Name: Dos algoritmos para de alto rendimiento y multi-paramétrico Cuantificación de Drosophila La unión neuromuscular Morfología (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-03T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 29 s
Description: Aprende a cuantificar automáticamente la morfología de la unión neuromuscular de Drosophila mediante macros de software morfométrico. Este método permite un análisis objetivo y de alto rendimiento de nueve características sinápticas.

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Reconocemos el centro de Centro de Recursos de Drosophila Viena y Bloomington Drosophila (NIH P40OD018537) para proporcionar cepas de Drosophila. Agradecemos a Jack Fransen desde el Centro de Imagen microscópica de apoyo de expertos en imágenes. Este estudio fue apoyado por becas VIDI y superior (917-96-346, 912-12-109) de la Organización Holandesa para la Investigación Científica (NWO), por dos becas de doctorado / Universidad de Radboud DCN Medical Center, por el Retraso Mental Red Alemana financiado por el programa NGFN + del Ministerio Federal alemán de Educación e Investigación (BMBF) y por Gencodys de la Unión Europea 7PM gran escala integrados de red (SALUD-241995) a AS. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito.

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Los autores no tienen conflictos de intereses a revelar.

&quot;Drosophila NMJ Morfometría&quot; y &quot;Drosophila NMJ Bouton Morfometría&quot; son herramientas poderosas para los investigadores interesados en la evaluación de la morfología de la sinapsis. evaluación manual de los parámetros NMJ es laborioso; se estima que las macros se ahorrarían un investigador experimentado hasta 15 min / NMJ pasó en la segmentación manual de imagen. Con una o dos docenas de sinapsis evaluados por condición o genotipo, esto resume rápidamente hasta una cantidad considerable de tiempo ahorrado, incluso en estudios a pequeña escala. Al realizar grandes pantallas, la ganancia de la utilización de análisis de alto rendimiento, en comparación con la evaluación manual y la cuantificación, puede ser inmensa. Además de un mayor rendimiento, los macros proporcionan fácilmente análisis objetivo; excluyen a los prejuicios personales que de otra forma requieren experimentos ciegos, así como las diferencias interpersonales que se producen cuando varios investigadores participan en el análisis. Por último, las macros proporcionan una una sensible y precisoÁLISIS de características NMJ, lo que permite la identificación de reguladores sinápticas que causan más sutil que defectos NMJ dramáticos y hasta ahora han permanecido poco apreciado por el ojo del investigador. La información detallada sobre los procedimientos de validación y los algoritmos utilizados en las macros se encuentran en la publicación Nijhof et al. 17. La funcionalidad de los macros se ha validado para medir apropiadamente características morfológicas de Drosophila melanogaster NMJs en músculo 4. Posteriormente, se demostró que las macros también eran adecuados para analizar las sinapsis en otros músculos en este organismo. Es probable que las macros también se pueden usar para medir los parámetros morfológicos de NMJ con estructura similar en otras especies, incluyendo otras especies de Drosophila y otros insectos. Incluso NMJs muy distantes en la evolución, por ejemplo, NMJs de ratones, muestran una conformación estructural bastante similar 29. Las macros no se han probado en los preparativos NMJ de otras especies, pero los usuarios potenciales se les anima a probar las macros para tales fines. Es muy importante que el usuario explora los diferentes umbrales de automóviles y algoritmos para definir / seleccionar los ajustes de macro más adecuados para las imágenes. Con estos ajustes, se logra una precisión de aproximadamente el 95% cuando la evaluación macro se comparó con la evaluación manual. Ajuste de los valores de la macro a adecuadamente segmento 100% de las imágenes puede ser un procedimiento muy laborioso o incluso imposible. Por lo tanto, la exclusión de las imágenes no segmentados correctamente se recomienda si su número es inferior al 5%. Evidentemente, si la calidad de las imágenes es baja, las macros se generan mayores proporciones de segmentaciones imagen insatisfactorios. Las imágenes de baja calidad influirán de manera similar la evaluación manual y por lo tanto no pueden ser ligada a la evolución de las macros. No obstante las macros son bastante robusta ya que fueron diseñados para una imagenS generada en un microscopio de alta contenido (un microscopio de fluorescencia automatizado que permite obtener imágenes de gran número de muestras) 17. Un punto crítico es que el usuario inspecciona visualmente todas las imágenes resultado generado por las macros. Esto permitirá detectar y excluir las imágenes con la segmentación insatisfactorio. En la sección 6 de este protocolo, el usuario es guiado cómo ajustar la configuración de la segmentación de imagen correcta cuando se ejecuta el sub-macro &quot;Analizar&quot;. Para familiarizarse rápidamente con los requisitos de las macros y cómo ajustar los valores de la macro una carpeta llamada &quot;Examples_adjusting valores de la macro&quot; está incluido en el repositorio de https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a macro. Trece subcarpetas, cada uno con ejemplos de imágenes obtenidas en diferentes plataformas de microscopio (microscopios alto contenido / confocal / fluorescencia) y diferentes immunostainings, se proporcionan. Un PDF titulado “guía Ejemplos” se incluye en el mismocarpeta en la que se proporcionan los ajustes requeridos para cada ejemplo, junto con un documento de texto que proporciona los resultados esperados y los resultados de las imágenes. Las macros se han diseñado para procesar las imágenes guardadas como archivos separados .tiff, sin embargo, algunos usuarios podrían haber salvado sus imágenes en un formato diferente. La siguiente página web https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a 21 contiene una carpeta con el nombre &quot;Drosophila NMJ&quot; donde tres archivos de ejemplo (Ejemplo 1 - 3) y la &quot;Guía de ejemplos&quot; de documentos con instrucciones detalladas de cómo importar imágenes en la macro si no se almacenan como archivos separados .tiff también se pueden encontrar en la misma carpeta. En conjunto, las macros &quot;Drosophila NMJ Morfometría&quot; y &quot;Drosophila NMJ Bouton morfometría&quot; cuantificar diez diferentes características NMJ: área NMJ, perímetro NMJ, número de boutons, área Bouton NMJ, longitud NMJ, NMJ más larga que la longitud de la rama, número de IslaNDS, número de ramas, el número de puntos de ramificación y el número de zonas activas. Esto proporciona una gran ventaja sobre las herramientas disponibles hasta ahora que pueden evaluar sólo una o algunas de sus funciones sinápticas 30, 31. Análisis cuantitativo Multiparámetrico lleva un gran potencial para nuevos descubrimientos, por ejemplo, para identificar nuevos reguladores que controlan uno hasta numerosos aspectos de la biología sinapsis. También proporciona la resolución necesaria para determinar los genes que correguladores de exactamente las mismas o superposición de las características NMJ y por lo tanto es probable que operar en vías moleculares comunes. Por último, se abre la posibilidad de investigar cómo los diferentes parámetros sinápticos se correlacionan entre sí en condiciones inalteradas 17 y aseguran que los genes tales correlaciones morfométricos coordinados. En su conjunto, este protocolo se ilustra cómo utilizar las dos macros &quot;Drosophila NMJ Morfometría&quot; y&quot;Drosophila NMJ Bouton Morfometría&quot;, que realizan la cuantificación objetiva y sensible de diez características morfológicas NMJ en una forma de alto rendimiento.

Trastornos cognitivos tales como la discapacidad intelectual, trastorno del espectro autista y la esquizofrenia se caracterizan a menudo por una función anormal sináptica 1, 2, 3. morfología Synapse y función están estrechamente entrelazadas; defectos morfológicos pueden causar un mal funcionamiento sináptica y, a la inversa, la transmisión sináptica aberrante impactarán la maduración sináptica y la morfología 4, 5, 6. Una serie de organismos modelo se han empleado con el fin de entender mejor la biología de la sinapsis y arrojar luz sobre cómo los cambios sinápticos afectan la función cerebral en salud y enfermedad 7, 8, 9. La Drosophila NMJ es una extensamente estudiada y bien establecido modelo in vivo para sy glutamatérgicanapse biología 10, 11. En las últimas décadas, este modelo se ha utilizado para los estudios fisiológicos y centrado genes, así como para las pantallas de genética a gran escala, con el objetivo de detectar diferencias morfológicas entre NMJs. En particular, las pantallas adelante genéticos han identificado muchos reguladores cruciales y mecanismos del desarrollo de sinapsis y la función 12, 13, 14, 15, 16. Sin embargo, la mayoría de estas pantallas se basó en la evaluación visual de la NMJ morfología terminal y en la detección cualitativa de las anormalidades sinápticas o de puntuación semicuantitativa de algunas características morfológicas. Como consecuencia, más sutiles alteraciones morfológicas sinápticas que no son obvias para el ojo humano se pierden fácilmente. Con el fin de poder detectar diferencias cuantitativas forma integral, lasNMJ tiene que ser evaluada con precisión mediante la cuantificación sistemática de los parámetros morfológicos de interés. La medición de características NMJ manual es laborioso, especialmente cuando hay varias características NMJ de interés y / o cuando se realizan pruebas de detección genéticos a gran escala. Para apoyar multiparamétrica, análisis morfológico de alto rendimiento y para lograr la cuantificación objetiva, dos macros &quot;Drosophila NMJ morfometría&quot; y &quot;Drosophila NMJ Bouton morfometría&quot; se desarrollaron 17. Ambas macros se ejecutan en el software de código abierto de análisis de imágenes Fiji 18, y pueden cuantificar ambas imágenes confocal y nonconfocal. Medidas &quot;Drosophila NMJ morfometría&quot; terminales NMJ inmunoteñidas con el disco postsináptica marcador de gran-1 (Dlg-1) o la peroxidasa de rábano picante presináptica (HRP), co-etiquetados con el Bruchpilot marcador de zona activa (BRP). Cuantifica nueve paráme morfológicaTER (descrito más adelante): área NMJ, perimetrales NMJ, número de boutons, longitud NMJ, NMJ más larga longitud de rama, número de islas, número de ramas, número de puntos de ramificación, el número de zonas activas en la terminal sináptica (Figura 1) . Aunque un algoritmo para determinar el número de boutons está presente en esta macro, que no cumplía con los criterios de exactitud 17. Para evaluar adecuadamente el número de boutons, es necesario utilizar la macro &quot;Drosophila NMJ Bouton Morfometría&quot;, que está diseñado específicamente para cuantificar boutons utilizando preparaciones NMJ inmunoteñidas por anti-sinaptotagmina (Syt) o proteína de cadena anti-Cisteína (Csp), y co-immunolabeled con Brp. La macro &quot;Drosophila NMJ Bouton Morfometría&quot; cuantifica los siguientes parámetros: número de boutons, área Bouton NMJ, longitud NMJ, NMJ más larga longitud de la rama, número de islas, número de ramas, el número de puntos de ramificación y el número de zo activones (Figura 2). Las macros consisten en 3 sub-macros: (I) &quot;Convertir a apilar&quot; identifica todos los archivos de imagen disponibles y crea Z-hyperstacks y proyecciones de máxima intensidad de ambos canales. Como salida, esta macro generará dos nuevos archivos por sinapsis llamada &quot;stack_image_name&quot; y &quot;flatstack_image_name&quot;. II) &quot;Definir ROI&quot; se abrirá todas las imágenes de proyección máximos &quot;flatstack_image_name&quot; consecutivamente y presentarlos con la solicitud para definir manualmente la región de interés (ROI) en el que está presente el terminal sináptica específica de interés. Esto se implementó para permitir la exclusión de las sinapsis que conectan a los músculos adyacentes y / u otros tipos de terminales sinápticas (tales como 1s) que pueden estar presentes en las imágenes 11. (III) &quot;Analizar&quot; se aplica totalmente automatizado análisis a todas las regiones de las imágenes dentro de las fronteras de la ROI. Comoresultado de este paso, el usuario obtendrá dos nuevos archivos: &quot;results.txt&quot;, donde se anotarán toda la medición numérica y un &quot;res_image_name.tif&quot;, donde se ilustrarán las segmentaciones imagen subyacente producidos por la macro. Durante el análisis de imagen tres estructuras se derivan de cada terminal sináptica: el contorno NMJ, el esqueleto NMJ, y el número de zonas activas Brp-positivos. El contorno NMJ se utiliza para determinar el área NMJ y su perímetro y una separación de cuencas posterior proporciona el número de boutons. Desde el esqueleto, cinco características NMJ se deducen: la longitud total NMJ, la suma de la longitud de la trayectoria continua más larga que conecta dos puntos finales (la más larga longitud de la rama), el número de compartimentos no conectados por NMJ (referido como &quot;islas&quot; ), el número de ramas, y el número de puntos de ramificación (un punto de ramificación conecta tres o más ramas). El número de zonas activas se determina en el Brp canales contandomanchas BRP-positivas. El esquema anotado NMJ (línea amarilla), el esqueleto NMJ (línea azul), y el número de zonas activas Brp-positivos (indicados por focos blanco) se visualizan en un cuadro los resultados y las medidas de los parámetros se procesan a una (. txt) archivo de salida (Figura 3). Drosophila NMJ Morfometría&quot; y &#39;Drosophila NMJ Bouton Morfometría&#39; se describieron primero y extensamente validados por Nijhof et al. 17. Este manuscrito se centra en la metodología de análisis de la morfología NMJ usando las macros &#39;Drosophila NMJ morfometría&#39; y &#39;Drosophila NMJ Bouton morfometría&#39;. Sin embargo, antes de los análisis macro-asistida, disecciones NMJ y immunostainings deban llevarse a cabo. Estos son pasos cruciales, y la combinación de marcadores utilizados para inmunohistoquímica tiene que ser adecuado para los análisis de macro. Estos pasos se mencionan brevemente en sEcción 1 de este protocolo y dirigir al usuario a referencias que describen en detalle los protocolos para ejecutar estos procedimientos.

<table><tbody><tr><td><fuerte>Inmunotinción</fuerte></td><td></td><td></td><td><fuerte>Dilución</fuerte></td></tr><tr><td>antidiscos de ratón grandes 1</td><td>Estudios del desarrollo Banco de hibridomas</td><td>AFFN-DLG1-4D6</td><td>1/25 (conjungado con el kit de etiquetado Zenon Alexa Fluor 528)</td></tr><tr><td>Peroxidasa anti-rábano picante para conejos</td><td>Jackson IR</td><td>323-005-021</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Anti-Synaptotagmin</td> <td>para conejosRegalo de Hugo Bellen</td><td></td><td>Ene-00</td></tr><tr><td>Proteína de cadena anti-cisteína de ratón</td><td>Estudios del desarrollo Banco de hibridomas</td><td>DCSP-1(ab49)</td><td>1/10 (conjungado con el kit de etiquetado Zenon Alexa Fluor 528)&nbsp;</td></tr><tr><td>Ratón anti-Bruchpilot</td><td>Estudios del desarrollo Banco de hibridomas</td><td>nc82</td><td>Ene-50</td></tr><tr><td>Cabra anti-ratón Alexa Fluor 488</td><td>Life technologies</td><td>A11029</td><td>1/200</td></tr><tr><td>Cabra anti-conejo Alexa Fluor 568</td><td>Life technologies</td><td>A11011</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Zenon Alexa Fluor 568 Ratón IgG1 Kit de etiquetado</td><td>ThermoFisher</td><td>Z25006</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Anti-decoloración Mountant</td><td>ThermoFisher</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Material</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>Equipo</td>Microscopio confocal o microscopio de fluorescencia Generador de <td></td><td></td><td></td></tr> imágenes <tr><td></td><td>Leica SP5</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Computadora</td><td>Mac o PC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Material</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIJI</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dos algoritmos para de alto rendimiento y multi-paramétrico cuantificación de<em&gt; drosophila</em&gt; la unión neuromuscular morfología

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

la morfología sináptica está estrechamente relacionada con la eficacia sináptica, y en muchos casos los defectos morfológicos sinapsis en última instancia conducir a un mal funcionamiento sináptico. La unión Drosophila larval neuromuscular (NMJ), un modelo bien establecido para las sinapsis glutamatérgicas, ha sido ampliamente estudiado por décadas. La identificación de las mutaciones que causan defectos morfológicos NMJ reveló un repertorio de genes que regulan el desarrollo de sinapsis y la función. Muchos de ellos fueron identificados en estudios a gran escala que se centraron en los enfoques cualitativos para detectar anomalías morfológicas de la Drosophila NMJ. Un inconveniente de los análisis cualitativos es que muchos jugadores sutiles que contribuyen a la morfología NMJ probable que pasan desapercibidos. Mientras que se requieren análisis cuantitativos para detectar las diferencias morfológicas más sutiles, tales análisis no son todavía comúnmente realizan porque son laboriosos. Este protocolo describe en detalle dos algoritmos de análisis de imagen &quot;Drosophila </em&gt; NMJ Morfometría&quot; y &#39;Drosophila NMJ Bouton Morfometría&#39;, disponible como macros compatibles con Fiji, para el análisis morfométrico cuantitativo, precisa y objetiva de la Drosophila NMJ. Esta metodología se desarrolló para analizar terminales NMJ immunolabeled con los marcadores utilizados comúnmente Dlg-1 y . Brp Además, su aplicación más amplia a otros marcadores como Hrp, Csp y Syt se presenta en este protocolo Las macros son capaces de evaluar nueve características NMJ morfológicas:. zona NMJ, perimetrales NMJ, número de boutons, longitud NMJ, NMJ rama más larga longitud, el número de islas, número de ramas, el número de puntos de ramificación, el número de zonas activas en el terminal NMJ.

Se crearon dos algoritmos de análisis de imagen, &quot;Drosophila NMJ morfometría&quot; y &quot;Drosophila NMJ Bouton morfometría&quot;, para cuantificar automáticamente nueve características morfológicas de la unión neuromuscular Drosophila (NMJ).

Dos algoritmos para de alto rendimiento y multi-paramétrico Cuantificación de<em&gt; Drosophila</em&gt; La unión neuromuscular Morfología

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The ...

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar automáticamente las características morfológicas de la unión neuromuscular de Drosophila utilizando macros de software morfométrico. Este método puede ayudar a identificar reguladores del desarrollo de la sinapsis, una cuestión clave en neurobiología. La principal ventaja de esta técnica es la cuantificación automática de múltiples características de NMJ.Esto permite un análisis objetivo de la morfología de NMJ en alto rendimiento. Decidimos desarrollar esta metodología para poder investigar la morfología de la NMJ en una gran cantidad de modelos de enfermedad. Pensamos en formas de prevenir sus diferencias personales y cómo acelerar significativamente el proceso de cuantificación.La demostración visual de este método es muy útil. La configuración adecuada de macros es crucial y algunos pasos pueden ser difíciles para los nuevos usuarios, especialmente cuando no están familiarizados con el software VT. Para este protocolo, genere pilas de imágenes de NMJ y guárdelas como archivos TIFF individuales, donde el canal uno muestra la tinción DLG1, o un marcador similar, y el canal dos muestra la tinción BRP.Para empezar, cree proyecciones C e hiperpilas de los archivos de imagen NMJ. Abre las opciones del plugin y selecciona Drosophila NMJ Morphometrics. Ahora, identifique la cadena de archivo única que el microscopio ha asignado a la serie de imágenes al almacenarlas como TIFF.Estará al final del nombre de la imagen. Copie y pegue la cadena dada en el plano y el número de canal más bajos en la ventana de configuración de cadena de archivo única. A continuación, seleccione la submacro que se convierte en pila y elija el directorio o la carpeta donde se encuentran las imágenes.Para cada archivo de imagen, se crean dos archivos nuevos con los nombres predeterminados stack y flat stack, seguidos del nombre de la imagen original. A continuación, los archivos originales se pueden eliminar para ahorrar espacio de almacenamiento. A continuación, en la interfaz de Drosophila NMJ Morphometrics, seleccione la submacro definir ROI y elija el directorio de archivos de imagen.Cuando se abra la primera proyección, seleccione la herramienta de selecciones a mano alzada. A continuación, utilice el ratón para definir una región que contenga un terminal NMJ completo de interés. Una vez seleccionado, haga clic en Aceptar en la ventana de definición de terminal.Continúe haciendo esto hasta que los terminales NMJ estén definidos en todas las proyecciones. La macro avanza el proceso automáticamente. Para cada archivo de imagen, se crea un nuevo archivo con los nombres predeterminados ROI seguidos del nombre de la imagen original.Para cuantificar las características de NMJ, primero vaya a la interfaz de Drosophila NMJ Morphometrics y establezca la escala. Por ejemplo, si un píxel de la imagen corresponde a 0,72 micras, establezca la escala de píxeles en uno y la escala de distancia en 0,072. A continuación, seleccione el análisis de la sub macro y, si hay dos imágenes de canal, también cambie el peso.Presione OK y cuando se le solicite, seleccione el directorio de archivos de imagen. El tiempo de procesamiento puede ser de varios minutos por sinapsis. Después del análisis, los nuevos archivos de imagen para cada sinapsis analizada se almacenan en la carpeta principal y las mediciones cuantitativas son los resultados.Txt. Inspeccione todas las imágenes y excluya las imágenes con errores de segmentación. Por ejemplo, es posible que partes del terminal sináptico no se incluyan en el contorno amarillo.Es posible que se incluyan partes del fondo en el terminal sináptico. Una línea de esqueleto azul puede extenderse más allá del terminal sináptico. Es posible que haya demasiadas zonas activas o que algunas zonas activas permanezcan sin detectar.Si más del 5% de las imágenes tienen errores de segmentación, explore diferentes algoritmos de análisis para mejorar el procesamiento de la imagen. En las próximas secciones de vídeo se describe cómo definir muchos de estos ajustes de análisis de macros. Para ajustar el valor del radio de la bola rodante para la macro, seleccione tres proyecciones NMJ Z que sean representativas del conjunto de datos de la imagen.Elimine el nombre de la imagen res resultante y el nombre de la imagen de la pila de dos zonas activas, creados previamente por el análisis de submacros. Abra los archivos de nombre de imagen de pila para cada imagen seleccionada y, a continuación, en la barra de herramientas, seleccione dividir canales para crear una imagen del canal uno y una imagen del canal dos y guarde estos archivos. Abra la imagen perteneciente al canal uno, que en este caso corresponde al etiquetado inmunológico DLG one.Ahora, ejecute el filtro restar fondo, que se encuentra en la pestaña de proceso. Establezca el radio de la bola rodante en un valor que aumente el contraste entre la sinapsis y el fondo. Cree una proyección Z con un tipo de proyección como intensidad máxima y guarde la imagen.A continuación, ejecute el algoritmo de restar fondo con el nuevo radio de la bola rodante en todas las proyecciones Z y guarde los resultados. Para determinar los mejores umbrales automáticos para la macro, abra las proyecciones C guardadas y ejecute el umbral automático con la opción probar todo. A partir de las imágenes resultantes, encuentre el algoritmo más adecuado para las imágenes y proceda a utilizar esa configuración de umbral al ejecutar la macro para otras imágenes.La definición de los diferentes umbrales automáticos es fundamental para la correcta segmentación de la imagen por parte de la macro. Por esta razón, para cuantificar correctamente ocho de los parámetros de señalización, es importante estar familiarizado con las 16 opciones de umbral automático que ofrece el software. Presione el botón más para acercar la imagen de resultados del umbral automático.Los nombres de los algoritmos se encuentran debajo de cada imagen de resultados. En este ejemplo, el mejor algoritmo de umbral automático para establecer el umbral de contorno NMJ es Huang. Para el umbral de esqueleto, la mejor configuración es Li y la mejor configuración para el umbral de zona activa es Huang.Para definir el valor de tolerancia al ruido máximo fino para la macro, vuelva a las imágenes NMJ representativas originales. Abra el canal BRP. Ve a la pestaña de plugins en el menú emergente y selecciona el máximo de 3D.Después de un rato, aparecerá una nueva imagen y luego cerrará la imagen original. A continuación, utilice el comando 3D mínimo. A continuación, cierre el máximo de pilas de C2 sinapsis de una imagen y seleccione el mínimo de la imagen recién creada del máximo de pilas de C2 sinapsis uno.Ahora use el comando find maxima. En la nueva ventana, seleccione la selección de punto de vista previa y establezca la tolerancia de ruido en 50. Los puntos máximos se indican con pequeñas cruces, que solo deben cubrir las zonas activas de la sinapsis.Si se realizan demasiadas cruces, aumente el valor de tolerancia al ruido. Si algunas de las zonas activas no están anotadas, disminuya el valor de tolerancia al ruido. Utilice el valor de umbral derivado para el campo de tolerancia al ruido Find Maxima de la macro.Al elegir el valor máximo de tolerancia al ruido, es importante cuantificar correctamente el número de zonas activas. A veces es necesario probar diferentes valores para definir el adecuado. Ahora ajuste todos los valores derivados en los algoritmos de umbral en la interfaz de macros y ejecute el análisis de submacros en las imágenes representativas que se utilizaron originalmente para definir la configuración de macros.Se creará un nuevo archivo con las zonas activas indicadas por puntos blancos. Abra este archivo arrastrándolo y soltándolo en la barra de herramientas y seleccionando Proyecto Z con un tipo de proyección como algunos sectores. Por lo tanto, se crea un archivo de proyección.El siguiente paso es ajustar el umbral. En la nueva ventana de umbral, deslice la barra superior para elegir un valor de umbral en el que se lean todos los focos deseados. Estos son los puntos positivos de BRP.Utilice este valor como umbral inferior de BRP puncta. Ahora, vuelva a ejecutar el análisis en las imágenes NMJ representativas originales utilizando los valores definidos anteriormente, los algoritmos y, a continuación, el nuevo valor de umbral inferior BRP puncta. Las imágenes resultantes deben cumplir con los criterios de análisis crítico.Ahora use la configuración de definición para ejecutar la macro en todas las imágenes NMJ obtenidas en las mismas condiciones. Se utilizó la macro morfometría NMJ de Drosophila para validar diferentes defectos sinápticos conocidos en tres genotipos mutantes. Se sabe que los mutantes Ankyrin two han fusionado botones y NMJ más pequeños.Utilizando el macro, se midió el área y el perímetro de panuronil y quirina, se midieron dos NMJ de derribo de RNAI y se encontró que eran significativamente más pequeños que los controles. La GTPasa Rab3 es necesaria para una distribución adecuada de la bruckpila. Cuando se interrumpe, hay menos zonas activas.Usando el macro panuronil Rab 3, las moscas derribadas tuvieron un promedio de 138 zonas activas por terminal NMJ en comparación con las 290 detectadas en los controles. El alambre alto es un regulador importante del crecimiento de NMJ y, cuando mutan, los NMJ tienen ramificaciones extendidas en sus terminales. Usando el macro panuronil de alambre alto, las líneas de derribo de RNAI mostraron aumentos significativos en varios parámetros derivados del esqueleto en sus NMJ, incluida la longitud total, la longitud de la rama más larga, el número de ramas y el número de puntos de ramificación.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo operar y ajustar la configuración de la macro morfométrica NMJ de Drosophila. Una vez dominado, el análisis de 50 sinapsis se puede realizar en una hora. Esto ahorra aproximadamente 15 minutos de tiempo de cuantificación por sinapsis.Es importante adquirir imágenes de buena calidad del NMJ. Cuanto mejores sean las imágenes, mejor será el rendimiento de la macro. Esta técnica ayudará a los investigadores en el campo de la neurobiología a cuantificar de manera eficiente los parámetros morfológicos de la Drosophila NMJ.

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