Óptica pH cuantificación de intracelular en epitelios de túbulos de Malpighi de Drosophila melanogaster con fluorescentes genéticamente codificado pH indicador

El objetivo general de este protocolo de imagen es describir la cuantificación del pH intracelular, utilizando un indicador de pH codificado genéticamente y demostrar cómo se puede utilizar este método para evaluar el transporte de protones basolateral en un modelo de estructura renal de insecto, el túbulo de Malpighi. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del transporte celular, como por ejemplo, cómo las proteínas transportadoras específicas contribuyen al movimiento del protón epitelial en la regulación del pH intracelular. La principal ventaja de esta técnica es que el transporte celular puede evaluarse rápida y fácilmente a través de múltiples zonas funcionalmente distintas de epitelio intacto.

Aunque este método puede proporcionar información sobre la regulación del pH y el epitelio de los insectos, también se puede aplicar a otros sistemas, como la nefrona de los mamíferos y las células epiteliales en cultivo. Para comenzar este procedimiento, coloque dos juegos de abrazaderas de manos auxiliares para soldar en la platina del microscopio de imágenes, con una abrazadera a cada lado. A continuación, inserte los respectivos capilares de vidrio doblado y la línea de entrada, y la línea de salida conectada al vacío.

A continuación, móntelo en las manos de ayuda y alinéelas con la platina de imagen del microscopio. Extienda la grasa de vacío sobre la cinta del techo y presione el divisor del pozo de profusión adhesiva sobre la cinta para cubrir la parte inferior con grasa. Despegue el divisor del pozo de perfusión adhesiva y colóquelo con la grasa hacia abajo, encima de un portaobjetos recubierto de poli l lisina.

A continuación, retire el divisor de pocillos de perfusión para dejar los pocillos específicos individuales trazados en grasa hidrofóbica. Después de eso, coloque 200 microlitros de solución salina a temperatura ambiente IPBS o tampón de fosfato de insectos en el portaobjetos engrasado y haga círculos bien en el portaobjetos recubierto de poli l lisina. Luego, coloque el portaobjetos debajo del estereoscopio, vierta el medio de Schneider helado en el plato de disección y transfiera una sola mosca hembra anestesiada a él.

Sostenga la mosca por el tórax con un juego de pinzas y use la otra para agarrar suavemente la parte posterior del abdomen. Abre el extremo posterior de la mosca con movimientos cortos y deliberados. Una vez que el protector trasero sea visible, agarre el extremo distal y libere el intestino y los antes de las traqueas subyacentes, alejando el protector trasero del cuerpo a través de tirones breves y repetitivos.

Luego, pellizque los antes anteriores del uréter con pinzas finas, una vez que el segundo conjunto de antes esté libre del abdomen. Recoja los antes anteriores libres con la varilla de vidrio del poste, deslizando la varilla por debajo del uréter, de modo que los túbulos caigan a ambos lados. Después de eso, levante los antes hacia arriba, fuera de la solución, después de eso, gire la varilla de vidrio de modo que los antes y el uréter se adhieran a la parte inferior de la varilla.

Baje el uréter directamente hacia abajo sobre el portaobjetos, luego fije el uréter y selle los extremos distales de los antes presionando aún más el uréter sobre el portaobjetos de vidrio. Use el extremo fino de la varilla de vidrio para barrer suavemente cada túbulo a través de la superficie del portaobjetos. Rasgue la varilla contra el portaobjetos para evitar aplastar el túbulo y deslice la varilla sobre la parte superior del túbulo, moviéndose de distal a proximal, para unir la longitud total de cada túbulo a la superficie del portaobjetos recubierto de poli l lisina.

El éxito de esta técnica depende enteramente de la identificación precisa y el manejo cuidadoso de los túbulos anteriores de Malpighi. Los túbulos dañados producirán resultados inconsistentes. A continuación, vuelva a colocar el divisor de pocillos de profusión adhesivo en el portaobjetos para formar un pequeño fluido que se llene bien sobre el túbulo montado.

Después de eso, coloque la muestra en la platina del microscopio. Coloque los capilares de entrada y salida sobre la abertura de entrada y salida del pozo de profusión, respectivamente. En este procedimiento, encienda el microscopio, la fuente de luz y el sistema de imágenes, luego abra el software de imágenes.

Mire a través de los oculares y ajuste manualmente el enfoque hasta que el lumen de los antes sea claramente visible bajo la luz transmitida. A continuación, haga clic en la pestaña de adquisición y seleccione 2x2 en el menú desplegable de atenuación, en la sección de carga de adquisición. Inserte un filtro de densidad neutra del 5% en la trayectoria de la luz, para reducir la luz de iluminación y minimizar el fotoblanqueo.

Haga clic en el canal GFP en el menú de canales y, a continuación, haga clic en vivo para observar la señal fluorescente a través de la cámara. Después de eso, ajuste el control deslizante de tiempo para establecer el tiempo de exposición, de modo que los valores de píxeles más brillantes en el histograma de intensidad sean aproximadamente el 40% del valor máximo. A continuación, haga clic en detener para detener la iluminación.

Repita los procedimientos en el canal RFP y confirme la presencia del segmento inicial dilatado de la antesala anterior y la ausencia de agregados de cereza m citosólidos, lo que indica daño tisular o sobreexpresión. A continuación, habilite un protocolo de imágenes de lapso de tiempo haciendo clic en la casilla de verificación de series temporales. Ajuste la duración en el menú desplegable, en la sección de series temporales a 10 minutos, y el control deslizante de intervalo a cero, para establecer el tiempo total de captura con la máxima adquisición de imágenes.

A continuación, marque las casillas GFP y RFP en la sección de canales. Abra la línea IPBS del sistema de profusión activando el controlador de válvula apropiado e inicie el protocolo de imágenes haciendo clic, iniciar experimento. Después de un minuto, cambie a la solución posterior de cloruro de amonio durante 20 segundos, abriendo la válvula adecuada y cerrando la línea IPBS.

Luego, regrese a IPBS cerrando la línea de cloruro de amonio y volviendo a abrir la válvula IPBS. Para realizar una calibración de dos puntos, retire el divisor de pocillos separándolo del portaobjetos subyacente y retire los capilares de profusión en pinzas del pocillo de imágenes. A continuación, aplique 200 microlitros de tampón IPBS de calibración a pH 7,4.

A continuación, retire la solución del pocillo de imágenes y sustitúyala por otros 200 microlitros de solución de calibración. Repita este proceso cuatro veces para asegurar un intercambio completo de la solución. A continuación, incube la solución de preparación y calibración durante 30 minutos antes de la obtención de imágenes.

Repita el protocolo de imagen utilizando los mismos parámetros determinados anteriormente, con la modificación de solo un minuto de captura de imagen. A continuación, añada 200 microlitros de tampón IPBS de calibración a pH nueve. Retire la solución del pocillo de imágenes y reemplácela con otros 200 microlitros de solución de calibración.

Posteriormente, incube la preparación en la segunda solución de calibración durante 10 minutos antes de la obtención de imágenes y repita el protocolo de obtención de imágenes. Después de eso, revise la imagen capturada apilada en el software de análisis de imágenes para confirmar que no hay píxeles en ninguno de los canales saturados, haciendo clic en ROI medio y que ningún valor reportado en el histograma de intensidad alcanzó el valor máximo detectable, mientras se desplaza por la pila de imágenes con el control deslizante de fotogramas. A continuación, analice la pila de imágenes trazando la intensidad fluorescente y la relación de fluorescencia es una función del tiempo, aquí, vemos la respuesta fluorescente esperada al pulso de cloruro de amonio en los canales sensibles e insensibles al pH del indicador.

La relación de estas señales revela la transitoriedad del pH intracelular. Para realizar este análisis, primero haga clic en meanROI y seleccione la herramienta de forma libre. Mantenga presionado el clic izquierdo del mouse para trazar un MT de 50 micrómetros y haga clic derecho para terminar de dibujar el ROI.

Luego, repita eso en un área adyacente al MT, para definir el ROI de fondo. A continuación, haga clic en intensidad media en mediciones, cree una tabla de valores de intensidad haciendo clic en exportar, tabla de datos, crear. Haga clic en el icono de la rueda del reloj de configuración y anule la selección de todos los parámetros, excepto el tiempo y la intensidad media.

Haga clic con el botón derecho en la pestaña de la tabla de datos recién creada, seleccione guardar como y exporte los datos como un archivo csv. Aquí se muestra una imagen de campo amplio, una fluorescencia de flúor superelíptica en células principales del ante anterior y células estrelladas del ante anterior. Tenga en cuenta que las células estrelladas tienen forma de barra en el segmento inicial, variables en el segmento de transición y muestran proyecciones celulares distintas en el segmento principal.

Este gráfico muestra los cambios de pH intercelular calibrados en respuesta a un pulso de cloruro de amonio de 20 segundos y 40 milimolares en las regiones de interés. Las curvas discontinuas denotan ajustes exponenciales simples aplicados a la fase de recuperación de ácido, después de la extracción de cloruro de amonio. De la cual se derivan los valores constantes decaiduales.

Este gráfico muestra la tasa de extrusión de ácido trazada en función del pH intracelular y este gráfico muestra el flujo de ácido trazado en función del pH intracelular, derivado de los ajustes exponenciales de la figura anterior. Una vez dominado, la extracción del túbulo de Malpighi se puede realizar en 10 minutos, si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que el éxito depende completamente de la calidad de la disección y la calibración precisa del indicador de pH.

Esta preparación se puede combinar con otros biosensores codificados genéticamente, como indicadores fluorescentes de calcio y haluros, para estudiar el movimiento de solutos y la señalización intracelular en células epiteliales. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar túbulos saludables de Drosophila malpighi, obtener imágenes de un indicador de pH codificado genéticamente y cuantificar el movimiento de protones en las células epiteliales. No olvide que trabajar con nitroizeno puede ser peligroso y dañar los preparativos y, por lo tanto, se deben tomar precauciones al realizar este procedimiento, para asegurarse de que no contamine ningún equipo que se vaya a reutilizar.