Imágenes en directo de Drosophila melanogaster Migraciones hemocitos embrionarias

Hemocitos Drosophila se dispersan sobre la totalidad del embrión en desarrollo. Este protocolo demuestra cómo montar y la imagen de estas migraciones el uso de embriones con hemocitos marcados con fluorescencia.

Este video muestra un procedimiento para montar embriones de Drosophila para obtener imágenes de hemocitos. Sus macrófagos embrionarios. Los embriones son puestos por moscas en placas de agar jugo de manzana en una jaula de puesta durante la noche.

Al día siguiente, se retira la placa agrícola y los embriones se lavan de la placa agrícola a un colador de células después de lavados adicionales para eliminar los desechos. El filtro de células que contiene los embriones se sumerge en lejía para recubrir los embriones. Después de lavar la lejía, los embriones se transfieren a una gota de agua.

A continuación, se aspira la gota de agua y los embriones se cubren con aceite de carbono. Los embriones con citos he visibles en estadios apropiados se transfieren a un Petri por membrana entre dos cubreobjetos adheridos y se alinean cuidadosamente en aceite. A continuación, se coloca un tercer cubreobjetos sobre los embriones y se pega en su lugar con esmalte de uñas.

La motilidad de los hemocitos dentro del embrión ahora se puede obtener en un microscopio a través del cubreobjetos superior. Hola, soy Jennifer Zaed del laboratorio Brian Strm en la división de alquiler de Seúl y de Biofísica Molecular en el Kings College de Londres. Y yo soy Ian Evans, del Laboratorio de Madera del Departamento de Biología y Bioquímica de la Universidad de Bath.

Hoy les mostraremos un procedimiento para montar Josephs bryo en imagen viva, el sitio hemo, los macrófagos embrionarios de este organismo. Utilizamos este procedimiento para estudiar el desarrollo, la dispersión y la respuesta del viento a estas importantes células inmunitarias y la maquinaria del citoesqueleto que utilizan para llevar a cabo estos procesos. Así que comencemos.

Comience este procedimiento obteniendo las líneas OAL de TRO apropiadas que contengan controladores gal four específicos de hemocitos y reporteros fluorescentes codificados genéticamente bajo el control de UAS. Aquí, la serpiente gal cuatro se utiliza para impulsar la expresión de un marcador nuclear rojo fluorescente de UAS Red Stinger. Para una discusión sobre el rango de controladores GAL cuatro recomendados y las construcciones de UAS, consulte el protocolo escrito adjunto que coloca 20 drosophilas de cada sexo en una jaula de puesta.

La jaula de puesta se compone de una placa de jugo de manzana de 55 mililitros instalada en la parte inferior de un tubo de plástico con una gasa que cubre el otro extremo para permitir el flujo de aire. Alternativamente, se puede usar un pico de plástico simple con agujeros. Perforando la base, permita que las moscas se aclimaten a la jaula de puesta durante al menos dos días después de que las moscas se hayan aclimatado, cambie a una nueva rejilla de jugo de manzana precalentada y permita que las moscas pongan durante la noche a 25 grados centígrados.

Para obtener información sobre la recolección de embriones en etapas más discretas, consulte el protocolo escrito adjunto. Una vez que las moscas se hayan incubado durante el tiempo adecuado para la puesta, use una botella de lavado para aplicar aproximadamente tres mililitros de agua en el plato. Luego, con un pincel de punta suave, desaloje los embriones del jugo de manzana, los embriones desalojados se pueden ver fácilmente a simple vista sosteniendo un colador de células sobre un vaso de precipitados.

Vierta el agua del aato de jugo de manzana en el colador de celdas para recoger los embriones. Luego agregue más agua al jugo de manzana. Aate. Repita el proceso de colado hasta que se haya recolectado el número deseado de embriones.

A continuación, utilizando un biberón de lavado, lave los embriones en el colador de células utilizando aproximadamente 10 mililitros de agua. Una vez lavados los embriones, coloque el colador de células en la tapa del jugo de manzana Aerate. Agregue lejía pura lo suficiente como para suspender los embriones en el filtro de células para cubrir los embriones.

Transfiera el filtro de células y la tapa de la placa de Petri a un microscopio de disección para seguir la decoración de los embriones. Bajo iluminación de campo claro, la decoración está completa cuando los apéndices dorsales se han disuelto, lo que debería ocurrir en dos minutos. Una vez terminada la decoración, retira el colador de células que contiene los embriones de la lejía, de nuevo, sosteniendo el colador sobre un vaso de precipitados.

Use una botella de lavado para lavar suave pero completamente la lejía residual. Aplique pañuelos de laboratorio de color azul en la parte inferior del filtro de células para secar el agua restante. Si el color azul cambia a blanco o rosa, hay lejía residual, continúe lavando asegurándose de que se hayan eliminado todos los rastros de lejía antes de continuar con el siguiente paso.

Eliminar el exceso de agua del filtro de células facilita la recolección de embriones con un pincel en el siguiente paso. Una vez que se haya eliminado todo el lejía de los embriones, coloque una gota de agua en la tapa de una placa de Petri con un pincel fino. Recoja todos los embriones recubiertos del colador y vuelva a suspenderlos en la gota.

A continuación, aplique una toallita química en el exterior del filtro de células para secar los embriones. Una vez secos los embriones, añadir una gota de aceite de carbono halo, 700 para cubrir todos los embriones. A continuación, coloque una segunda gotita de aceite junto a la gota que contiene los embriones.

Inspeccione los embriones bajo un microscopio de disección fluorescente. Identificar embriones en estadios apropiados del genotipo deseado para obtener imágenes de la migración lateral de los citos. En la línea media ventral.

Elija la etapa 13 a 14 embriones. En este ejemplo, los citos se identifican por los núcleos fluorescentes y son visibles en la cabeza y a lo largo del cordón nervioso ventral y el vaso dorsal en desarrollo para obtener una imagen de la motilidad de la dispersión, elija embriones en etapa 15. En esta etapa, nos habremos dispersado por todo el embrión.

Sin embargo, tres líneas paralelas de hemos deben ser visibles en el lado ventral del embrión después de la migración lateral desde la línea media. Una vez que se hayan seleccionado los embriones, use un par de pinzas de relojero número cinco curvadas para recoger los embriones seleccionados. Tenga cuidado de no perforar las membranas de los viales.

A continuación, coloque los embriones en la segunda gota de aceite en la parte inferior de una placa Lumax de Petri permanente de 50 milímetros. Coloque dos gotas pequeñas de aceite Halo Caron 700 separadas por aproximadamente un centímetro. Aplique un cubreobjetos a cada gota bajo iluminación de campo claro en un microscopio de disección.

Transfiera cuidadosamente hasta 15 embriones con pinzas curvas. Alinear los embriones con el lado ventral hacia arriba y paralelos al borde de la cubierta. Se desliza una vez que los embriones están alineados con una pequeña gota de aceite y se deja que se extienda para formar una capa homogénea entre los dos cubreobjetos.

Después de que el aceite se haya esparcido, esto puede tardar unos minutos. Comprueba que los embriones siguen siendo ventrales. Con el lado hacia arriba si los embriones han rodado ligeramente.

Vuelva a colocarlos con las pinzas. Por último, utilizando las pinzas número tres. Coloque un tercer cubreobjetos sobre los embriones.

Puenteando los dos cubreobjetos previamente adheridos. Pega este cubreobjetos a la cubierta. Soportes deslizantes con esmalte de uñas.

Los embriones ya están listos para la toma de imágenes. Este embrión SRP gal four UAS Red Stinger se montó con el lado ventral hacia arriba y se adquirieron imágenes de lapso de tiempo en un microscopio de disección fluorescente Leica M 2 0 5. Los citos se visualizan por sus núcleos marcados en rojo.

La película comienza en la etapa 12 o 13 de desarrollo, cuando los citos abandonan la cabeza y migran por la línea media ventral. Después de aproximadamente una hora, los citos comienzan a migrar fuera de la línea media para dispersarse a posiciones laterales a lo largo de la superficie ventral. Para el resto del desarrollo.

Los hemocitos son muy activos y migran por todo el embrión. Tenemos que mostrarte cómo monitorizar el embrión de Joseph para seguir el movimiento o el lado hemo en vivo in vivo. Al realizar este procedimiento, es importante manipular los embriones con cuidado, especialmente en la placa de petro permanente, para evitar dañar ya sea una vez que los embriones están en aceite, son relativamente resistentes a la deshidratación, pero se debe tener cuidado de no blanquear los embriones durante demasiado tiempo al extraer el corion.

Por último, al montar varios embriones, tendrá la mejor oportunidad posible de obtener un embrión en la orientación perfecta para la obtención de imágenes en vivo. Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.