Un Sistema de Cultivo Hidropónico para el Análisis Simultáneo y Sistemático de Interacciones Moleculares de Plantas / Microbios y Señalización

El objetivo general de este sistema es estudiar la interacción de señalización recíproca y las respuestas entre las plantas y los micro-socios o las respuestas de las plantas a productos químicos o factores abióticos en una configuración simplemente experimental que imita de cerca el entorno natural. Este video muestra el co-cultivo de plantas con la bacteria Agrobacterium tumefaciens. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre las interacciones microbianas de las plantas, la respuesta microbiana o al estrés de las plantas y la señalización molecular, incluida la señalización compleja incluso en una etapa inicial de las interacciones microbianas de una planta.

La principal ventaja de esta técnica es que ayuda a comprender la señalización natural y la respuesta de las interacciones microbianas de una planta, en una configuración simple que incluye la imitación del entorno natural. Aunque este método se puede utilizar para proporcionar información sobre las interacciones de las plantas con una sola especie microbiana, también se puede utilizar para estudiar las interacciones de las plantas con múltiples especies microbianas o con factores abióticos. Tuvimos la idea de este método mientras buscábamos la homeostasis de la señalización celular durante las interacciones de los microbios de las plantas que imitan de cerca las situaciones naturales.

Para comenzar el experimento, las semillas deben ser esterilizadas. Para Arabidopsis thaliana, combine aproximadamente 200 semillas con 500 microlitros de agua desionizada en un tubo de microcentrífuga y agite el tubo a alta velocidad. Centrifugar el tubo a 9000 x g durante 30 segundos en una microcentrífuga de mesa.

Con una pipeta, retire el sobrenadante de agua. A continuación, agregue 300 microlitros de hipoclorito de sodio al 2% a las semillas y vórtelas. Deja que la mezcla se asiente a temperatura ambiente.

Después de un minuto, centrifuga las semillas. Con la pipeta, retire la solución de hipoclorito de sodio. Luego agregue 500 microlitros de agua estéril y desionizada a las semillas y agite la mezcla.

Después de centrifugar el tubo, retire el agua. Agregue 500 microlitros de etanol al 70% a las semillas y agite la mezcla. Después de dejar que las semillas se asienten durante un minuto, centrifuga el tubo.

Retire el etanol al 70% con una pipeta. Lave las semillas cinco veces con 500 microlitros de agua estéril y desionizada. Luego, vuelva a suspender las semillas esterilizadas en 500 microlitros de agua estéril ultra pura.

Vierta 25 mililitros de medio Murashige y Skoog de concentración media, o MS con 04% de fito agar en cada placa de Petri estéril y profunda. Para cada placa de Petri, corte un cuadrado de 90 milímetros por 90 milímetros de malla de acero inoxidable. Dobla las esquinas de cada malla cuadrada lo suficiente para que la malla quepa dentro de la placa de Petri.

Doble las esquinas en un ángulo de 90 grados con respecto a la mayor parte de la malla para permitir que la malla se apoye en las esquinas, dejando suficiente espacio debajo para el desarrollo de las raíces. Coloque los cuadrados de malla cortados en un vaso de precipitados y cúbralos con papel de aluminio. Esterilice los cuadrados de malla esterilizándolos en autoclave con un ciclo de secado de 30 minutos.

Una vez que el medio se haya solidificado en las placas de Petri y la malla esté estéril, coloque cada cuadrado de malla encima del medio sólido con las esquinas dobladas hacia abajo. Empuje la malla para que las esquinas penetren en el medio y la mayor parte de la malla toque la superficie superior del medio. A continuación, utilice una pipeta estéril de 200 microlitros para extraer las semillas individuales de A thaliana esterilizadas en la superficie y transfiera suavemente cada semilla sobre la malla.

Coloque las semillas de manera que estén espaciadas según la especie de planta y las necesidades experimentales. Selle las placas de Petri con tapas y coloque cinta quirúrgica porosa alrededor de los bordes de las placas. Envuelve las semillas en papel de aluminio.

Estratifica las semillas colocando toda la placa de Petri. Después de dos días, cultive las semillas en la placa de Petri a 22 a 24 grados centígrados con un período fotográfico de 16 horas durante 10 a 14 días. En una campana de flujo esterilizada, vierta 18 mililitros de medio MS líquido esterilizado en autoclave en tanques de vidrio cilíndricos estériles con tapas estériles.

A continuación, use pinzas estériles para transferir suavemente cada cuadrado de malla con plántulas de 10 a 14 días de edad desde la placa de Petri de medio semisólido a un tanque cilíndrico hidropónico. Las plántulas que se muestran aquí son de alfalfa. Selle las tapas de los tanques con cinta quirúrgica porosa.

Luego, cultive las plántulas a 22 a 24 grados centígrados con un fotoperíodo de 16 horas y agitando a 50 rpm. Antes de la inoculación, examine cuidadosamente el tanque con plántulas para detectar cualquier posible contaminación. El medio en los tanques no contaminados debe ser claro y transparente.

Si los tanques están turbios por la contaminación, deséchelos y numere el resto de los tanques. Muestree 20 microlitros de medio hidropónico de cada tanque numerado y colóquelo en una placa de Petri con caldo Luria o agar LB. Incubar el plato a 28 grados centígrados durante 28 horas.

Inocular inmediatamente cada tanque hidropónico numerado con 50 microlitros de la suspensión de agrobacterium tumefacians en cada tanque hidropónico numerado. Co-cultivar las plántulas y la bacteria A tumefacian a 22 a 24 grados centígrados con un fotoperiodo de 16 horas y agitando a 50 rpm. Examine la placa LB manchada después de 12 y 28 horas de incubación para verificar la esterilidad del medio de crecimiento hidropónico.

Si hay alguna contaminación, no utilice el tanque numerado correspondiente inoculado con bacterias para ensayos posteriores. A continuación, separe las raíces de la suspensión bacteriana levantando la placa de malla. Si utiliza raíces para análisis posteriores, corte las raíces, enjuáguelas rápidamente con agua bidestilada y séquelas en papel de filtro esterilizado.

Si usa hojas u otro pañuelo, corte el pañuelo. Para el análisis de la transcripción de las plantas, las raíces o brotes deben depositarse inmediatamente en nitrógeno líquido. Para el análisis de la transcripción bacteriana, transfiera 1,5 mililitros del cultivo desde el tanque de cocultivo y granule las células por centrifugación.

Después de un cocultivo adecuado, utilice tijeras estériles para separar las raíces secundarias individuales, las ramas laterales de la raíz principal. A continuación, enjuague las raíces con agua destilada doble para eliminar el material suelto. Sumerge cada raíz en 30 microlitros de agua en un portaobjetos de microscopio y cúbrela con un cubreobjetos de vidrio.

Sella los bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas para proteger las raíces de la deshidratación. A continuación, visualice la unión de A tumefacian a las raíces de A thaliana mediante microscopía de fluorescencia. Después de un cocultivo adecuado, separe las plantas del medio hidropónico.

Esteriliza los 18 mililitros de medio hidropónico pasándolo a través de un filtro de poros de 0,2 micras en tubos cónicos de 50 mililitros. Congele las muestras a 80 grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, afloje las tapas de los tubos cónicos de 50 mililitros y colóquelos en una liofilizadora durante 36 horas.

Finalmente, proceda a almacenar o procesar las muestras para el análisis de HPLC y la detección de compuestos. Sin nutrientes suministrados artificialmente, A tumefacian c58 creció en el sistema de cocultivo. Por el contrario, esencialmente no se observó crecimiento bacteriano en el cultivo de control sin A thaliana.

Los sistemas de cocultivo hidropónico se pueden utilizar para estudiar la unión de las bacterias a la estructura de la raíz, como se ve en esta visualización microscópica, donde las bacterias marcadas con fluorescencia roja PCherry se localizaron en la estructura de la raíz de la planta con una forma típica de roca o filamenta. Los perfiles de expresión génica tanto de las plantas como de los microbios que interactúan se pueden determinar a través de QRTPCR. Después de ocho horas de cocultivo, ocho células de tumefacia revelaron la regulación de la expresión de los genes de virulencia.

Al mismo tiempo, las raíces de A. thaliana revelaron una expresión génica diferencial en respuesta al cocultivo. Después de 72 horas de co-cultivo, se mejoraron 35 compuestos y se disminuyeron 76 compuestos en el secretoma de las plantas inoculadas en comparación con el control. Esta técnica allana el camino para que los investigadores estudien las interacciones planta-microbio y exploren las respuestas recíprocas entre la planta y el microbio o los socios del bioma microbio, o las respuestas de la planta a factores abióticos en una configuración simple que imita de cerca el entorno natural.

Después de ver esto con usted, esperamos que pueda configurar un sistema de cocultivo de plantas microbianas en hidroponía para estudiar las plantas moleculares, las interacciones microbianas y las respuestas de señalización en un entorno más natural y manejable.