcionalidad de la unión neuromuscular del sóleo. El protocolo dura aproximadamente 65 minutos y consta de cuatro partes diferentes.

En la primera parte, el músculo se estimula con cuatro pulsos simples. Dos aplicados directamente y dos a través del nervio. Luego, se miden el tiempo hasta el pico, el tiempo medio de relajación, el valor máximo de la derivada de la fuerza y la fuerza del espasmo a partir de las respuestas de espasmo.

En la segunda parte, el músculo se estimula con una serie de trenes de impulsos que varían desde 20 hercios hasta 80 hercios, que es la frecuencia tetánica. Para calcular las curvas de fuerza frente a frecuencia, tanto para la estimulación nerviosa como para la directa. En la tercera y cuarta partes del protocolo, el músculo se somete a dos paradigmas de fatiga para medir la falla de la transmisión neuromuscular y la fatiga intratetánica.

Durante estos paradigmas de fatiga, el músculo se estimula continuamente con un tren de impulsos aplicado sobre la membrana, seguido de 14 trenes de impulsos aplicados a través del nervio. Toda la secuencia se repite 20 veces. El primer paradigma se aplica a una frecuencia de disparo de 35 hertz.

El segundo, a la frecuencia tetánica de 80 hercios. Se cree que la falla en la transmisión neuromuscular desempeña un papel importante en el desarrollo de la fatiga, ya que está relacionada con el bloqueo externo de la propagación del potencial de acción, la disminución de la liberación del neurotransmisor y la disminución de la excitabilidad de la placa motora y de la capacidad de fatiga de la unión neuromuscular. Otro aspecto de la capacidad de fatiga en la unión neuromuscular se expresa claramente mediante la fatiga intratetánica, que es una estimación de la capacidad del músculo para mantener la fuerza durante una única contracción tetánica y refleja la fatiga de alta frecuencia.

Al final del protocolo, se miden la longitud y el peso del músculo mediante un calibrador analógico y una balanza de precisión para calcular el área de la sección transversal del músculo. Los estudios sobre el modelo transgénico de ratón SOD1 de esclerosis lateral amiotrófica han resaltado el potencial de esta metodología. De hecho, los músculos soleos transgénicos presentan una respuesta contráctil reducida tanto en la derivada de fuerza como en la fuerza tetánica cuando se estimulan directamente, y una reducción aún mayor cuando se estimulan a través del nervio.

En cuanto a la fuerza tetánica, por ejemplo, estos experimentos han demostrado que la contractilidad muscular representa el 25 % del daño, mientras que un 45 % adicional está relacionado con defectos en la transmisión neuromuscular. Otro punto interesante es la ausencia de diferencias en los músculos control cuando se estimulan directa o indirectamente. Este hallazgo demuestra que la metodología no induce artefactos técnicos, ya que se espera que la unión neuromuscular esté completamente funcional en los animales control.

En cuanto a la fatiga intratetánica, los resultados han mostrado valores significativamente más bajos en los músculos sóleos transgénicos que en sus controles. Curiosamente, el músculo sóleo transgénico sufre daños significativos por la estimulación repetitiva, lo que significa que la funcionalidad de la unión neuromuscular puede evaluarse durante un tiempo máximo de estimulación de ocho minutos. Después de ocho minutos, el músculo transgénico vuelve a un valor casi nulo de fuerza cuando se estimula.

Después de ver el video, debería haber comprendido cómo medir la funcionalidad de la unión neuromuscular y del músculo sóleo del ratón. Dado que esta técnica se basa en la medición indirecta de la funcionalidad de la unión neuromuscular, no permite determinar si los defectos reportados están relacionados con cambios morfológicos o bioquímicos. Por otro lado, este enfoque representa una manera esencial para evaluar si estas agresiones afectan la funcionalidad del señal de neurotransmisión en el usuario.

Finalmente, la propuesta del protocolo puede adoptarse fácilmente para medir la funcionalidad de la unión neuromuscular del diafragma, otro músculo frecuentemente afectado en enfermedades patológicas.