Generación de Unidades Motoras Humanas con Uniones Neuromusculares Funcionales en Dispositivos Microfluídicos

Este método relativamente simple puede ayudar a la investigación centrada en las neuronas motoras y las uniones neuromusculares en la salud y la enfermedad. Este protocolo utiliza tecnología estándar de células madre y dispositivos microfluídicos disponibles comercialmente que aumentan la reproducibilidad. La desconexión de las neuronas motoras y las células musculares es un fenómeno temprano en varias enfermedades neuromusculares.

Un modelo humanizado simple podría ayudar a desarrollar estrategias para contrarrestar este fenómeno. Utilizamos este modelo para investigar el trastorno de la neurona motora, la esclerosis lateral amiotrófica, sin embargo, este modelo también se puede utilizar para otros trastornos en los que la unidad motora es esencial. Comience transfiriendo el dispositivo utilizando los fórceps del contenedor de envío a la placa de Petri que contiene 10 mililitros de 70% a 100% de etanol para la esterilización durante 10 segundos.

Transfiera el dispositivo con fórceps a un pedazo de papel para que se seque al aire en el flujo laminar durante unos 30 minutos. Una vez que un dispositivo está seco, use fórceps para mover cada dispositivo a una placa de Petri individual de 10 centímetros. Para recubrir el dispositivo con Poly-L-ornitina u PLO, agregue 100 microlitros de solución PLO al pozo superior y observe el fluido que pasa del pozo superior a través del canal al pozo inferior.

Luego, agregue 100 microlitros de solución PLO al pozo inferior y repita en el otro lado de las micro ranuras. Termine agregando 100 microlitros de solución PLO en un lado para crear un gradiente de volumen entre los dos lados espejados del dispositivo para recubrir las micro ranuras. Incubar durante tres horas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.

Después de tres horas, lave el dispositivo tres veces durante cinco minutos con DPBS. Cubra el dispositivo con 20 microgramos por mililitro de laminina y medio neurobasal siguiendo el procedimiento similar al recubrimiento PLO. Incubar el dispositivo durante la noche a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.

Al día siguiente, use una pipeta de 200 microlitros y coloque la punta en el pozo opuesto a la abertura del canal para eliminar el recubrimiento de laminina de los pozos. Después de agregar DPBS a todos los pozos, deje los dispositivos con DPBS en el flujo laminar a temperatura ambiente para la siembra de celdas. Corte las hojas SCM al tamaño del dispositivo dejando unos milímetros a cada lado.

Después de esterilizar los dispositivos y las láminas SCM en una placa de Petri que contiene 10 mililitros de 70% a 100% de etanol durante 10 segundos, transfiera los dispositivos con fórceps a una placa de seis pocillos y las hojas SCM a una placa de Petri de 10 centímetros para el secado al aire en el flujo laminar. Coloque el dispositivo en el borde para permitir que todos los lados se sequen durante unos 30 minutos. Cubra los dispositivos agregando un mililitro de solución PLO por pocillo a cada dispositivo en la placa de seis pocillos.

Asegúrese de que el dispositivo esté flotando sobre la solución PLO con el canal y el lado de la micro ranura hacia abajo en el líquido. Cubra las hojas de SCM agregando 10 mililitros de solución de PLO a la placa de Petri de 10 centímetros, y use las pinzas para empujar hacia abajo las hojas de SCM hacia el líquido. Incubar dispositivos y hojas SCM durante tres horas como se demostró anteriormente.

Después de tres horas, lave los dispositivos y las hojas de SCM dos veces durante cinco minutos con DPBS seguido de otro lavado durante cinco minutos con agua estéril. Luego transfiera cada hoja SCM a una placa de Petri individual de 10 centímetros para secar al aire. Mientras trabaja bajo un microscopio en el flujo laminar, use fórceps para montar el dispositivo de silicona con el canal y la micro ranura hacia abajo en un ángulo de 90 grados sobre la lámina SCM, asegurando que todos los lados estén alineados.

Presione ligeramente hacia abajo sobre el dispositivo para asegurarse de sellar no solo los bordes exteriores, sino también alrededor de pozos, canales y micro ranuras. Para recubrir el dispositivo con laminina, dentro del flujo laminar y bajo el microscopio, agregue 100 microlitros de 20 microgramos por mililitro de solución de laminina en el pozo superior utilizando una pipeta de 200 microlitros. Observe el fluido que pasa del pozo superior a través del canal al pozo inferior sin ninguna fuga alrededor del pozo y el canal.

Posteriormente, agregue 100 microlitros de solución de laminina al pozo inferior, repita en el otro lado de las micro ranuras y termine con 100 microlitros adicionales de laminina en un lado para crear un gradiente de volumen entre los dos lados espejados del dispositivo para recubrir las micro ranuras, luego incube el dispositivo durante la noche. Al día siguiente, retire el recubrimiento de los pozos con la pipeta de 200 microlitros colocando la punta en el pozo opuesto a la abertura del canal, después de agregar DPBS a todos los pozos, deje los dispositivos con DPBS en el flujo laminar a temperatura ambiente para la siembra de celdas. Para colocar placas de las células progenitoras neurales o NPC en el dispositivo microfluídico, retire DPBS de dos pocillos en un lado de las micro ranuras en el dispositivo utilizando una pipeta de 200 microlitros.

Para sembrar un total de 250, 000 NPC y 60 a 100 microlitros de medio de neurona motora del día 10 por dispositivo, en el pozo superior derecho, sembra la mitad de la suspensión celular cerca de la abertura del canal en un ángulo de 45 grados. Haga una pausa durante unos segundos para permitir que la suspensión celular fluya a través del canal antes de agregar la mitad restante de la suspensión celular en el pozo inferior. Use un bolígrafo para marcar el lado sembrado como NPC o equivalente, para facilitar la orientación del dispositivo sin un microscopio, e incube durante cinco minutos para la unión celular.

A continuación, rellene lentamente los dos pozos sembrados de NPC con un medio adicional de neurona motora de día 10 a un volumen total de 200 microlitros por pozo. Usando una pipeta de 200 microlitros, retire DPBS de los dos pozos al otro lado de los micro surcos opuestos a los NPC recién sembrados. Agregue 200 microlitros de medios de neurona motora del día 10 por pozo a los pozos no sembrados.

Luego agregue seis mililitros de DPBS por plato de 10 centímetros alrededor del dispositivo para evitar la evaporación del medio durante la incubación. Para cambiar el medio, retire lentamente los medios en ambos pozos con NPC colocando la punta de pipeta de 200 microlitros en el borde inferior de la pared del pozo frente a la abertura del canal. Para evitar que un fuerte flujo medio dañe las células en el canal, agregue lentamente de 50 a 100 microlitros de medio de neurona motora fresca a cada pozo cambiando continuamente entre el pozo superior e inferior.

Repita el proceso hasta que cada pozo contenga 200 microlitros de medio. En el día 17 de la diferenciación de la neurona motora, retire el medio de la neurona motora en el lado no sembrado de los micro surcos en el dispositivo con una pipeta de 200 microlitros y lave los pocillos con DPBS. Sembrar un total de 200, 000 mesoangioblastos primarios humanos o MAB, en 60 a 100 microlitros de medio de crecimiento por dispositivo sembrando la mitad de la suspensión celular en el pozo superior.

Haga una pausa durante unos segundos para permitir que la suspensión celular fluya a través del canal antes de sembrar la mitad restante de la suspensión celular en el pozo inferior, como se demostró anteriormente para el recubrimiento de NPC. Incube el dispositivo durante cinco minutos para la fijación de la célula. Luego rellene los dos pozos recién sembrados del MAB con un medio de crecimiento adicional e incube nuevamente como se ha demostrado.

Para iniciar la táctica de quimioterapia y el gradiente volumétrico en el día 21 de la diferenciación de la neurona motora, agregue 200 microlitros por pocillo de medio neurobasal de la neurona motora que contenga factores de crecimiento al compartimiento de Myotube, luego agregue 100 microlitros por pozo de medio basal de la neurona motora sin factores de crecimiento al compartimiento de la neurona motora. Es importante evaluar el potencial de diferenciación de las líneas celulares antes de co-cultivarlas en dispositivos microfluídicos. Se determinó el índice de fusión de los MAB, y se estimó que alrededor del 8% era suficiente para el cocultivo.

Los cultivos de neuronas motoras generados fueron de 85 a 95% positivos para los marcadores de neuronas motoras. Para caracterizar y cuantificar la cantidad de uniones neuromusculares o NMJ, se contó el número de colocalizaciones entre la neurona motora y los marcadores presinápticos de cadena pesada de neurofilamento y sinaptofisina y marcador del receptor de acetileno postsináptico alfa bungarotoxina, se contó a través de cada pila de enfermedad y se normalizó en una serie de miosinas de cadena pesada marcadas con miotubos presentes en la pila Z. Los NMJ aparecieron como NMJ de punto de contacto único donde la neurita tocó un grupo de un receptor de colina sutil en un punto de interacción.

O como NMJ de punto de contacto múltiple donde una neurita se desplegó y se involucró con un grupo sutil de receptores de colina sobre una superficie más grande. La cuantificación del porcentaje de myotubos innovados por neuronas motoras indicó que no todos los miotubos contenían NMJ. Tras la activación de la neurona motora con cloruro de potasio, se observó afluencia de calcio en los Miotubos marcados con Fluo-4, lo que confirmó una conexión funcional a través de la neurita de la neurona motora en el Miotubo, la adición del bloqueador NMJ d-tubocurarina, o DTC al compartimiento de Myotube resultó en una inhibición de la afluencia de calcio.

Para tener el mayor éxito con este modelo es increíblemente importante realizar un control de calidad de la línea celular y evitar la formación de burbujas de aire en los canales del dispositivo. La combinación de la unión neuromuscular en un plato con otros tipos de células directas IPC imita aún mejor la situación in vitro, esto también permite estudiar el papel de estos tipos de células.