Evaluación de una unión neuromuscular funcional mediante estimulación óptica simultánea y grabación de vídeo

Comience con un biorreactor con una cámara muscular que contenga tejido muscular incrustado en colágeno apoyado sobre los pilares de la cámara.

El canal de la neuroesfera contiene una neuroesfera en una matriz de colágeno. Las neuronas motoras de la neuroesfera expresan canales sensibles a la luz.

Agregue un medio de diferenciación que contenga factores de crecimiento neuronal que estimulen las neuronas para extender sus proyecciones.

Intercambie regularmente el medio para asegurar la extensión continua de las neuronas hacia el tejido muscular, formando uniones neuromusculares.

Observe el biorreactor bajo un microscopio equipado con una cámara y una fuente de luz azul.

Aplique pulsos de luz azul para abrir los canales sensibles a la luz en las neuronas, permitiendo que los iones del medio fluyan y estimulen las neuronas para generar señales eléctricas.

Estas señales viajan a través de las proyecciones neuronales a las uniones neuromusculares, transmitiendo la señal eléctrica al tejido muscular.

Graba un video simultáneamente. Una contracción gradual de la fibra muscular confirma el desarrollo de una unión neuromuscular funcional.

Prepare una mezcla de 4 a 1 de 3 miligramos por mililitro de colágeno I y matriz de membrana basal solubilizada. Luego, vuelva a suspender los mioblastos en esta mezcla de colágeno recién preparada.

A continuación, agregue 15 microlitros de esta suspensión de colágeno celular a cada cámara muscular del biorreactor, asegurándose de esparcir la suspensión por ambos pilares con la punta de la pipeta. Deje que la mezcla de gel celular se polimerice a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Luego, llene cada pozo del biorreactor con 450 microlitros de medios de crecimiento miotónicos.

En el día 11 de diferenciación de neuronas motoras, transfiera las células y los medios a un tubo de 50 mililitros y deje que las neuroesferas se asienten en el fondo durante 5 minutos. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 15 mililitros de medio de cultivo en suspensión de neuronas motoras suplementado con 20 nanogramos por mililitro de factor neurotrófico derivado del cerebro y 10 nanogramos por mililitro de factor neurotrófico derivado de células gliales.

En el día 14 de los protocolos de diferenciación, siembra las neuronas motoras en la plataforma. Prepare una mezcla de gel de 4 a 1 de 2 miligramos por mililitro de colágeno I y matriz de membrana basal solubilizada. Use un colador celular de 400 nanómetros para seleccionar neuroesferas grandes y vuelva a suspenderlas en la mezcla de gel preparada.

Con cuidado, aspire bien los medios del depósito y la neurosfera. Luego, agregue 15 microlitros de la mezcla de gel en el canal de la neuroesfera. Cargue una pipeta de 10 microlitros con 10 microlitros de gel y elija una neuroesfera. Deposite la neuroesfera en el canal de la neuroesfera, asegurándose de que esté en la cámara. Luego, levante lentamente la pipeta mientras libera el gel restante una vez que se deposita la neuroesfera.

Deje que el gel polimerice durante 30 minutos a 37 grados centígrados. Luego, agregue 450 microlitros de NbActiv4 suplementados con 20 nanogramos por mililitro de factor neurotrófico derivado del cerebro y 10 nanogramos por mililitro de factor neurotrófico derivado de células gliales a los reservorios.

Para obtener imágenes, use un microscopio fluorescente invertido con un software científico de cámara semiconductora de óxido metálico complementario. Establezca el binning en 2 por 2, la exposición en 20 milisegundos, el obturador rodante activado, la velocidad de lectura en 540 megahercios, el rango dinámico en 12 bits y ganancia 1, y el modo de sensor en superposición. Use un objetivo 2x en el microscopio para obtener imágenes de los microtejidos y conecte una cámara de células vivas a la platina del microscopio.

Seleccione la región de interés que contiene los tejidos esqueléticos inervados para minimizar el tamaño del archivo y el tiempo de procesamiento. Luego, coloque un filtro de emisión de paso largo de 594 nanómetros entre la muestra y el objetivo de imagen para filtrar los pulsos de luz azul de la cámara. A continuación, coloque una placa rectangular de cuatro pocillos que contenga cuatro biorreactores en la cámara de células vivas. Luego, haga clic en Live View y centre, y enfoque la imagen con el ROI deseado.

Descargue el macrocódigo personalizado de la carpeta GitHub para controlar la posición del escenario, la placa Arduino y la adquisición de video. A continuación, configure la película de salida como day_tissuegroup_tissuename_experiment. ND2. Ejecute el macrocódigo con las coordenadas x e y deseadas establecidas en el escenario y adquiera un lapso de tiempo rápido con 1.700 fotogramas a 50 fotogramas por segundo.

Después de la obtención de imágenes, reemplace el medio y devuelva las muestras a la incubadora. Deje pasar al menos 24 horas entre las sesiones de adquisición de imágenes para evitar la fatiga del tejido.