Medir la funcionalidad de la placa neuromuscular

Una evaluación funcional de la placa neuromuscular (NMJ) puede proporcionar información esencial sobre la comunicación entre el músculo y del nervio. Aquí se describe un protocolo para evaluar exhaustivamente el NMJ y músculo funcionalidad utilizando dos preparaciones diferentes músculo-nerviosa, es decir, sóleo-ciático y frénico-diafragma.

El objetivo general de este procedimiento es estudiar la funcionalidad de la unión neuromuscular mediante un enfoque experimental ex vivo. Esto se logra estimulando la preparación del nervio muscular de dos maneras, directamente en la membrana muscular y a través del nervio. Dado que la estimulación de membrana evita la señalización de la transmisión neurológica, cualquier diferencia entre las dos respuestas contráctiles puede considerarse como una medida indirecta de la funcionalidad de la unión neuromuscular.

Aquí presentamos este procedimiento en la preparación del nervio ciático sóleo. El músculo se disecciona junto con su nervio y se coloca en un baño de tejido perfundido. Se fija a un controlador de fuerza y longitud y se coloca un par de electrodos de platino paralelos al músculo.

A continuación, se mueve un electrodo de succión de vidrio cerca del extremo cortado del nervio. A continuación, se aplica un protocolo de pruebas exhaustivo para evaluar a fondo tanto la unión neuromuscular como la funcionalidad muscular. La conexión funcional entre el músculo y el nervio es la conclusión tanto para una parte como para dos facciones supervivientes.

En la primera región del nivel de cada uno de los dos tejidos se comunica que estos se unen neuromuscularmente, que normalmente muestra una presión similar a la morfología. Sin embargo, en varias condiciones patológicas, la funcionalidad interactuada entre el músculo y el nervio se ve gravemente comprometida y la unión neuromuscular pierde la compleja organización morfológica. El objetivo general de nuestro procedimiento es estudiar la funcionalidad de la unión neuromuscular mediante el uso de un enfoque experimental ex vivo.

Esto se logra estimulando la preparación del nervio muscular de dos maneras. Uno estimulando directamente la membrana muscular y el otro estimulando el nervio y analizando las propiedades musculares. Encienda el baño de agua de circulación y ajuste la temperatura a 30 grados centígrados.

Llene el baño con la solución Krebs-Ringer. Permita que el punto O cuatro bar de la mezcla de gas fluya a través del tubo oxi y hacia el baño. Encienda el actuador, el transductor y los dos estimuladores de pulsos.

Establezca los valores actuales en 300 millones de pares para la estimulación de membrana y en cinco millones de pares para la estimulación nerviosa. Después de sacrificar al ratón por dislocación cervical, retire la piel de las patas. Ahora corte el tendón de Aquiles y, mientras sujeta firmemente el tendón, junte el músculo gastrocnemio y el sóleo hacia arriba.

Una vez que el tendón proximal del sóleo está expuesto, corte toda la pantorrilla por encima de él y coloque rápidamente la muestra en el baño de tejido preparatorio ubicado bajo el microscopio estereoscópico. Con un par de pinzas, sujete firmemente el tendón proximal del sóleo y tire suavemente de él para exponer la inervación ciática. Una vez expuesta la inervación, retira los tejidos circundantes para revelar unos cinco milímetros del nervio.

Luego, use un par de tijeras finas para cortar cuidadosamente el nervio. Completar la extirpación del músculo y el nervio cortando el tendón de Aquiles para separar el sóleo del gastrocnemio. Ahora la preparación muscular y nerviosa está lista para ser montada en el aparato de prueba.

Crea un nudo corredizo en el extremo del hilo de nailon y apriétalo alrededor del tendón de Aquiles. Sujete el tendón proximal dentro de la abrazadera fija y ate el alambre de nailon alrededor del brazo de palanca del transductor de fuerza. Permita que el músculo se equilibre en la solución.

Para determinar la longitud óptima inicial, estimule el músculo con una serie de pulsos individuales mientras cambia suavemente el valor de la carga de fluencia. La longitud óptima se obtiene cuando la fuerza de contracción es máxima. Coloque los electrodos de succión cerca del músculo y tire del nervio hacia adentro.

Luego, mientras altera suavemente el valor de la corriente de pulso, estimule el músculo con una serie de pulsos individuales. La fuerza de contracción generada por el músculo cuando se estimula a través del nervio debe ser igual a los valores medidos al estimularlo en la membrana. Una vez que se determina el valor óptimo de corriente, empuje el nervio fuera del electrodo y administre algunos pulsos de corriente.

Si la cantidad de corriente previamente seleccionada es excesiva, los pulsos de corriente entregados a través del electrodo de succión provocan la contracción muscular al conducir la corriente a través del baño. Utilizando un software casero, ideamos un protocolo de pruebas automatizado para el estudio de la funcionalidad de la unión neuromuscular del sóleo. El protocolo dura unos 65 minutos y se compone de cuatro partes diferentes.

En la primera parte, el músculo se estimula con cuatro pulsos individuales. Dos entregados directamente y dos a través del nervio. A continuación, se mide el tiempo hasta el pico, el tiempo de relajación medio, el valor máximo de la derivada de la fuerza y la fuerza de contracción a partir de las respuestas de contracción.

En la segunda parte, el músculo se estimula con una serie de trenes de pulsos que van desde los 20 hercios hasta los 80 hercios, que es la frecuencia tetánica. Para calcular la fuerza, curvas de frecuencia tanto para estimulaciones nerviosas como directas. En la tercera y cuarta parte del protocolo, el músculo se somete a dos paradigmas de fatiga para medir el fallo de la neurotransmisión y la fatiga intratetánica.

Durante estos paradigmas de fatiga, el músculo se estimula continuamente con un tren de pulsos administrado en la membrana seguido de 14 trenes de pulsos administrados a través del nervio. La secuencia completa se repite 20 veces. El primer paradigma se entrega a una frecuencia de disparo de 35 hercios.

El segundo a la frecuencia tetánica de 80 hercios. Se cree que la falla de la transmisión neurológica juega un papel importante en el desarrollo de la fatiga, ya que está relacionada con el bloqueo externo de la propagación del potencial de acción, la disminución de la liberación del transmisor y la disminución de la excitabilidad de la placa de la capacidad de fatiga de la unión. Otro aspecto de la capacidad de fatiga de la unión neuromuscular se expresa claramente mediante la fatiga intratánica, que es una estimación de la capacidad del músculo para mantener la fuerza durante una sola contracción tetánica y refleja la fatiga de alta frecuencia.

Al final del protocolo, la longitud y el peso netos del músculo se miden utilizando un calibrador analógico y una escala de precisión para calcular el área de la sección transversal del músculo. Los estudios sobre el modelo de ratón transgénico SOD1 de esclerosis lateral amiotrófica han puesto de manifiesto el potencial de esta metodología. De hecho, los músculos sóleos transgénicos producen una respuesta contráctil reducida tanto para la fuerza derivada como para la fuerza tetánica cuando se estimulan directamente y una reducción aún mayor cuando se estimulan a través del nervio.

Por lo que se refiere a la fuerza tetánica, por ejemplo, estos experimentos han demostrado que la contractilidad muscular representa el 25% del daño, mientras que otro 45% está relacionado con defectos en la transmisión neurológica. Otro punto interesante es la ausencia de cualquier diferencia en los músculos de control cuando se estimulan directa o indirectamente. Este hallazgo demuestra que la metodología no induce ningún artefacto técnico, ya que se espera que la unión neuromuscular sea completamente funcional en los animales de control.

En cuanto a la fatiga intratetanica, los resultados han mostrado valores significativamente más bajos en los músculos sóleos transgénicos que en sus homólogos control. Curiosamente, el músculo sóleo transgénico se daña significativamente por la estimulación repetitiva, lo que significa que la funcionalidad de la unión neuromuscular se puede evaluar durante un tiempo máximo de estimulación de ocho minutos. Después de ocho minutos, el músculo transgénico vuelve a un valor de fuerza casi nulo cuando se estimula.

Después de ver el video, debería haber entendido cómo medir la funcionalidad de la unión neuromuscular y el músculo sóleo del ratón. Dado que esta técnica se basa en la medición indirecta de la funcionalidad de la unión neuromuscular, no permite realizar donde los defectos reportados están relacionados con cambios morfológicos o bioquímicos. Por otro lado, este enfoque representa una forma esencial de evaluar si estas agresiones afectan al usuario a la funcionalidad de la señal de transmisión neurológica.

Por último, la propuesta de protocolo puede adoptarse fácilmente para medir la funcionalidad de la unión neuromuscular del diafragma, otro músculo a menudo implicado en enfermedades patológicas.