Name: Un Sistema de Cultivo Hidropónico para el Análisis Simultáneo y Sistemático de Interacciones Moleculares de Plantas / Microbios y Señalización (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: Aprende un sistema de cultivo hidropónico para analizar interacciones planta-microbio y señalización molecular usando Arabidopsis thaliana y Agrobacterium tumefaciens. Este método permite estudiar respuestas recíprocas en un entorno que simula condiciones naturales.

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Nos gustaría agradecer a Brian Weselowski y Alexander W. Eastman por su ayuda y útil discusión. También queremos dar las gracias a los Dres. Eugene W. Nester, Lingrui Zhang, Haitao Shen, Yuhai Cui y Greg Thorn por su ayuda, útiles discusiones y lectura crítica del manuscrito. Esta investigación fue financiada por Agricultura y Agroalimentación de Canadá, Growing Forward-AgriFlex (número RBPI 2555) y el proyecto de Cultivo de Frente II número 1670, realizado por los autores como parte de sus funciones. Este estudio también fue parcialmente financiado por el Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (CRSNG) Discovery Grant RGPIN-2015-06052 otorgado a ZC Yuan.

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Los autores no tienen nada que revelar.

Dada la naturaleza gradual de la secreción de las raíces, la concentración de los productos químicos inducidos por la virulencia producidos in planta y sus efectos sobre las interacciones dinámicas planta-microbio ocurren en gradientes espaciales y temporales. En este sistema de co-cultivo hidropónico, no se añade fitohormona sintética o sustancia química que induce la virulencia microbiana o las defensas de las plantas. Por el contrario, utilizando métodos convencionales, la adición de productos químicos sinté...

Los microbios asociados a las plantas desempeñan un papel importante en el ciclo biogeoquímico, la biorremediación, la mitigación del cambio climático, el crecimiento y la salud de las plantas y la tolerancia de las plantas a las tensiones bióticas y abióticas. Los microorganismos interactúan con las plantas tanto directamente a través del contacto de la pared celular de la planta como indirectamente a través de la secreción y señalización química 1 , 2 , 3 . Como organismos sésiles, las plantas han desarrollado mecanismos directos e indirectos para resistir la infección por patógenos. Las defensas directas incluyen defensas estructurales y la expresión de proteínas de defensa, mientras que las defensas indirectas incluyen la producción secundaria de metabolitos de plantas y la atracción de organismos antagónicos a patógenos invasores 4 , 5 . Los exudados radiculares, secreciones, mucílagos, mucigel y lisados ​​de las raíces alteran las propiedades físico-químicas de la rizosfera para atraer o repelerMicrobios hacia sus huéspedes 6 . La composición química de la secreción de las raíces es específica de la especie, sirviendo así como un filtro selectivo que permite que ciertos microorganismos capaces de reconocer tales compuestos florezcan en la rizosfera 6 . Por lo tanto, las especies microbianas compatibles pueden ser estimuladas para activar y mejorar sus asociaciones, ya sea en beneficio o detrimento de la planta huésped 1 . La comprensión de las interacciones planta-microbio en la rizosfera es clave para mejorar la productividad de la planta y el funcionamiento del ecosistema, ya que la mayoría de la exposición microbiana y química ocurre en la estructura de la raíz y en la interfase suelo-aire 2 , 6 , 7 , 8 . Sin embargo, el examen de las interacciones planta-microbios subterráneas y respuestas recíprocas ha sido un desafío debido a su intrigante<html> Compleja y dinámica y la falta de modelos experimentales adecuados con estructura de raíces naturales y morfología de plantas bajo condiciones de crecimiento controlables. Como uno de los fitopatógenos más estudiados, Agrobacterium infecta una amplia gama de plantas con importancia agrícola y hortícola, incluyendo cereza, manzana, pera, uva y rosa 9 . Agrobacterium es un organismo modelo importante para la comprensión de las interacciones planta-patógeno y es una herramienta poderosa en la transformación de plantas y la ingeniería de plantas 10 , 11 , 12 , 13 , 14 . Las interacciones moleculares entre plantas y Agrobacterium han sido bien estudiadas durante varias décadas, y la comprensión actual de la patogenicidad de Agrobacterium es extensa 9 ,f &quot;&gt; 11, 15, 16. patogenicidad Agrobacterium se atribuye en gran parte a sus capacidades evolucionadas de percibir señales derivadas de plantas, dando como resultado la modulación fina de su programa de la virulencia y la comunicación de célula a célula, llamado quórum de detección 17. La El programa de virulencia de Agrobacterium está regulado por varias señales disponibles en la rizosfera e incluye dos sistemas de sistemas de dos componentes, el sistema ChvG / I y el sistema VirA / G. Las condiciones ácidas en la rizosfera activan la transcripción de chvG / I , virA / G , Y varios otros genes implicados en la patogenicidad de Agrobacterium , incluyendo virE0 , virE1 , virH1 , virH2 y genes del sistema de secreción de tipo VI (T6SS) 18. Compuestos fenólicos derivados de plantas, incluyendo acetosiringona (4&#39;-hidroxi-3 &#39;, 5 &#39;-dimetoxiacetofenona), activar el VIrA / G sistema de 2 componentes a través de mecanismos de señalización de fosforilación 19 . VirA / G activa entonces todo el vir regulon, dando como resultado la transferencia e integración de un fragmento de ADN bacteriano de aproximadamente 20 kb denominado ADN de transferencia (T-DNA) desde su plásmido inductor de tumores (Ti) al núcleo de la planta 16 . T-DNA transporta genes responsables de la síntesis de las hormonas vegetales indol-3-acético (IAA) ( iaaM y iaaH ) y citoquinina ( ipt ), y una vez expresado en las células vegetales, se producen grandes cantidades de estas fitohormonas. Esto da lugar a la proliferación anormal del tejido y al desarrollo del tumor de la planta, conocida como enfermedad de la bilis de la corona, que es un problema crónico y resurgente para las plantas 9 , 11 , 20 . IAA también actúa colectivamente con ácido salicílico y ácido gamma-amino butírico para reprimir la virulencia de Agrobacterium o para reducir Agrobacteriu<html> M quorum sensing (QS) 17 , 21 , 22 . Para contrarrestar esta represión, el T-DNA también lleva genes para la biosíntesis de opina, que activa la detección de Agrobacterium quorum para promover la patogenicidad de Agrobacterium y también sirve como fuente de nutrientes para el patógeno 22 , 23 . A pesar de una profunda comprensión global de Agrobacterium- planta interacciones y la transferencia de T-DNA resultante en el huésped de la planta, los complejos eventos de señalización en la etapa inicial de la interacción son menos bien entendidos. Esto se debe en parte a las limitaciones de los métodos convencionales para investigar la señalización de planta de Agrobacterium . Los cultivos de suspensión de células vegetales y heridas artificiales específicas del sitio se usan comúnmente para estudiar las interacciones moleculares planta-microbio 24 ,. ef &quot;&gt; 26, 27 Sin embargo, las suspensiones de células carecen de morfología de la planta típica, en particular, células en suspensión planta no tienen estructuras profundas y los exudados de la raíz, que son muy importantes para la activación de la quimiotaxis microbiana y la virulencia 28, 29 El mantenimiento de la morfología de la planta. Y la estructura de la raíz se ha tratado de herir artificialmente a las plantas, lo que facilita la infección específica del sitio, lo que resulta en la detección de genes inducidos relacionados con la defensa de la planta en tejido vegetal directamente infectado 30 , 31. Sin embargo, la herida artificial es significativamente diferente de la infección patógena en la naturaleza , Particularmente como herida conduce a la acumulación de ácido jasmónico (JA), que sistemáticamente interfiere con la señalización de la planta natural y la defensa 26. Además, los productos químicos sintéticos se utilizan normalmente para inducir artificialmente las respuestas del huésped de la plantaO virulencia patógena. Aunque la suplementación de tales compuestos químicos refleja concentraciones en planta es posible, tal suplementación no explica la difusión de los exudados de raíz gradualmente en la rizosfera circundante, lo que genera un gradiente quimiotáctico detectado por los microbios 28 , 32 . Dadas las limitaciones de los enfoques convencionales para estudiar las interacciones planta-microbios, la exactitud y la profundidad de los datos obtenidos podrían ser impedidas y restrictivas, y el conocimiento generado a partir de los enfoques convencionales puede no traducir directamente in planta . Muchos aspectos de la señalización de Agrobacterium en las plantas aún no se entienden completamente, particularmente en la etapa temprana de las interacciones, cuando los síntomas de la enfermedad aún no se han desarrollado. Para enmendar las limitaciones de los enfoques convencionales, este trabajo presenta un bajo costo, controlable, y flexible hydroponic cOcultivation sistema que permite a los investigadores a obtener una visión más profunda de la compleja de señalización y respuesta a las vías en la etapa inicial de la planta molecular microbio interacciones. La hidroponía se ha utilizado ampliamente para estudiar los nutrientes de las plantas, los exudados de las raíces, las condiciones de crecimiento y los efectos de la toxicidad metálica en las plantas 33 , 34 . Existen varias ventajas de los modelos hidropónicos, incluyendo las pequeñas exigencias espaciales, la accesibilidad de los diversos tejidos vegetales, el estricto control de las condiciones nutrientes / ambientales y el control de plagas / enfermedades. Los sistemas hidropónicos también son menos limitantes para el crecimiento de las plantas en comparación con las técnicas de placas de agar / phytoagar, que típicamente restringen el crecimiento después de 2-3 semanas. Es importante destacar que el mantenimiento de las estructuras de toda la planta facilita la secreción de raíces naturales necesarias para la quimiotaxis microbiana y la inducción de la virulencia [ 8 , 29] . El sistema descriLa cama aquí es más simple y menos laboriosa que las alternativas 33 , 34 . Utiliza menos piezas y no requiere ninguna otra herramienta que las tijeras estándar. Utiliza malla metálica (en oposición al nylon 33 ) como soporte fuerte para el crecimiento de la planta y un método simple de aireación en condiciones estériles mediante agitación para soportar el crecimiento microbiano. Además, el sistema puede utilizar malla metálica de varios tamaños para apoyar el crecimiento de la planta, que acomoda diversas especies de plantas sin restringir la anchura de sus raíces. En el sistema de cocultivación hidropónica presentado aquí, las plantas se cultivan en un sistema hidropónico estéril donde las raíces de las plantas secretan compuestos orgánicos que apoyan el crecimiento de las bacterias inoculadas. En este sistema de cocultivación, no se suplementan productos químicos artificiales, tales como hormonas vegetales, elicitor de defensa, o productos químicos que inducen virulencia, lo que refleja la célula natural-significando la homeostasis durante las interacciones planta-microbio. Con este sistema de cocultivación hidropónica, fue posible determinar simultáneamente la expresión génica en el tejido de raíz de Col-0 de Arabidopsis thaliana tras la infección por Agrobacterium , así como la activación de genes de Agrobacterium tras la cocultivación con Arabidopsis . Se demostró además que este sistema es adecuado para estudiar la fijación de Agrobacterium a las raíces de las plantas, así como el perfil de secreto de la raíz de la planta, al cocultivar (infección) con Agrobacterium ( Figura 1 ). <img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55955/55955fig1.jpg" /> Figura 1: Visión general del sistema de cocultivación hidropónica, con análisis de muestras. Las plantas se cultivan en la parte superior de la malla (brotes por encima de la malla), con las raíces sumergidas en medio hidropónico que luego se inocula con bacterias fO el coculture. Los tejidos vegetales y las bacterias se separan para extracciones y análisis simultáneos. Esta cifra ha sido modificada a partir de la referencia 35 .

<table><tbody><tr><td>semillas de plantas (Arabidopsis thaliana Col-0)</td><td>Centro de Recursos Biológicos de Arabidopsis</td><td>CS7000</td><td></td></tr><tr><td>https://abrc.osu.edu/order-stocks bacterias (Agrobacterium tumefaciens C58)</td><td>Universidad de Washington</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>bacterias etiquetadas</td><td>internamente</td><td></td><td>opcional, depende de análisis posteriores</td></tr><tr><td>vórtice</td> <td>(varios)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tubos de microcentrífuga</td>(<td>varios)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>microcentrífuga</td>(<td>varios)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>hipoclorito de sodio al 5%</td><td>(varios)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>agua destilada doble</td><td>(varios)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>autoclave</td><td>(varios)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>micropipeta&nbsp;</td><td>(varios)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% etanol</td><td>(varios)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Murashige y Skoog (MS) sales basales</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5524</td><td></td></tr><tr><td>sacarosa</td><td>(varios)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MES(</td><td>varios)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mezcla de vitaminas</td><td>B5 Sigma-Aldrich</td><td>G1019</td><td></td></tr><tr><td>fitoagar</td><td>(varios)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri profundas</td> <td>(varias)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>malla de acero inoxidable</td><td>Ferrier Wire Goods Company Ltd</td> N<td>/A</td><td>grado: 304; recuento de malla: 40 y veces; 40; alambre DIA: 0.01</td></tr><tr><td>cinta de microporos, 1"</td><td>3M</td><td>1530-1</td><td></td></tr><tr><td>cámara de crecimiento diurna</td> <td>(varios)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tanques de vidrio cilíndricos, 100 y veces; 80 mm&nbsp;</td>Se pueden utilizar otros tamaños <td>de Pyrex</td><td>3250</td><td>, en cuyo caso el contenido de líquido puede necesitar un ajuste</td></tr> de <tr><td>la campana de flujo</td><td>(varios)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>forcepts</td><td>(varios)</td><td></td><td></td></tr>extracto de <tr><td>levadura</td><td>(varios)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>triptona</td><td>(varios)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>(varios)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>incubadora de agitación</td><td>(varios)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>espectrofotómetro</td><td>(varios)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>(varios)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>agitador</td><td>(varios)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tijeras</td><td>(varios)</td><td></td><td>opcional, depende de los análisis posteriores</td></tr><tr><td>microscopio de fluorescencia</td><td>(varios)</td><td></td><td>opcional, depende de aguas abajo análisis</td></tr><tr><td>portaobjetos de microscopio y cubreobjetos</td><td>(varios)</td><td></td><td>opcional, depende de los análisis posteriores</td></tr><tr><td>esmalte de uñas</td>(<td>varios)</td><td></td><td>opcional, depende de los análisis posteriores Kit de</td></tr><tr><td>extracción de ARN bacteriano</td><td>(varios)</td><td></td><td>opcional, depende de los análisis posteriores kit de</td></tr><tr><td>extracción de ARN de la planta (RNeasy Plant Mini Kit)</td><td>Qiagen</td><td>74903 o 74904</td><td>opcional, depende de los análisis</td></tr> posteriores <tr><td>material y equipo para qRT-PCR</td> <td>(varios)</td><td></td><td>opcional, depende de los análisis posteriores</td></tr><tr><td>material y equipo para el análisis de microarrays</td><td>(varios)</td><td></td><td>opcional, depende de los análisis posteriores</td></tr> nitrógeno <tr><td>líquido</td> <td>(varios)</td><td></td><td>opcional, depende de los análisis posteriores</td></tr><tr><td>mortero y mortero</td> <td>(varios)</td><td></td><td>opcional, depende de los análisis posteriores</td></tr><tr><td>0.2 y micro; m filtro de poros</td>(<td>varios)</td><td></td><td>opcional, depende de los análisis posteriores</td></tr><tr><td>50 mL tubos cónicos</td>(<td>varios)</td><td></td><td>opcional, depende de los análisis posteriores</td></tr><tr><td>liofilizador</td><td>(varios)</td><td></td><td>opcional, depende de los análisis posteriores</td></tr> tubos <tr><td>de ensayo sellables</td><td>(varios)</td><td></td><td>opcional, depende de los análisis posteriores</td></tr><tr><td>acetato de etilo</td><td>(varios)</td><td></td><td>opcional, depende de los análisis posteriores gas</td></tr><tr><td>nitrógeno</td><td>(varios)</td><td></td><td>opcional, depende de los análisis posteriores</td></tr><tr><td>material y equipo para HPLC</td><td>(varios)</td><td></td><td>opcional, depende de los análisis posteriores</td></tr><tr><td>material y equipo para ESI-TOF-MS</td><td>(varios)</td><td></td><td>opcional, depende de los análisis posteriores</td></tr></tbody></table>

un sistema de cultivo hidropónico para el análisis simultáneo y sistemático de interacciones moleculares de plantas / microbios y señalización

A Hydroponic Co-cultivation System for Simultaneous and Systematic Analysis of Plant/Microbe Molecular Interactions and Signaling

Un diseño experimental que simula las interacciones naturales planta-microbio es muy importante para delinear los complejos procesos de señalización planta-microbio. Arabidopsis thaliana - Agrobacterium tumefaciens Proporciona un sistema modelo excelente para estudiar la patogénesis bacteriana y las interacciones de las plantas. Los estudios previos de las interacciones planta- Agrobacterium se han basado en gran medida en cultivos de suspensión de células de plantas, heridas artificiales de plantas o inducción artificial de factores de virulencia microbiana o defensas de plantas mediante productos químicos sintéticos. Sin embargo, estos métodos son distintos de la señalización natural in planta , donde las plantas y los microbios reconocen y responden en formas espaciales y temporales. Este trabajo presenta un sistema de cocultivo hidropónico donde las plantas intactas son soportadas por mallas de malla metálica y cocultivadas con Agrobacterium . En este sistema de cocultivación, no hay fitohormona sintética o producto químico que induzca micrLa virulencia obial o la defensa de la planta se complementa. El sistema de cocultivación hidropónica se asemeja mucho a las interacciones planta-microbios naturales y señala la homeostasis in planta . Las raíces de las plantas se pueden separar del medio que contiene Agrobacterium , y la señalización y las respuestas tanto de los huéspedes de la planta como de los microbios que interactúan pueden ser investigadas simultánea y sistemáticamente. En cualquier punto / intervalo dado, los tejidos vegetales o las bacterias se pueden cosechar por separado para diversos análisis &quot;ómicos&quot;, demostrando la potencia y eficacia de este sistema. El sistema de cocultivación hidropónico se puede adaptar fácilmente al estudio: 1) la señalización recíproca de diversos sistemas de microbios de plantas, 2) señalización entre un huésped vegetal y múltiples especies microbianas ( es decir, consorcios o microbios microbianos), 3) cómo están implicados los nutrientes y los productos químicos En la señalización de microbios de plantas, y 4) cómo los microbios interactúan con los huéspedes de la planta y contribuyen a la tolerancia de las plantas aR estrés abióticos.

Crecimiento en el sistema de co-cultivo hidropónico La curva de crecimiento de A. tumefaciens C58 demostró una fase de retraso significativo en las 16 h iniciales de cocultivación, seguido de un crecimiento muy estable cuando se co-cultivó con A. thaliana Col-0, hasta un máximo de DO 600 de aproximadamente 0,9 a partir de 48 h postinoculación. Por el contrario, esencialmente no se observó crecimiento ...

El sistema de cocultivo hidropónico descrito soporta plantas intactas con mallas de malla metálica y las convierte en cocultivas con bacterias. El tejido de las plantas, las bacterias y las moléculas secretadas pueden ser recogidas separadamente para análisis de aguas abajo, permitiendo simultáneamente que se investiguen las respuestas moleculares tanto de los huéspedes de la planta como de los microbios o microbios que interactúan.

Un Sistema de Cultivo Hidropónico para el Análisis Simultáneo y Sistemático de Interacciones Moleculares de Plantas / Microbios y Señalización

An experimental design mimicking natural plant-microbe interactions is very important to delineate the complex plant-microbe signaling processes. ...

El objetivo general de este sistema es estudiar la interacción y las respuestas de señalización recíproca entre plantas y microorganismos asociados, o las respuestas de las plantas a productos químicos o factores abióticos, en un montaje experimental sencillo que imita de cerca el entorno natural. Este video muestra la co-cultivación de plantas con la bacteria Agrobacterium tumefaciens. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre las interacciones microbianas en plantas, la respuesta al estrés microbiano o vegetal y la señalización molecular, incluida la señalización compleja incluso en una etapa inicial de las interacciones microbianas de una planta.La principal ventaja de esta técnica es que ayuda a comprender la naturaleza de la señalización y la respuesta en las interacciones microbianas de una planta, en un montaje sencillo que incluye la simulación del entorno natural. Aunque este método puede utilizarse para obtener información sobre las interacciones de la planta con una sola especie microbiana, también puede emplearse para estudiar las interacciones de la planta con múltiples especies microbianas o con factores abióticos. Tuvimos la idea de este método mientras buscábamos la homeostasis en la señalización celular durante interacciones planta-microbio que imitan de cerca situaciones naturales.Para comenzar el experimento, las semillas deben esterilizarse. Para Arabidopsis thaliana, combine aproximadamente 200 semillas con 500 microlitros de agua desionizada en un tubo de microcentrífuga y vortexee el tubo a alta velocidad. Centrifugue el tubo a 9000 x g durante 30 segundos en una microcentrífuga de banco.Utilizando una pipeta, retire el sobrenadante acuoso. A continuación, agregue 300 microlitros de hipoclorito de sodio al 2% a las semillas y vortexéelas. Deje reposar la mezcla a temperatura ambiente.Después de un minuto, centrifugue las semillas. Con la pipeta, retire la solución de hipoclorito de sodio. A continuación, agregue 500 microlitros de agua estéril desionizada a las semillas y vortexe la mezcla.Después de centrifugar el tubo, retire el agua. Añada 500 microlitros de etanol al 70 % a las semillas y vortexeé la mezcla. Después de permitir que las semillas sedimenten durante un minuto, centrifugue el tubo.Elimine el etanol al 70 % utilizando una pipeta. Lave las semillas cinco veces con 500 microlitros de agua estéril desionizada. A continuación, vuelva a suspender las semillas esterilizadas en 500 microlitros de agua estéril ultrapura.Vierta 25 mililitros de medio Murashige y Skoog (MS) a media fuerza con agar fítico al 0,4% en cada placa de Petri estéril y profunda. Para cada placa de Petri, corte un cuadrado de malla de acero inoxidable de 90 milímetros por 90 milímetros. Doble ligeramente las esquinas de cada malla cuadrada, lo justo para que la malla quepa dentro de la placa de Petri.Doble las esquinas en un ángulo de 90 grados respecto al cuerpo principal de la malla para permitir que la malla se sostenga sobre las esquinas, dejando suficiente espacio debajo para el desarrollo de las raíces. Coloque los cuadrados de malla recortados en un vaso de precipitados y cúbralos con papel de aluminio. Esterilice los cuadrados de malla mediante autoclave utilizando un ciclo seco de 30 minutos.Una vez que el medio haya solidificado en las placas de Petri y la malla esté estéril, coloque cada cuadrado de malla sobre el medio sólido con las esquinas dobladas hacia abajo. Presione la malla para que las esquinas penetren en el medio y la mayor parte de la malla toque la superficie superior del medio. A continuación, utilice una pipeta estéril de 200 microlitros para extraer las semillas individuales de A thaliana esterilizadas superficialmente y transfiera suavemente cada semilla sobre la malla.Coloque las semillas de manera que queden espaciadas según la especie vegetal y las necesidades experimentales. Cierre las placas de Petri con sus tapas y coloque cinta quirúrgica porosa alrededor de los bordes de las placas. Envuelva las semillas en papel de aluminio.Estratifique las semillas colocando todo el plato de Petri. Después de dos días, cultive las semillas en el plato de Petri a 22-24 grados Celsius con un período fotoperiódico de 16 horas durante 10 a 14 días. En una cabina de flujo esterilizada, vierta 18 mililitros de medio MS líquido autoclavado en frascos de vidrio cilíndricos estériles con tapas estériles.A continuación, utilice pinzas estériles para transferir suavemente cada cuadrado de malla con plántulas de 10 a 14 días de edad desde la placa de Petri con medio semisólido hasta un tanque cilíndrico hidropónico. Las plántulas mostradas aquí son de alfalfa. Selle las tapas de los tanques utilizando cinta quirúrgica porosa.Luego, cultive las plántulas a 22-24 grados Celsius con un fotoperíodo de 16 horas y agitación a 50 rpm. Antes de la inoculación, examine cuidadosamente el tanque con plántulas en busca de cualquier contaminación potencial. El medio en los tanques no contaminados debe estar claro y transparente.Si los tanques están turbios debido a contaminación, deséchelos y numere el resto de los tanques. Tome una muestra de 20 microlitros de medio hidropónico de cada tanque numerado y colóquela en una placa de Petri con caldo Luria o agar LB. Incube la placa a 28 grados Celsius durante 28 horas.Inocule inmediatamente cada tanque hidropónico numerado con 50 microlitros de la suspensión de agrobacterium tumefacians en cada tanque hidropónico numerado. Co-cultive las plántulas y la bacteria A tumefacians a 22-24 grados Celsius con un período fotoperiódico de 16 horas y agitación a 50 rpm. Examine la placa LB con manchas tras 12 y 28 horas de incubación para verificar la esterilidad del medio de crecimiento hidropónico.Si hay alguna contaminación, no utilice el tanque numerado correspondiente inoculado con bacterias para ensayos posteriores. A continuación, separe las raíces de la suspensión bacteriana levantando la placa de malla. Si va a utilizar las raíces para análisis posteriores, corte las raíces, enjuáguelas rápidamente con agua doblemente destilada y séquelas sobre papel de filtro esterilizado.Si se utilizan hojas u otro tejido, corte el tejido. Para el análisis de transcritos vegetales, las raíces o brotes deben depositarse inmediatamente en nitrógeno líquido. Para el análisis de transcritos bacterianos, transfiera 1.5 mililitros de la cultura desde el tanque de co-cultivo y haga un pellet de las células por centrifugación.Tras una co-cultivación adecuada, utilice tijeras estériles para separar las raíces secundarias individuales, las ramas laterales de la raíz principal. A continuación, enjuague las raíces con agua doblemente destilada para eliminar los materiales débilmente adheridos. Sumerja cada raíz en 30 microlitros de agua sobre un portaobjetos de microscopio y cúbrala con una laminilla de vidrio.Selle los bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas para proteger las raíces de la deshidratación. Luego, visualice la adhesión de A tumefaciens a las raíces de A thaliana mediante microscopía de fluorescencia. Tras una co-cultivación adecuada, separe las plantas del medio hidropónico.Sterilice los 18 mililitros de medio hidropónico haciéndolos pasar a través de un filtro de 0,2 micrones de poro hacia tubos cónicos de 50 mililitros. Congele las muestras a 80 grados Celsius durante la noche. Al día siguiente, afloje las tapas de los tubos cónicos de 50 mililitros y colóquelos en una máquina de liofilización durante 36 horas.Finalmente, proceda a almacenar o procesar las muestras para el análisis por HPLC y la detección de compuestos. Sin nutrientes suministrados artificialmente, A tumefaciens c58 creció en el sistema de co-cultivo. En contraste, esencialmente no se observó crecimiento bacteriano en el cultivo control sin A thaliana.Los sistemas de co-cultivo hidropónico pueden utilizarse para estudiar la adhesión de bacterias a la estructura de la raíz, como se observa en esta visualización microscópica, donde bacterias marcadas con fluorescencia roja PCherry se localizaron en la estructura de la raíz de la planta con una forma típica similar a rocas o filamentos. Los perfiles de expresión génica tanto de las plantas como de los microorganismos en interacción pueden determinarse mediante qRT-PCR. Después de ocho horas de co-cultivo, ocho células de tumefaciens mostraron una regulación positiva de la expresión de genes de virulencia.Al mismo tiempo, las raíces de A thaliana revelaron una expresión diferencial de genes en respuesta al co-cultivo. Después de 72 horas de co-cultivo, 35 compuestos se incrementaron y 76 compuestos disminuyeron en el secretoma de las plantas inoculadas en comparación con el control. Esta técnica allana el camino para que los investigadores estudien las interacciones planta-microbio y exploren las respuestas recíprocas entre la planta y el microbio o los socios del microbioma, o las respuestas de la planta a factores abióticos en un montaje sencillo que imita de cerca el entorno natural.Después de ver esto con ustedes, esperamos que sean capaces de establecer un sistema de co-cultivo microbiano vegetal en hidroponía para estudiar las plantas moleculares, las interacciones microbianas y las respuestas de señalización en un entorno más natural y manejable.

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Biología

Fuente: Nathoo, N., et al. Un sistema de cocultivo hidropónico para el análisis simultáneo y sistemático de las interacciones moleculares y la señalización de plantas / microbios. J. Vis. Exp. (2017).Este video demuestra un sistema de cocultivo hidropónico para estudiar las interacciones planta-bacteria en condiciones estériles. Las plántulas de plantas se transfieren a un medio de crecimiento estéril y ácido, se incuban y se inspeccionan para detectar contaminación antes de la inoculación con...

Un sistema de cocultivo para estudiar las respuestas moleculares de las plantas hospedadoras y las bacterias que interactúan

Las bacterias producen compuestos secretados que tienen el potencial de afectar a la fisiología de sus vecinos microbianos. Aquí se describe una pantalla de co-cultivo que permite la detección de este tipo de interespecies mediadas químicamente interacciones mediante la mezcla de los microbios del suelo con cepas reportero transcripcional fluorescentes de Bacillus subtilis en medios sólidos.

Usando Coculture detectar químicamente mediadas por interacciones interespecíficas

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La hidroponía: un sistema versátil para el Estudio de nutrientes Las respuestas de las plantas a la asignación y disponibilidad de nutrientes y la exposición a elementos tóxicos

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Monitoreo de la Colonización Y Mantenimiento Bacterial en Arabidopsis thaliana Roots en un Sistema Hidropónico Flotante

Los ensayos de interacción de cocultura presentados en este protocolo son económicos, de alto rendimiento y simples. Estos ensayos se pueden utilizar para observar interacciones microbianas en el cocultivo, identificar patrones de interacción y caracterizar el potencial inhibitorio de una cepa microbiana de interés contra patógenos humanos y ambientales.

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Estrategias de inoculación para infectar las raíces de las plantas con microorganismos transmitidos por el suelo

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Un sistema versátil de frascos de vidrio para el perfilado de exudado de raíces semihidropónico

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Cultivo y selección monoclonales microbianos automatizados y de alto rendimiento mediante el sistema ómico de cultivo de gotas de microlitros de una sola célula

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Un Sistema de Cultivo Hidropónico para el Análisis Simultáneo y Sistemático de Interacciones Moleculares de Plantas / Microbios y Señalización (Video) | JoVE Journal

Un Sistema de Cultivo Hidropónico para el Análisis Simultáneo y Sistemático de Interacciones Moleculares de Plantas / Microbios y Señalización

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