Dos algoritmos para de alto rendimiento y multi-paramétrico Cuantificación de Drosophila La unión neuromuscular Morfología

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar automáticamente las características morfológicas de la unión neuromuscular de Drosophila utilizando macros de software morfométrico. Este método puede ayudar a identificar reguladores del desarrollo de la sinapsis, una cuestión clave en neurobiología. La principal ventaja de esta técnica es la cuantificación automática de múltiples características de NMJ.

Esto permite un análisis objetivo de la morfología de NMJ en alto rendimiento. Decidimos desarrollar esta metodología para poder investigar la morfología de la NMJ en una gran cantidad de modelos de enfermedad. Pensamos en formas de prevenir sus diferencias personales y cómo acelerar significativamente el proceso de cuantificación.

La demostración visual de este método es muy útil. La configuración adecuada de macros es crucial y algunos pasos pueden ser difíciles para los nuevos usuarios, especialmente cuando no están familiarizados con el software VT. Para este protocolo, genere pilas de imágenes de NMJ y guárdelas como archivos TIFF individuales, donde el canal uno muestra la tinción DLG1, o un marcador similar, y el canal dos muestra la tinción BRP.

Para empezar, cree proyecciones C e hiperpilas de los archivos de imagen NMJ. Abre las opciones del plugin y selecciona Drosophila NMJ Morphometrics. Ahora, identifique la cadena de archivo única que el microscopio ha asignado a la serie de imágenes al almacenarlas como TIFF.

Estará al final del nombre de la imagen. Copie y pegue la cadena dada en el plano y el número de canal más bajos en la ventana de configuración de cadena de archivo única. A continuación, seleccione la submacro que se convierte en pila y elija el directorio o la carpeta donde se encuentran las imágenes.

Para cada archivo de imagen, se crean dos archivos nuevos con los nombres predeterminados stack y flat stack, seguidos del nombre de la imagen original. A continuación, los archivos originales se pueden eliminar para ahorrar espacio de almacenamiento. A continuación, en la interfaz de Drosophila NMJ Morphometrics, seleccione la submacro definir ROI y elija el directorio de archivos de imagen.

Cuando se abra la primera proyección, seleccione la herramienta de selecciones a mano alzada. A continuación, utilice el ratón para definir una región que contenga un terminal NMJ completo de interés. Una vez seleccionado, haga clic en Aceptar en la ventana de definición de terminal.

Continúe haciendo esto hasta que los terminales NMJ estén definidos en todas las proyecciones. La macro avanza el proceso automáticamente. Para cada archivo de imagen, se crea un nuevo archivo con los nombres predeterminados ROI seguidos del nombre de la imagen original.

Para cuantificar las características de NMJ, primero vaya a la interfaz de Drosophila NMJ Morphometrics y establezca la escala. Por ejemplo, si un píxel de la imagen corresponde a 0,72 micras, establezca la escala de píxeles en uno y la escala de distancia en 0,072. A continuación, seleccione el análisis de la sub macro y, si hay dos imágenes de canal, también cambie el peso.

Presione OK y cuando se le solicite, seleccione el directorio de archivos de imagen. El tiempo de procesamiento puede ser de varios minutos por sinapsis. Después del análisis, los nuevos archivos de imagen para cada sinapsis analizada se almacenan en la carpeta principal y las mediciones cuantitativas son los resultados.

Txt. Inspeccione todas las imágenes y excluya las imágenes con errores de segmentación. Por ejemplo, es posible que partes del terminal sináptico no se incluyan en el contorno amarillo.

Es posible que se incluyan partes del fondo en el terminal sináptico. Una línea de esqueleto azul puede extenderse más allá del terminal sináptico. Es posible que haya demasiadas zonas activas o que algunas zonas activas permanezcan sin detectar.

Si más del 5% de las imágenes tienen errores de segmentación, explore diferentes algoritmos de análisis para mejorar el procesamiento de la imagen. En las próximas secciones de vídeo se describe cómo definir muchos de estos ajustes de análisis de macros. Para ajustar el valor del radio de la bola rodante para la macro, seleccione tres proyecciones NMJ Z que sean representativas del conjunto de datos de la imagen.

Elimine el nombre de la imagen res resultante y el nombre de la imagen de la pila de dos zonas activas, creados previamente por el análisis de submacros. Abra los archivos de nombre de imagen de pila para cada imagen seleccionada y, a continuación, en la barra de herramientas, seleccione dividir canales para crear una imagen del canal uno y una imagen del canal dos y guarde estos archivos. Abra la imagen perteneciente al canal uno, que en este caso corresponde al etiquetado inmunológico DLG one.

Ahora, ejecute el filtro restar fondo, que se encuentra en la pestaña de proceso. Establezca el radio de la bola rodante en un valor que aumente el contraste entre la sinapsis y el fondo. Cree una proyección Z con un tipo de proyección como intensidad máxima y guarde la imagen.

A continuación, ejecute el algoritmo de restar fondo con el nuevo radio de la bola rodante en todas las proyecciones Z y guarde los resultados. Para determinar los mejores umbrales automáticos para la macro, abra las proyecciones C guardadas y ejecute el umbral automático con la opción probar todo. A partir de las imágenes resultantes, encuentre el algoritmo más adecuado para las imágenes y proceda a utilizar esa configuración de umbral al ejecutar la macro para otras imágenes.

La definición de los diferentes umbrales automáticos es fundamental para la correcta segmentación de la imagen por parte de la macro. Por esta razón, para cuantificar correctamente ocho de los parámetros de señalización, es importante estar familiarizado con las 16 opciones de umbral automático que ofrece el software. Presione el botón más para acercar la imagen de resultados del umbral automático.

Los nombres de los algoritmos se encuentran debajo de cada imagen de resultados. En este ejemplo, el mejor algoritmo de umbral automático para establecer el umbral de contorno NMJ es Huang. Para el umbral de esqueleto, la mejor configuración es Li y la mejor configuración para el umbral de zona activa es Huang.

Para definir el valor de tolerancia al ruido máximo fino para la macro, vuelva a las imágenes NMJ representativas originales. Abra el canal BRP. Ve a la pestaña de plugins en el menú emergente y selecciona el máximo de 3D.

Después de un rato, aparecerá una nueva imagen y luego cerrará la imagen original. A continuación, utilice el comando 3D mínimo. A continuación, cierre el máximo de pilas de C2 sinapsis de una imagen y seleccione el mínimo de la imagen recién creada del máximo de pilas de C2 sinapsis uno.

Ahora use el comando find maxima. En la nueva ventana, seleccione la selección de punto de vista previa y establezca la tolerancia de ruido en 50. Los puntos máximos se indican con pequeñas cruces, que solo deben cubrir las zonas activas de la sinapsis.

Si se realizan demasiadas cruces, aumente el valor de tolerancia al ruido. Si algunas de las zonas activas no están anotadas, disminuya el valor de tolerancia al ruido. Utilice el valor de umbral derivado para el campo de tolerancia al ruido Find Maxima de la macro.

Al elegir el valor máximo de tolerancia al ruido, es importante cuantificar correctamente el número de zonas activas. A veces es necesario probar diferentes valores para definir el adecuado. Ahora ajuste todos los valores derivados en los algoritmos de umbral en la interfaz de macros y ejecute el análisis de submacros en las imágenes representativas que se utilizaron originalmente para definir la configuración de macros.

Se creará un nuevo archivo con las zonas activas indicadas por puntos blancos. Abra este archivo arrastrándolo y soltándolo en la barra de herramientas y seleccionando Proyecto Z con un tipo de proyección como algunos sectores. Por lo tanto, se crea un archivo de proyección.

El siguiente paso es ajustar el umbral. En la nueva ventana de umbral, deslice la barra superior para elegir un valor de umbral en el que se lean todos los focos deseados. Estos son los puntos positivos de BRP.

Utilice este valor como umbral inferior de BRP puncta. Ahora, vuelva a ejecutar el análisis en las imágenes NMJ representativas originales utilizando los valores definidos anteriormente, los algoritmos y, a continuación, el nuevo valor de umbral inferior BRP puncta. Las imágenes resultantes deben cumplir con los criterios de análisis crítico.

Ahora use la configuración de definición para ejecutar la macro en todas las imágenes NMJ obtenidas en las mismas condiciones. Se utilizó la macro morfometría NMJ de Drosophila para validar diferentes defectos sinápticos conocidos en tres genotipos mutantes. Se sabe que los mutantes Ankyrin two han fusionado botones y NMJ más pequeños.

Utilizando el macro, se midió el área y el perímetro de panuronil y quirina, se midieron dos NMJ de derribo de RNAI y se encontró que eran significativamente más pequeños que los controles. La GTPasa Rab3 es necesaria para una distribución adecuada de la bruckpila. Cuando se interrumpe, hay menos zonas activas.

Usando el macro panuronil Rab 3, las moscas derribadas tuvieron un promedio de 138 zonas activas por terminal NMJ en comparación con las 290 detectadas en los controles. El alambre alto es un regulador importante del crecimiento de NMJ y, cuando mutan, los NMJ tienen ramificaciones extendidas en sus terminales. Usando el macro panuronil de alambre alto, las líneas de derribo de RNAI mostraron aumentos significativos en varios parámetros derivados del esqueleto en sus NMJ, incluida la longitud total, la longitud de la rama más larga, el número de ramas y el número de puntos de ramificación.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo operar y ajustar la configuración de la macro morfométrica NMJ de Drosophila. Una vez dominado, el análisis de 50 sinapsis se puede realizar en una hora. Esto ahorra aproximadamente 15 minutos de tiempo de cuantificación por sinapsis.

Es importante adquirir imágenes de buena calidad del NMJ. Cuanto mejores sean las imágenes, mejor será el rendimiento de la macro. Esta técnica ayudará a los investigadores en el campo de la neurobiología a cuantificar de manera eficiente los parámetros morfológicos de la Drosophila NMJ.