Cuantificar la frecuencia de tumores se propagan las células usando trasplante de células limitación de dilución en el pez cebra singénico

El ensayo de trasplante de células de dilución limitante es el estándar de oro para evaluar el potencial de autorrenovación en modelos animales experimentales. En esta demostración, se inyectan embriones de pez cebra singénicos en una etapa celular con RAG dos MIC y RAG dos GFP para crear peces cebra transgénicos que desarrollarán leucemia linfoblástica aguda de células T marcadas con fluorescencia. A los 60 días de vida, las células leucémicas primarias se aíslan del pez cebra y luego se purifican mediante clasificación celular activada por fluorescencia.

A continuación, las células se trasplantan en la cavidad peritoneal del pez cebra adulto y se controla el crecimiento tumoral de los peces durante un máximo de 90 días. Finalmente, el programa de software estadístico de análisis de dilución de limitación extrema se utiliza para cuantificar la frecuencia de las células que propagan la leucemia dentro del tumor original. El análisis de trasplante de células de dilución limitada permite a los investigadores evaluar con precisión el número de células que se renuevan automáticamente contenidas en la mayor parte de la masa tumoral.

Son estas células que se renuevan a sí mismas las que impulsan la formación del cáncer y, en última instancia, son las responsables de la recaída. La principal ventaja de realizar ensayos de trasplante de dilución limitada en el modelo de pez cebra es que se pueden trasplantar muchos peces para cada experimento, lo que resulta en una mejor precisión a la hora de determinar la frecuencia de las células que se propagan tumoral que se renuevan automáticamente. Este método proporciona información sobre las células que se propagan tumorales en las células T, una leucemia linfoblástica aguda.

También se puede aplicar para comprender otros modelos de cáncer de pez cebra. Jessica Blackburn, una compañera en el laboratorio y Sally Liu, una técnica talentosa, le demostrarán el procedimiento hoy: Para linealizar las construcciones Rag two CM y RAG two G-F-P-D-N-A, digieran 10 microgramos de cada plásmido con enzima de restricción, no uno a 37 grados Celsius durante la noche. Después de la extracción con fenilcloroformo y la precipitación de etanol, suspendemos cada plásmido en 20 microlitros de agua.

Determine las concentraciones de ADN en un agrogel al 1% ejecutando una dilución de uno a uno, de uno a cinco y de uno a 10 de cada plásmido digerido con 20 microlitros, 10 microlitros y cinco microlitros de una escalera de ADN de alto rango. Ahora diluya el ADN hasta una concentración final de 60 nanogramos por microlitro para inyectarlo en el singen CG de una cepa. Los embriones de un pez cebra inyectan 250 nanolitros de 30 nanogramos por microlitro, dos CM y 30 nanogramos por microlitro.

Agrupe dos GFP en embriones de pez cebra en una etapa celular, dirigiendo cuidadosamente el ADN directamente a la célula y no a la yema. Almacene los embriones inyectados a 28.5 grados centígrados y retire los embriones muertos después de 24 horas a los cinco días de vida, transfiera los animales a tanques grandes aproximadamente 28 días después de la inyección. Anestesiado larvas de pez cebra añadiendo 200 microlitros de cuatro nanogramos por mililitro trica S a 25 mililitros de agua del sistema de peces en una placa de Petri.

Examinar las larvas para detectar el desarrollo de TALL marcado con fluorescencia mediante el uso de un microscopio de epifluorescencia para detectar la fluorescencia de GFP. Separe las larvas positivas para el tumor de las negativas para asegurarse de que no se omita ningún pez leucémico en el análisis. Las larvas negativas se pueden examinar en un momento posterior, una vez que los tumores pueden haber crecido. Monitoree los peces leucémicos marcados con fluorescencia al menos una vez a la semana con el microscopio de epifluorescencia para rastrear el crecimiento del tumor.

Cuando las células leucémicas GFP positivas hayan superado a más del 50% del animal, agregue un mililitro de cuatro nanogramos por mililitro. Trica S en una placa de Petri que contiene nueve mililitros de agua del sistema de peces para sacrificar los peces, coloque el pescado en una nueva placa de Petri que contenga un mililitro de suero bovino fetal al 5% en 0.9 XPBS, macere el pescado con una cuchilla de afeitar, pipetee la mezcla para disociar grupos de células grandes. Luego pase las células a través de un colador de malla de 40 micrómetros a un tubo de 50 mililitros.

Pipetear 500 microlitros de las células en un tubo de poliestireno de cuatro mililitros. Agregue un microlitro de un miligramo por mililitro, yoduro de peridio para etiquetar el vórtice de células muertas, luego mantenga las células en hielo. También prepare un pez CG de tipo salvaje para recolectar células sanguíneas normales, que sirven como portador para las células tumorales durante el trasplante a cuatro mililitros de 5% FPS en 0.9 X PB S al tubo de 50 mililitros para un volumen total de cinco mililitros.

Cuente las células sanguíneas normales diluidas a tres veces, 10 a la quinta célula por mililitro en 5%FBS en 0,9 x pbs, luego pipetee 100 microlitros por pocillo de una placa de 96 pocillos utilizando un clasificador de células activadas por fluorescencia, clasifique las células tumorales positivas para GFP y PI negativas en la placa de 96 pocillos que contiene células sanguíneas a las dosis indicadas. Además, clasifique 10.000 células en un pozo sin células sanguíneas normales y vuelva a analizarlas utilizando datos para evaluar la pureza y la viabilidad de la centrífuga de células clasificadas. La placa de 96 pocillos a 2000 GS durante 10 minutos para pellet las células.

Retire 95 microlitros de la nariz y vuelva a suspender las células en los cinco microlitros restantes. Inyecte la suspensión celular en la cavidad peritoneal de un pez cebra singénico adulto de más de 60 días de edad utilizando una microjeringa de calibre 26 y medio. El pez cebra no tiene que ser anestesiado antes del trasplante.

Trasplante 45 peces con 10 células de leucemia, 20 peces con 100 células, siete peces con 1000 células y cinco peces con 10.000 células ALTAS aproximadamente 28 días después del trasplante. Examinó el pez cebra receptor con un microscopio de epifluorescencia utilizando una longitud de onda de excitación 4 85 20 y un filtro de emisión 5 30 25. Para detectar la fluorescencia de GFP.

Registre el número de peces positivos por el número total de peces inyectados. Vuelva a examinar los peces cada 14 días hasta un máximo de 90 y registre el número de peces positivos. Cuando un tumor positivo, los peces se vuelven más abundantes.

Sacrifique al animal por sobredosis de trica US, ingrese los resultados en una tabla y cargue los datos en el software de análisis de dilución de limitación extrema basado en la web para determinar la frecuencia de las células leucémicas que se renuevan automáticamente dentro de los embriones primarios de una cepa de TG CG se inyectaron con RAG, dos cmic y RAG, dos larvas de GFP se examinaron para detectar la TALL. Después de 28 días, de acuerdo con el trabajo anterior, aproximadamente el 5% de los peces inyectados tienen células T GFP positivas dentro de su timo, y el 100% de estos peces desarrollarán leucemia. Aquí, se seleccionaron células TALL marcadas con fluorescencia de animales enfermos de 65 días de edad y se utilizaron en el ensayo de trasplante de células de dilución limitante. Primero, se trazó una forma de andar para seleccionar células individuales.

A continuación, se seleccionaron las células negativas para yoduro de propidio. Y, finalmente, se trazó una forma de andar para seleccionar solo las células leucémicas GFP positivas para la clasificación. En este ejemplo de peces TALL trasplantados en el día 28, se observaron tumores en etapa temprana como un área de células GFP positivas cerca del lugar de la inyección.

Si bien algunos TLS estaban más avanzados, habiéndose expandido para llenar la cavidad peritoneal para estos experimentos, se trasplantaron más de 220 animales, lo que puede lograrse fácilmente por una persona en varias horas. El análisis de datos utilizando el software elda mostró que, en promedio, una de cada 135 células T eran células que se propagaban por la leucemia que se renuevaban a sí mismas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo trasplantar células tumorales para limitar la dilución en la cavidad peritoneal del pez cebra singenético, y cómo usar los datos resultantes para determinar la frecuencia de las células que se propagan tumorales dentro de un tumor determinado.

Otros estudios que utilicen animales modificados genéticamente pueden ayudar a identificar los mecanismos que gobiernan la autorrenovación de estas células que propagan tumores.