Name: Óptica pH cuantificación de intracelular en epitelios de túbulos de Malpighi de Drosophila melanogaster con fluorescentes genéticamente codificado pH indicador (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: Aprende a cuantificar el pH intracelular en túbulos de Malpighi de Drosophila melanogaster utilizando el indicador genéticamente codificado pHerry. Este método permite evaluar el transporte de protones basolateral en células epiteliales intactas mediante imagen en vivo.

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Este trabajo fue financiado por los NIH DK092408 y DK100227 a MFR. AJR fue apoyado por DK007013 T32. Los autores desean agradecer al Dr. Julian A.T. Dow el CapaR-GAL4 y c724-GAL4 poblaciones de Drosophila . También agradecemos a Jacob B. Anderson por ayuda mantener cruces mosca experimentales.

Los autores no tienen nada que revelar.

El éxito de cuantificación de pH en Drosophila MTs depende totalmente de la salud de MTs extraídos y la calidad del montaje y la disección (Figura A – C). Así, la manipulación cuidadosa del tejido como descrito es indispensable. Diapositivas recién revestidos en PLL substancialmente ayuda MT de montaje ya que tienden a ser mucho más pegamento que las diapositivas que han sido expuestos previamente a solución. Montaje cuidadoso también ayuda en la id...

El objetivo de este protocolo es describir cuantificación de pH intracelular (pHi) utilizando un genéticamente codificado-indicador de pH (GEpHI) y demostrar cómo este método puede utilizarse para evaluar transporte basolateral H+ un insecto modelo (D. melanogaster) estructura renal, los túbulos de Malpighi (TM). MTs sirven como los órganos excretores de la mosca de la fruta y son funcionalmente similares a la nefrona mamífera en varios aspectos clave1. MTs se arreglan como 2 pares de túbulos (anteriores y posteriores) en el tórax y el abdomen de la mosca. El sola célula epitelial tubo de cada MT está compuesto por metabólicamente activas principales células con distinta apicales (luminal) y basolateral (hemocoel) polaridad así como células radiadas intercaladas. Anteriores MTs se componen de 3 morfológico, funcional, y con distintos segmentos, en particular la inicial dilatada segmento, segmento de transición y secretor principal segmento, que une el uréter2. En la escala celular transporte trans epitelial ion en el lumen se logra por una membrana plasmática apical V-ATPasa3 y un intercambiador+ de álcali-metal/H así como un basolateral Na+-K+-4de la ATPasa, hacia adentro-rectificador K+ canales5, Na+-conducido Cl−/HCO3− intercambiador (NDAE1)6y Na+-K+-2 Cl− cotransporter (NKCC; Ncc69)7, mientras que células radiadas median Cl– y agua transporte8,9. Este sistema fisiológico complejo pero accesible ofrece excelentes oportunidades para la investigación de mecanismos de transporte iónico endógeno cuando se combinan con los diversos conjuntos de herramientas genéticas y de comportamiento de Drosophila.
La justificación de este protocolo fue describir un sistema genéticamente maleable para el estudio de transporte iónico epitelial con potencial para la integración de la célula de a conducta y exportación de herramientas para otros sistemas modelo. Expresión de pHerry10, un GEpHI derivada de una fusión de verde pH-sensible Super eclíptica pHluorin11,12 (SEpH) y rojo mCherry insensible pH13, MTs permite la cuantificación del transporte de H+ en MT las células a través de la alta K+/nigericin calibración técnica14. Medida que muchos transportadores de iones equivalentes de H+ , cuantificación de pH intracelular sirve como una representación funcional de movimiento de iones a través de una variedad de transportadores. El sistema de modelo de Drosophila MT también ofrece potentes herramientas genéticas en tejidos específicos del transgén15 y RNA de interferencia (ARNi)16 expresión, puede combinarse con la proyección de imagen de celular y todo órgano ensayos17 , 18 , 19 de la función del túbulo para crear un sólido conjunto de herramientas con integración vertical de las moléculas al comportamiento. Esto contrasta con muchos otros protocolos para evaluar biología epitelial, como históricamente tales medidas han confiado en el intrincado y difícil electrodos ion-selectivos micro disección, sofisticado20,21, y caro pH-sensible tintes22 con requisitos de carga restrictiva y pobre especificidad celular en tejidos heterogéneos. GEpHIs se han utilizado para medir el pH en una gran variedad de tipos de célula23extensivamente. Trabajo temprano explota la inherente sensibilidad al pH de la proteína fluorescente verde (GFP) para controlar el pH en células epiteliales cultivadas24 pero las dos últimas décadas han visto utilizado en neuronas25, glia26, hongos27 GEpHIs , y28de las células de la planta. La combinación de las posibilidades de orientación celular de construcciones genéticas a través de la expresión de GAL4/UAS sistema15 y la accesibilidad fisiológica de la Drosophila MT hacen de esta una preparación ideal para las investigaciones de pHi regulación y transporte iónico epitelial.
regulación de pH ha sido estudiado durante décadas y es vital para la vida. La preparación de MT ofrece un modelo robusto para enseñar fisiología de la regulación de pH pero también realizar sofisticadas investigaciones de pHi regulación ex vivo e in vivo. Este protocolo describe la cuantificación del movimiento de la H+ a través de la membrana basolateral de las células epiteliales de la Drosophila MT con NH4Cl ácido de pulso carga técnica21, pero como el indicador de pH es genéticamente codificada, estos métodos y su marco teórico se pueden aplicar a cualquier preparación favorable a la transgénesis y las imágenes en vivo.

<table><tbody><tr><td>Solución de poli-L-lisina (PLL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4832</td><td>Tienda a 4 &deg; C, se puede reutilizar.</td></tr><tr><td>Sal sódica de nigericina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7143</td><td>PRECAUCIÓN: Manéjelo con guantes. Almacene como alícuotas de 20 mM de solución madre en DMSO a 4 & C.</td></tr><tr><td>Cubiertas adhesivas de la cámara de perfusión, tamaño del adhesivo 1 mm, diámetro de la cámara y veces; espesor 9 mm y veces; 0,9 mm, diámetro de los puertos 1,5 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GBL622105</td><td>Se pueden sustituir según sea necesario para que coincida con el sistema de perfusión.</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Kit de Elastómero de Silicona</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td>Disponible en múltiples proveedores.</td></tr><tr><td>Helping Hands Soldering Stands</td><td>Harbor Freight Tools</td><td>60501</td><td>Disponible de múltiples proveedores.</td></tr><tr><td>Sistema de perfusión abierto alimentado por gravedad con controlador de válvulas, colector 8 a 1 y reservadores</td><td>Bioscience Tools</td><td>PS-8S</td><td>Se puede utilizar cualquier sistema de perfusión comparable.</td></tr><tr><td>Regulador de flujo</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0221</td><td>Se puede sustituir según sea necesario para que coincida con el sistema de perfusión.</td></tr><tr><td>Tienda de 21720024 Fisher Scientific Medium de Schneider</td><td></td><td></td><td>en 4 &deg; C en alícuotas estériles.</td></tr><tr><td>#5 Pinzas de acero inoxidable</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td>Se pueden sustituir según la comodidad del experimentador.</td></tr><tr><td>35 x 10 mm Placa de Petri de poliestireno</td><td>Corning Life Sciences</td><td>Fisher Scientific 08-757-100A</td><td>La marca y el tamaño exactos no son importantes.</td></tr><tr><td>75 x 25 mm Portaobjetos de microscopio</td><td>Corning Life Sciences</td><td>2949-75X25</td><td>La marca exacta y el tamaño pueden variar siempre que los pocillos de perfusión sean compatibles.</td></tr><tr><td>Vidrio capilar de borosilicato filimentado, diámetro interior 1,5 mm, diámetro exterior 0,86 mm, espesor 0,32 mm</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0796</td><td>No es necesario filimento, el vidrio se puede sustituir para que coincida con los tubos de perfusión y los pozos de perfusión.</td></tr><tr><td>Tubo Tygon, ID 1/16", OD 1/8", espesor 1/32"</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-171-129</td><td>Disponible en múltiples proveedores, se puede sustituir para que coincida con el sistema de perfusión.</td></tr><tr><td>Grasa de silicona al vacío</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z273554</td><td>Disponible en varios proveedores.</td></tr><tr><td>Abrazadera de control de flujo de plástico</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-869</td><td>Disponible en varios proveedores, no se requiere esterilidad</td></tr><tr><td>Varillas de vidrio, 5 mm de diámetro</td><td>delphiglass.com</td><td>9198</td><td>El tamaño exacto es preferencia personal, varios proveedores disponibles</td></tr><tr><td>Pluma hidrofóbica PAP</td><td>Sigma-Aldrich Z377821</td><td></td><td>Disponible en varios proveedores.</td></tr><tr><td>Película de sellado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7668</td><td>Disponible en varios proveedores.</td></tr><tr><td>Tubo Falcon de 15 mL</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td>Disponible en varios proveedores.</td></tr><tr><td>Tubo Falcon de 50 mL</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>Disponible en varios proveedores.</td></tr><tr><td>HEPES; Ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etanosulfónico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>Disponible en varios proveedores.</td></tr><tr><td>MES; Ácido 4-morfolineetanosulfónico monohidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>69892</td><td>Disponible en múltiples proveedores.</td></tr><tr><td>Grifos; Ácido N-[tris(hidroximetil)metil]-3-aminopropanosulfónico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5130</td><td>Disponible en varios proveedores.</td></tr><tr><td>10X/0.45 Objetivo de aire</td><td>Zeiss</td><td>000000-1063-139</td><td>Se pueden sustituir objetivos comparables. Los objetivos 40X se pueden utilizar para la obtención de imágenes de una sola célula.</td></tr><tr><td>Estereoscopio de disección</td><td>Zeiss</td><td>Discovery.V8</td><td>Se puede utilizar cualquier estereoscopio de disección.</td></tr><tr><td>Transgénico UAS-pHerry Drosophila melagnogaster</td><td>Disponible en Romero Lab</td><td></td><td>Primera publicación: Citation 10</td></tr><tr><td>capaR-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster</td><td>Disponible en Romero Lab</td><td></td><td>Primera publicación: Citation 32</td></tr><tr><td>c724-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster</td><td>Disponible en Romero Lab</td><td></td><td>Primera publicación: Citation 2</td></tr><tr><td>Cámara digital monocromática de alta sensibilidad</td><td>Zeiss</td><td>Axiocam 506 mono</td><td>La marca y el modelo exactos pueden variar, se pueden reemplazar con cualquier cámara monocromática de alta sensibilidad adecuada para imágenes celulares en vivo.</td></tr><tr><td>Juego de filtros GFP/FITC, 470/40 nm ex., 515 nm paso largo em., 500 nm dicroico</td><td>Chroma</td><td>CZ909</td><td>Se puede sustituir cualquier juego de filtros GFP/FITC.</td></tr><tr><td>Juego de filtros RFP/TRITC, 546/10 nm ex., 590 nm em. de paso largo, 565 nm</td><td>Chroma</td> dicroico <td>CZ915</td><td>Se puede sustituir cualquier juego de filtros GFP/FITC.</td></tr><tr><td>Microscopio epifluoescente invertido</td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer Z.1</td><td>Se puede utilizar cualquier microscopio comparable con conmutación de filtro motorizado. Los microscopios verticales se pueden utilizar con baños de perfusión abiertos y objetivos de inmersión en agua.</td></tr><tr><td>Software de análisis estadístico</td><td>Microcal</td><td>Origin 6.0</td><td>Cualquier software con funcionalidad comparable puede ser sustituido</td></tr><tr><td>Software de análisis</td><td>de imágenes Institutos Nacionales de Salud</td><td>ImageJ 1.50i</td><td>Cualquier software con funcionalidad comparable puede ser sustituido</td></tr><tr><td>Software de adquisición de imágenes</td><td>Zeiss</td><td>Zen 1.1.2.0</td><td>Cualquier software con funcionalidad comparable puede ser sustituido</td></tr><tr><td>Hoja de afeitar de acero al carbono de un solo filo</td><td>Ciencias de la microscopía electrónica</td><td>71960</td><td>Disponible de múltiples proveedores.</td></tr><tr><td>Carpeta de portaobjetos de microscopía</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-04</td><td>Disponible en varios proveedores.</td></tr><tr><td>Bunsen Burner</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-110-1231</td><td>Disponible en múltiples proveedores.</td></tr><tr><td>Viales de cría de polistrene Drosophila con Flugs</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-109BF</td><td>Se pueden sustituir artículos comparables.</td></tr><tr><td>Cubo de hielo de laboratorio de 2,5 L</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-210-129</td><td>Disponible en varios proveedores.</td></tr><tr><td>NMDG; N-metil-D-glucamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2004</td><td>Disponible en múltiples proveedores.</td></tr><tr><td>Puntas de pipeta barrera de 200 uL</td><td>MidSci</td><td>AV200</td><td>Disponible en varios proveedores.</td></tr><tr><td>200 &#956; L pipeta de volumen variable</td><td>Gilson Incorporated</td><td>PIPETMAN P200</td><td>Disponible en varios proveedores.</td></tr></tbody></table>

Óptica ph cuantificación de intracelular en epitelios de túbulos de malpighi de drosophila melanogaster con fluorescentes genéticamente codificado ph indicador

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Transporte iónico epitelial es fundamental para la homeostasis de iones sistémica así como el mantenimiento de gradientes electroquímicos celulares esenciales. PH intracelular (pH) está influenciado por muchos transportadores de iones y así control de pH es una herramienta útil para evaluar la actividad de transportista. Moderno codificado genéticamente pH-indicadores (GEpHIs) ofrecen cuantificación óptica de pH en las células intactas a escala celular y subcelular. Este protocolo describe la cuantificación en tiempo real del pH celular Reglamento en túbulos de Malpighi (MTs) de Drosophila melanogaster por ex vivo vivo-proyección de imagen de pHerry, un pseudo-radiométrica GEpHI con un pKun adecuadas para el seguimiento de los cambios de pH en el citosol. Mosca adulta extraída MTs se componen de secciones morfológicamente y funcionalmente distintas de epitelios capa unicelular y pueden servir como un modelo accesible y genéticamente manejable para la investigación del transporte epitelial. GEpHIs ofrece varias ventajas sobre los convencionales tintes fluorescentes sensibles a pH y electrodos ion-selectivos. GEpHIs puede etiquetar poblaciones celulares distintas siempre elementos promotor apropiado están disponibles. Este etiquetado es particularmente útil en ex vivo, en vivoy en situ preparados, que son inherentemente heterogéneos. GEpHIs también permiten la cuantificación de pHi en tejidos intactos en el tiempo sin necesidad de externalización de tratamiento o tejido tinte repetidas. El principal inconveniente de GEpHIs actual es la tendencia a agregar en inclusiones citosólicas en respuesta al daño tisular y construir sobre expresión. Estas deficiencias, sus soluciones y las ventajas inherentes de GEpHIs se demuestran en el presente Protocolo mediante la evaluación del transporte de protones (H+) basolateral en células principales y radiadas funcionalmente distintas de mosca extraído MTs. Las técnicas y análisis descritos son fácilmente adaptables a una amplia variedad de vertebrados e invertebrados preparados y la sofisticación del análisis puede ampliarse desde laboratorios a intrincados determinación del flujo de iones a través de transportadores específicos de enseñanza.

Tejidos sanos y correcta identificación de los MTs anteriores son vitales para el éxito de este protocolo. Durante la disección, debe tenerse cuidado que no toque el MTs y a manija única por el uréter como agarre el MTs directamente conducirá a la rotura (Figura 4A– B). Cuando se barren MTs plana sobre la diapositiva, los túbulos se deben tocar lo menos posible y exceso movimiento evitado ya que esto puede dañar la capa epit...

Transporte iónico celular a menudo puede evaluarse mediante el control de pH intracelular (pH). Genéticamente codificada pH-indicadores (GEpHIs) ofrecen cuantificación óptica de pH intracelular en las células intactas. Este protocolo detalla la cuantificación de pH intracelular a través de celular ex vivo vivo-proyección de imagen de los túbulos de Malpighi de la Drosophila melanogaster con pHerry, un pseudo-radiométrica genéticamente codificada en indicador de pH.

Óptica pH cuantificación de intracelular en epitelios de túbulos de Malpighi de Drosophila melanogaster con fluorescentes genéticamente codificado pH indicador

Epithelial ion transport is vital to systemic ion homeostasis as well as maintenance of essential cellular electrochemical gradients. Intracellular pH ...

El objetivo general de este protocolo de imagen es describir la cuantificación del pH intracelular, utilizando un indicador de pH codificado genéticamente, y demostrar cómo este método puede emplearse para evaluar el transporte de protones basolateral en un modelo de estructura renal de insecto, el túbulo de Malpighian. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del transporte celular, como, por ejemplo, cómo contribuyen proteínas transportadoras específicas al movimiento de protones epiteliales en la regulación del pH intracelular. La principal ventaja de esta técnica es que el transporte celular puede evaluarse rápida y fácilmente en múltiples zonas funcionalmente distintas del epitelio intacto.Aunque este método puede proporcionar información sobre la regulación del pH y el epitelio de insectos, también puede aplicarse a otros sistemas, como el túbulo nefrónico de mamíferos y células epiteliales en cultivo. Para comenzar este procedimiento, coloque dos juegos de pinzas de sujeción para soldadura sobre la platina del microscopio de imagen, con una pinza a cada lado. A continuación, inserte las respectivas micropipetas de vidrio dobladas: la línea de entrada y la línea de salida conectada al vacío.Luego, colóquelos en las manos auxiliares y alíneelos con la platina de imagen del microscopio. Extienda grasa al vacío sobre la cinta adhesiva y presione el divisor de pocillos de perfusión adhesivo sobre la cinta para recubrir la base con grasa. Retire el divisor de pocillos de perfusión adhesivo y colóquelo con la cara engrasada hacia abajo, encima de un portaobjetos recubierto con poli-L-lisina.A continuación, retire el divisor del pozo de perfusión para dejar pozos individuales delimitados con grasa hidrófoba. Después, agregue 200 microlitros de PBS IP o solución salina fosfato para insectos a temperatura ambiente en el pozo delimitado con grasa sobre el portaobjetos recubierto con poli-L-lisina. Luego, coloque el portaobjetos bajo el estereoscopio, vierta medio de Schneider frío sobre hielo en la fuente de disección y transfiera una sola mosca hembra anestesiada a este medio.Sujete la mosca por el tórax con un par de pinzas y use la otra para agarrar suavemente el abdomen posterior. Abra el extremo posterior de la mosca con movimientos cortos y deliberados. Una vez que sea visible la válvula anal, sujete el extremo distal y separe el intestino y las antenas de las tráqueas subyacentes, tirando de la válvula anal lejos del cuerpo mediante tirones breves y repetitivos.Luego, separe con pinzas finas los extremos anteriores del uréter, una vez que el segundo par de extremos quede libre del abdomen. Sujete los extremos anteriores libres con la varilla de vidrio, deslizando la varilla por debajo del uréter, de modo que los túbulos caigan hacia ambos lados. A continuación, levante los extremos directamente hacia arriba, fuera de la solución, y luego gire la varilla de vidrio de forma que los extremos y el uréter queden adheridos a la parte inferior de la varilla.Baje el uréter directamente hacia abajo sobre el portaobjetos y luego fije el uréter y selle los extremos distales de los antes mediante una presión adicional del uréter sobre el portaobjetos de vidrio. Utilice el extremo fino de la varilla de vidrio para deslizar suavemente cada túbulo a través de la superficie del portaobjetos. Pase la varilla rozando ligeramente la superficie del portaobjetos para evitar aplastar el túbulo, y deslice la varilla por encima del túbulo, moviéndose desde la parte distal hacia la proximal, con el fin de adherir toda la longitud de cada túbulo a la superficie del portaobjetos recubierto con poli-L-lisina.El éxito de esta técnica depende completamente de la identificación precisa y del manejo cuidadoso de los túbulos malpighianos anteriores. Los túbulos dañados producirán resultados inconsistentes. A continuación, coloque nuevamente el divisor de pozo adhesivo sobre el portaobjetos para formar un pequeño pozo lleno de líquido sobre el túbulo montado.A continuación, coloque la muestra sobre la platina del microscopio. Coloque los capilares de entrada y salida sobre las aberturas de entrada y salida del pozo de perfusión, respectivamente. En este procedimiento, encienda el microscopio, la fuente de luz y el sistema de adquisición de imágenes, y luego abra el software de adquisición.Mire a través de los oculares y ajuste manualmente el enfoque hasta que la luz del ante sea claramente visible bajo la luz transmitida. Luego, haga clic en la pestaña de adquisición y seleccione 2x2 en el menú desplegable de atenuación, en la sección de carga de adquisición. Inserte un filtro de densidad neutra del 5 % en el trayecto de la luz para reducir la iluminación y minimizar el fotoblancamiento.Haga clic en el canal GFP en el menú de canales, luego haga clic en vivo para observar la señal fluorescente mediante la cámara. A continuación, ajuste el control deslizante de tiempo para establecer el tiempo de exposición, de modo que los valores de píxeles más brillantes en el histograma de intensidad sean aproximadamente el 40 % del valor máximo. Luego haga clic en detener, para interrumpir la iluminación.Repita los procedimientos en el canal RFP y confirme la presencia del segmento inicial dilatado del ante anterior y la ausencia de agregados de m-cherry citos&oacute;lico, lo que indica da&ntilde;o tisular o sobreexpresi&oacute;n. Posteriormente, active un protocolo de imagen de lapso de tiempo haciendo clic en la casilla de serie temporal. Ajuste la duraci&oacute;n en el men&uacute; desplegable, en la secci&oacute;n de serie temporal, a 10 minutos y el control deslizante de intervalo a cero, para establecer el tiempo total de captura con la m&aacute;xima adquisici&oacute;n de im&aacute;genes.Luego, active las casillas de GFP y RFP en la sección de canales. Abra la línea de IPBS del sistema de perfusión activando el controlador de válvula adecuado e inicie el protocolo de adquisición haciendo clic en "iniciar experimento". Después de un minuto, cambie a la solución de cloruro de amonio durante 20 segundos, abriendo la válvula correspondiente y cerrando la línea de IPBS.A continuación, regrese al IPBS cerrando la línea de cloruro de amonio y volviendo a abrir la válvula de IPBS. Para realizar una calibración de dos puntos, retire el separador de pocillo separándolo del portaobjetos subyacente y retire las capilares de perfusión con pinzas del pocillo de imagen. A continuación, aplique 200 microlitros de tampón de calibración IPBS a pH 7,4.Luego, retire la solución del pocillo de imagen y sustitúyala por otros 200 microlitros de solución de calibración. Repita este proceso cuatro veces para asegurar un intercambio completo de la solución. A continuación, incube la preparación junto con la solución de calibración durante 30 minutos antes de la adquisición de imágenes.Repita el protocolo de adquisición de imágenes utilizando los mismos parámetros determinados previamente, con la modificación de solo un minuto de captura de imagen. Luego agregue 200 microlitros de tampón IPBS de calibración para pH nueve. Retire la solución del pozo de imagen y reemplácela con otros 200 microlitros de solución de calibración.Posteriormente, incube la preparación en la segunda solución de calibración durante 10 minutos antes de la adquisición de imágenes y repita el protocolo de adquisición. A continuación, revise la pila de imágenes capturadas en el software de análisis de imágenes para confirmar que ningún píxel en ninguno de los canales esté saturado, haciendo clic en MeanROI y verificando que ningún valor reportado en el histograma de intensidad alcance el valor máximo detectable, mientras se desplaza por la pila de imágenes utilizando el control deslizante de fotogramas. Luego, analice la pila de imágenes trazando la intensidad fluorescente y la razón de fluorescencia como una función del tiempo; aquí, observamos la respuesta fluorescente esperada al pulso de cloruro de amonio en los canales sensible a pH e insensible a pH del indicador.La relación entre estas señales revela la transitoriedad del pH intracelular. Para realizar este análisis, primero haga clic en mediaROI y seleccione la herramienta de forma libre. Mantenga presionado el clic izquierdo del ratón para trazar un MT de 50 micrómetros y haga clic derecho para finalizar el dibujo de la ROI.A continuación, repita esto en un área adyacente al MT, para definir la ROI de fondo. Luego, haga clic en intensidad media bajo mediciones y cree una tabla de valores de intensidad haciendo clic en exportar, tabla de datos, crear. Haga clic en el ícono del engranaje de configuración y desactive todos los parámetros, excepto tiempo e intensidad media.Haga clic con el botón derecho en la pestaña de la tabla de datos recién creada, seleccione guardar como y exporte los datos como un archivo csv. Aquí se muestra una imagen de campo amplio, una fluorescencia superelíptica de fluorina en células principales del anteo anterior y células estrelladas del anteo anterior. Tenga en cuenta que las células estrelladas tienen forma de barra en el segmento inicial, son variables en el segmento transicional y presentan proyecciones celulares distintas en el segmento principal.Este gráfico muestra los cambios de pH intracelular calibrados en respuesta a un pulso de 20 segundos de cloruro de amonio 40 milimolar en regiones de interés. Las curvas punteadas indican ajustes exponenciales simples aplicados a la fase de recuperación ácida, tras la retirada del cloruro de amonio. A partir de estos ajustes, se derivan los valores de la constante de decaimiento.Este gráfico muestra la velocidad de extrusión de ácido representada como una función del pH intracelular, y este gráfico muestra el flujo ácido representado como una función del pH intracelular, derivado de los ajustes exponenciales de la figura anterior. Una vez dominada, la extracción de los túbulos de Malpighi se puede realizar en menos de 10 minutos, si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que el éxito depende completamente de la calidad de la disección y de la calibración precisa del indicador de pH.Esta preparación puede combinarse con otros biosensores genéticamente codificados, como indicadores fluorescentes de calcio y de haluros, para estudiar el movimiento de solutos y la señalización intracelular en células epiteliales. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar túbulos de Malpighian sanos de drosophila, obtener imágenes de un indicador de pH genéticamente codificado y cuantificar el movimiento de protones en células epiteliales. No olvide que trabajar con nitroizene puede ser peligroso y dañar las preparaciones; por lo tanto, se deben tomar precauciones durante este procedimiento, para asegurarse de que no contamine ningún equipo que vaya a reutilizarse.

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Biología

Hemocitos Drosophila se dispersan sobre la totalidad del embrión en desarrollo. Este protocolo demuestra cómo montar y la imagen de estas migraciones el uso de embriones con hemocitos marcados con fluorescencia.

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Un ensayo in vivo para cuantificar la fagocitosis bacteriana en moscas Drosophila adultas

Fuente: Wagner, K. et al., Estudio del tráfico de proteínas de membrana en células fotorreceptoras de Drosophila utilizando proteínas marcadas con eGFP. J. Vis. Exp. (2022). Este video muestra la visualización del tráfico de proteínas de membrana en células fotorreceptoras de Drosophila utilizando proteínas TRPL marcadas con eGFP. En él se detalla la preparación de moscas transgénicas para la obtención de imágenes, la captura de imágenes de fluorescencia de células fotorreceptoras y la...

Estudio del tráfico de proteínas de membrana en células fotorreceptoras de Drosophila

Etiquetar el dominio extracelular de una proteína de membrana con un fluoróforo sensible al pH, superecliptic pHluorin (SEP), permite la localización subcelular, la expresión y el tráfico que se determinen. proteínas de imágenes SEP-etiquetado con total de microscopía de fluorescencia de reflexión interna (TIRFM) permite la cuantificación de los niveles de proteína en el ER y la membrana plasmática periférica.

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Método electrofisiológico para grabaciones de abrazadera de voltaje de células enteras<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorreceptores

Proporcionamos un protocolo para pH intracelular de un linaje de células epiteliales en el tejido ovárico de Drosophila en la proyección de imagen. Se describen métodos para generar moscas transgénicas expresando un biosensor pH, mCherry::pHluorin, imagen el biosensor usando proyección de imagen de fluorescencia cuantitativa, generar curvas estándar y convertir valores de intensidad de fluorescencia a valores de pH.

Métodos para el pH intracelular de la proyección de imagen del linaje de la célula de vástago del folículo en vivo tejido ovárico de Drosophila

Este protocolo describe un ensayo de fagocitosis in vivo en adultos de Drosophila melanogaster para cuantificar fagocito reconocimiento y liquidación de las infecciones microbianas.

Evaluar el Cellular la respuesta inmune de la mosca de la fruta, Drosophila melanogasterutilizando un ensayo de fagocitosis en Vivo

En el embrión temprano de Drosophila , muchos orgánulos son móviles. En principio, se pueden obtener imágenes en vivo a través de sondas fluorescentes específicas, pero la cáscara del huevo impide la aplicación directa al embrión. Este protocolo describe cómo introducir tales sondas a través de la microinyección, y luego analizar el movimiento de orgánulos a granel a través de la velocimetría de imagen de partículas.

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Aquí, se describen métodos no invasivos para la localización de proteínas de membrana fotorreceptoras y la evaluación de la degeneración retiniana en el ojo compuesto de Drosophila utilizando fluorescencia eGFP.

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Visualización de proteínas de baja abundancia y modificaciones postraduccionales en embriones vivos de Drosophila mediante inyección de anticuerpos fluorescentes

Aprende a cuantificar el pH intracelular en túbulos de Malpighi de Drosophila melanogaster utilizando el indicador genéticamente codificado pHerry. Este método permite evaluar el transporte de protones basolateral en células epiteliales intactas mediante imagen en vivo.

Óptica pH cuantificación de intracelular en epitelios de túbulos de Malpighi de Drosophila melanogaster con fluorescentes genéticamente codificado pH indicador (Video) | JoVE Journal

Óptica pH cuantificación de intracelular en epitelios de túbulos de Malpighi de Drosophila melanogaster con fluorescentes genéticamente codificado pH indicador

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