Name: Cuantificar la frecuencia de tumores se propagan las células usando trasplante de células limitación de dilución en el pez cebra singénico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Aprende a cuantificar células propagadoras de leucemia mediante trasplante de dilución limitada en pez cebra singénico. Este método permite evaluar la autofrenovación tumoral con alta precisión.

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La financiación ha sido proporcionada por las subvenciones del NIH 5T32CA09216-26 (la ACC), y K01 AR055619-01A1 y 3 K01 AR055619-03S1 (por DML), así como por el stand de la Fundación de limonada de Alex, el Harvard Stem Cell Institute y la American Cancer la sociedad.

1. Microinyección de ADN embriones de pez cebra <ol><li> Linealizar RAG2:: cMYC y RAG2:: GFP 11 construcciones de ADN mediante la digestión de 10μg de cada plásmido con NotI a 37 ° C durante la noche. </li><li> Fenol: extracto de cloroformo y precipitado los plásmidos, y resuspender en 20μL de cada H 2 O. </li><li> Determinar la concentración del ADN mediante la ejecución de una dilución 1:01, 1:05 y 1:10 de cada plásmido digerido en un 1% en gel de agarosa con 20μL, 10μL y 5μL de una escalera de ADN de alto rango. Este tipo de cuantificación es generalmente más exacto que una lectura del espectrómetro. </li><li> Diluir el ADN a una concentración final de KCl 1M en 60ng/μL TE 0,5 X para la inyección en CG1-deformación (o tensión singénico otros) embriones de pez cebra con 30ng/μL RAG2:: cMYC + 30ng/μL RAG2:: GFP. </li><li> Las inyecciones se deben realizar como se ha demostrado 12, 13. En pocas palabras, el pez cebra macho y hembra se establecen en las cámaras de apareamiento de la noche antes de la inyección. En el día de la inyección, el ADN está cargado en la aguja de inyección, la presión se ajusta de modo que una burbuja con un diámetro de 50 micras es expulsado (30pg ADN), que se mide con un micrómetro. Luego, los embriones se inyectan en el estadio de una célula, con el ADN que se inyecta directamente en la célula, y no en la yema. La supervivencia de la inyección CG1 embriones y larvas es generalmente pobre, y sólo el 5% de los peces con éxito incorporar el transgén, por lo que&gt; 600 embriones se debe inyectar para asegurarse de que algunos peces se desarrollan leucemia. </li><li> Almacenar los embriones inyectados a 28,5 ° C, y la toma de embriones muertos después de las 24 horas. Los animales se transfieren a los tanques grandes con 5 días de la vida y criado como se ha descrito anteriormente 14. </li></ol> 2. La detección de T-ALL primaria en larvas de pez cebra <ol><li> Aproximadamente 28 días después de la inyección, anestesia larvas de pez cebra mediante la adición de 200μL de 4NG / m Tricane-S a 25 ml de peces de agua del sistema en una placa de Petri. </li><li> Examinar las larvas para el desarrollo de fluorescencia con etiqueta T-ALL por el uso de un microscopio de epifluorescencia a 20X, con una longitud de onda de excitación y de emisión de 485/20 530/25 filtro para detectar la fluorescencia de GFP (Figura 1). </li><li> Separados larvas tumor positivo de aquellos que son negativos. Larvas negativas pueden ser examinadas en un momento posterior, una vez que los tumores pueden haber crecido más, para asegurarse de que no T-ALL FISH positivo se perdieron. </li><li> Monitor de T-ALL FISH positivo al menos una vez a la semana usando el microscopio de epifluorescencia para seguir el crecimiento del tumor. </li></ol> 3. Aislamiento y purificación de células marcadas con fluorescencia leucemia primaria <ol><li> Cuando GFP-positivas células leucémicas se han superado a&gt; 50% de los animales, el sacrificio de los peces mediante la adición de 1 ml de 4ng/mL Tricane-S en una placa de Petri que contiene 9 ml de agua del sistema de pescado. </li><li> Coloque el pescado en una nueva placa de Petri que contiene 1 ml de 0.9x PBS con suero bovino fetal al 5% de amortiguamiento de las células. Macerar el pescado con una hoja de afeitar, pipeta de la mezcla de disociar grupos de células grandes, a continuación, pasar a las células a través de un colador de malla 40μm en un tubo de 50 ml. No es necesario disociar todos los grupos de tejidos en células individuales. </li><li> 500μL pipeta de las células a un tubo de poliestireno de 4 ml. Añadir 1μL 1mg/ml yoduro de propidio (PI), que marca las células muertas. Vortex, a continuación, mantener las células en hielo. </li><li> Sacrificar una de tipo salvaje CG1 pescado, macerado y la tensión de la misma manera que antes de recoger las células normales, que sirven como soporte para las células del tumor durante transplant.Add 4 ml 5% de SFB en PBS a 0,9 veces el tubo de 50 ml, para un total volumen de 5 ml. </li><li> Contar con las células normales, se diluye hasta 3x10 5 células / ml en FBS al 5% en PBS 0,9 x, entonces 100μL/well pipeta de una placa de 96 pocillos. </li><li> El uso de un clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS), más o menos las buenas prácticas agrarias de células positivas, PI tumor negativo (Figura 2A, B) en la placa de 96 pozos que contienen células de la sangre en las siguientes dosis: 10 células / pocillo en 48 pozos, 100 células / en 24 pozos, 1000 células / pocillo en 12 pozos, y las células 10.000 / 6 y en los pozos. Además, 10.000 células deben ser ordenados en un pozo sin células sanguíneas normales, y volver a analizar el uso FACS para evaluar la pureza y la viabilidad de las células ordenada (Figura 2C). </li></ol> 4. Limitar la dilución en el trasplante de adultos de pez cebra <ol><li> Precipitar las células por centrifugación de la placa de 96 pozos en 2000xg durante 10 minutos. </li><li> Quitar 95μL del sobrenadante y se resuspenden las células en el 5μL restantes. </li><li> Mantenga un adulto (&gt; 60 días) singénico parte ventral del pez cebra, y se inyecta la suspensión de células en la cavidad peritoneal, utilizando un 26G / 2 "micro-jeringa. Pez cebra no tiene que ser anestesiados antes del trasplante. Generalmente, el 45 de pescado se trasplantan con 10 células de leucemia, 20 son trasplantados con 100 celdas, 7 son trasplantados con células de 1000 y los peces 5 se trasplantan con 10.000 T-todas las células. </li></ol> 5. Análisis para determinar la leucemia de células iniciadoras de la frecuencia <ol><li> Aproximadamente 28 días después del trasplante, examinar el pescado trasplantados con un microscopio con una longitud de onda epifluoresence excitación 485/20 y 530/25 de emisión de filtro para detectar la fluorescencia de GFP. Anote el número de peces positivos por el número total de peces inyectados. </li><li> Volver a examinar el pescado cada 14 días hasta 90 días y registrar el número de peces positivos. Cuando un pez de tumores positivos se convierten en moribundo, el sacrificio del animal por Tricane-S sobredosis. </li><li> De entrada los resultados en una tabla, como se muestra en la figura 3D. Cargar los datos en el ELDA basado en la web (Extreme Análisis de dilución limitante) de software estadístico en <a href="http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html">http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html</a> 15, que utiliza la frecuencia de tumores animales positivos y negativos en cada dosis de trasplante para determinar la frecuencia de auto-renovación de las células de leucemia en el principal T-ALL. </li></ol> 6. Los resultados representativos: Microinyección de ADN en embriones de pez singénico a menudo resulta en una baja tasa de supervivencia de los embriones inyectados, con &lt;60% de los embriones sobreviven durante 24 horas. Además, la supervivencia de los peces singénico inyectada es generalmente pobre durante el desarrollo larvario, con frecuencia &lt;20% de sobrevivir durante 28 días. Por eso es importante para inyectar un gran número de embriones con el fin de crear los peces transgénicos que se desarrollará la LLA-T. A modo de ejemplo, CG1 embriones fueron inyectados con cepa RAG2:: cMYC + RAG2:: GFP. Los transgenes co-segregan en el embrión en desarrollo, de manera que cada célula que expresa GFP también se expresa cMYC. Las larvas fueron seleccionados para la primaria de la LLA-T después de 28 días (Figura 1). Trabajos anteriores han demostrado que aproximadamente el 5% de los peces inyectados se han GFP-positivas las células T en su timo (Figura 1), y el 100% de estos peces se desarrollan leucemia, las células T se transforman 11. Mientras que una pequeña parte de pez cebra puede tener una leucemia más avanzada que es muy fácil de detectar a los 28 días más, sólo tendrá un GFP-positivas del timo (Figura 1), por lo que las larvas deben ser examinados de forma individual con una lupa de alta para asegurarse de que todos los positivos los peces son seleccionados. GFP-T positivas las células de LLA superará&gt; 50% de los animales entre los días 45-70. En el ejemplo citado, el pez cebra fueron sacrificados a los 65 días de vida, y las células de leucemia que estaban aisladas y FACS ordenados para limitar el trasplante de dilución. Las células individuales que se yoduro de propidio negativas y positivas-GFP (Figura 2) se clasificaron en una placa de 96 pocillos. Reanálisis se hizo en 10.000 células seleccionadas con el fin de evaluar la viabilidad (lo ideal es&gt; 95%) y la pureza (lo ideal es&gt; 92%, Figura 2). Trasplantado T-ALL generalmente surgen antes de 28 días, pero algunos tumores pueden tener más de 60 días en desarrollarse. En este ejemplo, el día 28, los tumores en fase inicial fueron vistos como un área de buenas prácticas agrarias de células positivas a cerca del sitio de la inyección (Figura 3 B), mientras que algunos ONVOCATORIAS T-eran más avanzado, después de haber expandido para llenar la cavidad peritoneal (Figura 3 C) . Los datos de los ensayos de limitación de la dilución de trasplante de células a partir de tres diferentes principal T-ALL se muestran en la figura 3D. Para estos experimentos, más de 220 animales fueron trasplantados, lo que puede lograrse fácilmente por una persona en pocas horas. El análisis de datos utilizando el software ELDA mostró que, en promedio, 1 de cada 135 T-Todas las células se auto-renovación de la leucemia se propagan las células (Figura 3E). <img src="/files/ftp_upload/2790/2790fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1 larvas de pez cebra inyectados en el estadio de una célula con un trapo.::-CMYC + trapo::-eGFP fueron seleccionados para el crecimiento de la leucemia primaria 28 días después de la inyección. Pescado (*) había GFP-positivas las células T en el timo, este pez se desarrollará la LLA-T como las células T se transforman con el tiempo. Esta etapa es muy común en el día 28. Un pez (**) tenía un avanzado T-ALL que se ha diseminado a los tejidos blandos. Los otros dos peces son negativos para el crecimiento del tumor. La imagen fue tomada con un aumento de 16X. <img src="/files/ftp_upload/2790/2790fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Fluorescente marcada con T-ALL células fueron ordenados de animales enfermos y se utiliza en el ensayo de transplante de células de dilución limitante. En primer lugar, una puerta se elaboró ​​para seleccionar las células individuales (panel superior izquierdo), entonces las células del yoduro de propidio negativas son seleccionados (panel de la izquierda). Finalmente, una puerta se elaboró ​​para seleccionar sólo las buenas prácticas agrarias de células positivas para la clasificación de la leucemia (panel inferior izquierdo). Células seleccionadas deben ser vueltos a analizar para evaluar la viabilidad y la pureza antes del trasplante (paneles de la derecha). <img src="/files/ftp_upload/2790/2790fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Pez cebra fueron examinados para el crecimiento de la leucemia 28 días después del trasplante. Peces están tumor negcreativas (A), tiene un tumor pequeño que crece en el lugar de inyección (B), o una leucemia avanzado (C). Las imágenes fueron tomadas con un aumento de 7X. El número total de leucemia positiva de pescado por el número total de peces trasplantado en cada dilución se registra, como en (D). Los datos se introducen en el programa basado en la web ELDA para calcular el número de auto-renovación de células de la leucemia y la parte superior e inferior de confianza del 95% (E).

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</ol>

Una de las principales de la utilización del pez cebra en la investigación del cáncer es que un gran número de animales se pueden utilizar a un costo relativamente bajo. Esto es especialmente importante en la limitación de los ensayos de dilución de trasplante de células, donde las proporciones de los animales trasplantados que desarrollan tumores en el número total de trasplantados se utilizan para determinar iniciadoras del tumor de células de frecuencia. En el método que aquí se presenta, más de 70 animales receptores de trasplante se utilizan por ensayo, proporcionando una estimación precisa del número de células tumorales se propagan. Tanto el número de animales utilizados y las dosis de las células tumorales trasplantadas deben ser optimizados para un modelo de cáncer dado, por ejemplo, si los experimentos iniciales muestran iniciadoras del tumor las células son poco frecuentes, las dosis pueden ser útiles trasplante de 100.000, 50.000, 10.000 y 1.000 células por trasplante. Singénico cepas de pez cebra son útiles para limitar el análisis de dilución. Sin embargo, estas cepas no son todavía de uso común en todos los laboratorios, y algunos modelos de cáncer de pez cebra existen sólo en el pescado alogénico. Limitar trasplantes de células de dilución se puede realizar en las cepas salvajes que han sufrido la ablación inmune, aunque la frecuencia de auto-renovación de células se puede calcular como 10 a 100 veces mayor que si singénico pez cebra se utilizaron 8. Es importante tener en cuenta que una mayor dosis de células deben ser utilizados para trasplantes en receptores no inmunes encontrados, irradiado, ya que algunas células del tumor no va a sobrevivir el trasplante en un micro exterior. Además, muchos tumores comenzará a regresar después de 21 días, cuando el sistema inmune del animal receptor se recupera, por lo que los animales deben ser evaluados para el crecimiento del tumor cada 7 días después del trasplante. Los métodos presentados aquí son adecuadas para su uso con cualquier modelo de cáncer de pez cebra, y hasta ahora han sido utilizados para determinar iniciadoras del tumor de células, tanto en la frecuencia de células T leucemia linfoblástica aguda, 8, y un modelo de tumor sólido, rabdomiosarcoma 16. Estos tumores fueron etiquetados con fluorescencia mediante la co-inyección de embriones con ambos un oncogen y un marcador fluorescente, ya que el ADN co-segrega, los celulares que expresan el oncogén también expresan la proteína fluorescente 17. Mientras que la fluorescencia es recomendable porque facilita el seguimiento del crecimiento del tumor sin necesidad de sacrificar al animal y provee una forma recta hacia adelante para aislar las células tumorales mediante FACS, es posible marcar a las células tumorales con anticuerpos específicos de tumores fabricantes para facilitar su purificación , aunque la tinción de anticuerpos en el pez cebra puede requerir de optimización. Finalmente, una vez que la incidencia del tumor de células de propagación se ha determinado para un tipo de tumor determinado, es posible utilizar estas pruebas para identificar los mecanismos que gobiernan la frecuencia de la célula. Por ejemplo, células tumorales primarias pueden ser tratados con inhibidores de la vía específica antes de limitar la dilución del trasplante, trasplantados o los peces se pueden dosificar con las drogas. Además, la genética de los tumores se pueden manipular mediante la inyección de los peces de una etapa de células con un gen de interés, de modo que los tumores primarios resultantes se sobre-expresan el gen. En estos experimentos, ningún efecto sobre la frecuencia de auto-renovación de células se observaron en los ensayos de dilución límite.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> Noti enzima de restricción </td><td> New England Biolabs </td><td> R0189 </td></tr><tr><td> Fenol: cloroformo </td><td> EMD Bioquímicos </td><td> 6805-OP </td></tr><tr><td> KCl 5M </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9541 </td></tr><tr><td> 100X Tris-EDTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T9285 </td></tr><tr><td> Gama alta escalera del ADN </td><td> Fermentas </td><td> R0621 </td></tr><tr><td> Singénico pez cebra </td><td></td><td> Referencias 8.6 </td></tr><tr><td> De suero fetal bovino </td><td> Gibco </td><td> 16000-036 </td></tr><tr><td> Yoduro de propidio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4864 </td></tr><tr><td> 26G / 2 &quot;Microjeringa </td><td> Hamilton </td><td> 80366 </td></tr><tr><td> Malla de 40μm de células colador </td><td> BD Falcon </td><td> 352340 </td></tr></tbody></table>

cuantificar la frecuencia de tumores se propagan las células usando trasplante de células limitación de dilución en el pez cebra singénico

Quantifying the Frequency of Tumor-propagating Cells Using Limiting Dilution Cell Transplantation in Syngeneic Zebrafish

Autorrenovables las células cancerosas son los tipos de células sólo dentro de un tumor que tiene una capacidad ilimitada para promover el crecimiento del tumor, y por lo tanto conocido como tumor de propagación células o células iniciadoras del tumor. Se cree que la orientación de estas células de auto-renovación de destrucción bloquear la progresión del tumor y detener la recaída, lo que mejora el pronóstico del paciente 1. La manera más común para determinar la frecuencia de auto-renovación de células de un tumor es una célula de ensayo de transplante de dilución límite, en el que las células tumorales son trasplantadas a animales receptores en dosis cada vez mayores, la proporción de animales que se desarrollan los tumores se utiliza el cálculo del número de auto-renovación de células en la muestra original del tumor 2, 3. Lo ideal sería que una gran cantidad de animales podrían ser utilizados en cada experimento de dilución limitante para determinar con exactitud la frecuencia de los tumores se propagan las células. Sin embargo, experimentos a gran escala con ratones son costosos, y la mayoría de limitar los ensayos de dilución de uso sólo 10-15 ratones por experimento. Pez cebra se han destacado como un modelo de cáncer, en gran parte debido a su facilidad de manipulación genética y la economía por el que los experimentos a gran escala puede llevar a cabo. Además, los tipos de cáncer modelo de pez cebra se han encontrado para imitar a sus cuatro contraparte enfermedades humanas. A pesar de que es posible trasplantar células tumorales de un pez a otro sub-letales de la irradiación de los animales receptores, la regeneración del sistema inmunológico después de 21 días a menudo causa la regresión del tumor 5. La reciente creación de pez cebra singénico ha facilitado en gran medida los estudios tumor trasplante 6-8. Debido a que estos animales son genéticamente idénticos, se implantan las células del tumor trasplantado con firmeza en los peces receptores, y el crecimiento del tumor se puede controlar durante largos períodos de tiempo. Singénico pez cebra es ideal para limitar los ensayos de dilución en el trasplante de células tumorales que no tienen que adaptarse al crecimiento en un microambiente extranjeros, lo que puede subestimar la auto-renovación de la frecuencia de 9 celdas, 10. Además, una trasplantes de células se han completado con éxito el uso de pez cebra singénico 8 y varios cientos de animales puede ser fácil y económicamente trasplantados al mismo tiempo, los cuales sirven para proporcionar una estimación más precisa de la auto-renovación de la frecuencia de la célula. Aquí, se presenta un método para la creación de primaria, con fluorescencia marcado de células T leucemia linfoblástica aguda (LLA-T) en el pez cebra singénico, y el trasplante de estos tumores en la limitación de dilución en los peces adultos para determinar la frecuencia de auto-renovación celular. Mientras que la leucemia se presenta como un ejemplo, este protocolo es adecuado para determinar la frecuencia de los tumores se propagan las células utilizando cualquier modelo de cáncer en el pez cebra.

Limitación de la dilución ensayos de trasplante de células se utilizan para determinar la frecuencia de los tumores se propagan las células. Este protocolo describe un método para generar pez cebra singénico que desarrollan leucemia fluorescente marcado y los detalles de cómo aislar y trasplante de estas células de leucemia en la limitación de dilución en la cavidad peritoneal de los adultos de pez cebra.

Cuantificar la frecuencia de tumores se propagan las células usando trasplante de células limitación de dilución en el pez cebra singénico

Las células cancerosas con capacidad de autorrenovación son los únicos tipos celulares dentro de un tumor que poseen una capacidad ilimitada para promover el crecimiento tumoral y, por lo tanto, se conocen como...

El ensayo de trasplante de células por dilución límite es el estándar de oro para evaluar el potencial de autorrenovación en modelos animales experimentales. En esta demostración, embriones de pez cebra singénicos en estadio de una sola célula son inyectados con rag dos MIC y RAG dos GFP para generar peces cebra transgénicos que desarrollarán leucemia linfoblástica aguda T marcada con fluorescencia. A los 60 días de vida, las células leucémicas primarias se aíslan del pez cebra y luego se purifican mediante clasificación fluorescente de células activada. A continuación, las células se trasplantan por dilución límite en la cavidad peritoneal de peces cebra adultos, y se monitorea el crecimiento tumoral en los peces durante un período de hasta 90 días. Finalmente, se utiliza el programa estadístico de análisis de dilución límite extrema para cuantificar la frecuencia de células que propagan la leucemia dentro del tumor original. El análisis de trasplante de células por dilución límite permite a los investigadores evaluar con precisión el número de células con capacidad de autorrenovación presentes en la masa tumoral total.Son estas células autorrenovables las que impulsan la formación del cáncer y son finalmente responsables de la recaída. La principal ventaja de realizar ensayos de trasplante por dilución límite en el modelo de pez cebra es que se pueden trasplantar muchos peces por cada experimento, lo que resulta en una mayor precisión al determinar la frecuencia de células tumorales propagadoras con capacidad de autorrenovación. Este método proporciona información sobre las células tumorales propagadoras en la leucemia linfoblástica aguda de células T.También puede aplicarse para comprender otros modelos de cáncer en pez cebra. Jessica Blackburn, investigadora en el laboratorio, y Sally Liu, una técnica talentosa, demostrarán el procedimiento para ustedes hoy. Para linealizar los constructos Rag2 CM y RAG2 GFP DNA, digiera 10 microgramos de cada plásmido con la enzima de restricción NotI a 37 grados Celsius durante la noche. Después de la extracción con fenol-cloroformo y la precipitación con etanol, suspendemos cada plásmido en 20 microlitros de agua.Determine las concentraciones de ADN en un gel de agarosa al 1 % realizando una dilución uno a uno, uno a cinco y uno a 10 de cada plásmido digerido con 20 microlitros, 10 microlitros y cinco microlitros de una escalera de ADN de rango alto. Ahora diluya el ADN hasta una concentración final de 60 nanogramos por microlitro para inyección en la cepa CG uno de syngen. Inyecte 250 nanolitros de 30 nanogramos por microlitro de rag dos CM y 30 nanogramos por microlitro en embriones de pez cebra.Inyecte dos copias de GFP en embriones de pez cebra de una sola célula, dirigiendo cuidadosamente el ADN directamente hacia la célula y no hacia la yema. Almacene los embriones inyectados a 28,5 grados Celsius y retire los embriones muertos después de 24 horas; a los cinco días de vida, transfiera los animales a tanques grandes aproximadamente 28 días después de la inyección. Anestesie larvas de pez cebra añadiendo 200 microlitros de tricaína a cuatro nanogramos por mililitro a 25 mililitros de agua del sistema para peces en una placa de Petri.Examine las larvas en busca del desarrollo de TALL marcado con fluorescencia utilizando un microscopio de epifluorescencia para detectar la fluorescencia de GFP. Separe las larvas positivas para el tumor de las negativas para asegurar que ningún pez leucémico se pase por alto en el análisis. Las larvas negativas pueden examinarse en un momento posterior una vez que los tumores puedan haber crecido más. Monitoree los peces leucémicos marcados con fluorescencia al menos una vez por semana utilizando el microscopio de epifluorescencia para seguir el crecimiento del tumor.Cuando las células leucémicas positivas para GFP hayan invadido más del 50 % del animal, añada un mililitro de cuatro nanogramos por mililitro de Trica S en una placa de Petri que contenga nueve mililitros de agua de sistema para peces para sacrificar al pez; coloque el pez en una nueva placa de Petri que contenga un mililitro de suero bovino fetal al 5 % en PBS 0,9 X. Macece el pez con una hoja de bisturí y pipetee la mezcla para disociar los grandes agregados celulares. A continuación, pase las células a través de un filtro de malla de 40 micrómetros hacia un tubo de 50 mililitros.Pipetee 500 microlitros de las células en un tubo de poliestireno de cuatro mililitros. Añada un microlitro de yoduro de peridinio al miligramo por mililitro para marcar las células muertas, vortexee y luego mantenga las células en hielo. Prepare también un pez tipo salvaje CG uno para recolectar células sanguíneas normales, que sirven como vehículo para las células tumorales durante el trasplante, agregue cuatro mililitros de FPS al 5% en PBS 0,9 X al tubo de 50 mililitros para un volumen total de cinco mililitros.Cuente las células sanguíneas normales diluidas hasta tres veces 10 a la quinta células por mililitro en FBS al 5 % en PBS 0,9 x, luego pipetee 100 microlitros por pocillo en una placa de 96 pocillos utilizando un citómetro de flujo para clasificar las células tumorales GFP positivas y PI negativas dentro de la placa de 96 pocillos que contiene células sanguíneas en las dosis indicadas. Adicionalmente, clasifique 10.000 células en un pocillo sin células sanguíneas normales y vuelva a analizar mediante citometría para evaluar la pureza y viabilidad de las células clasificadas. Centrifugue la placa de 96 pocillos a 2000 ×g durante 10 minutos para formar el sedimento celular.Retire 95 microlitros del sobrenadante y resuspenda las células en los cinco microlitros restantes. Inyecte la suspensión celular en la cavidad peritoneal de peces cebra adultos sinnégenos de más de 60 días de edad utilizando una microjeringa de calibre 26 y medio. No es necesario anestesiar a los peces cebra antes del trasplante.Trasplante 45 peces con 10 células leucémicas, 20 peces con 100 células, siete peces con 1000 células y cinco peces con 10,000 células TALL aproximadamente 28 días después del trasplante. Examine los peces receptores con un microscopio de fluorescencia episcópica utilizando una longitud de onda de excitación de 485/20 y un filtro de emisión de 530/25 para detectar la fluorescencia de GFP.Registre el número de peces positivos por cada número total de peces inyectados. Vuelva a examinar los peces cada 14 días durante un período de hasta 90 días y registre el número de peces positivos. Cuando un pez con tumor positivo se vuelva más abundante.Sacrifique al animal mediante sobredosis de trica US, introduzca los resultados en una tabla y cargue los datos en el software web de análisis de dilución límite extrema para determinar la frecuencia de células leucémicas con autorrenovación dentro de los embriones primarios de TALL CG. Un linaje fue inyectado con RAG dos cmic y las larvas RAG dos GFP fueron seleccionadas para TALL primario. Después de 28 días, de acuerdo con trabajos previos, aproximadamente el 5 % de los peces inyectados presentan linfocitos T GFP positivos dentro de su timo, y el 100 % de estos peces desarrollarán leucemia. Aquí, células TALL marcadas con fluorescencia fueron clasificadas a partir de animales enfermos de 65 días de edad y utilizadas en el ensayo de trasplante celular por dilución límite. Primero, se trazó una compuerta para seleccionar células individuales.Luego se seleccionaron las células negativas para yoduro de propidio. Y finalmente se trazó un portal para seleccionar únicamente las células leucémicas positivas para GFP destinadas a la clasificación. En este ejemplo de peces trasplantados con LLA en el día 28, se observaron tumores en estadio temprano como una zona de células positivas para GFP cerca del sitio de inyección.Aunque algunos TLS estaban más avanzados, ya expandidos para llenar la cavidad peritoneal en estos experimentos, se trasplantaron más de 220 animales, lo cual puede realizarse fácilmente por una persona en varias horas. El análisis de datos mediante el software elda mostró que, en promedio, una de cada 135 células T era una célula propagadora de leucemia con capacidad de autorrenovación. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo trasplantar células tumorales en dilución limitante a la cavidad peritoneal de peces cebra singénicos, y de cómo utilizar los datos resultantes para determinar la frecuencia de células propagadoras de tumores dentro de un tumor determinado.Estudios posteriores que utilicen animales modificados genéticamente podrían ayudar a identificar los mecanismos que regulan la autorrenovación de estas células propagadoras de tumores.

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Biología

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Cuantificar la frecuencia de tumores se propagan las células usando trasplante de células limitación de dilución en el pez cebra singénico (Video) | JoVE Journal

Cuantificar la frecuencia de tumores se propagan las células usando trasplante de células limitación de dilución en el pez cebra singénico

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