Un método computacional para cuantificar la actividad circadiana mosca

En la mayoría de los animales, los relojes circadianos orquestan procesos moleculares y de comportamiento y los sincronizan con el ciclo diario de luz-oscuridad. En las moscas de la fruta, el reloj se estudia típicamente utilizando registros locomotores. Aquí hay un ejemplo de locomoción promedio de tipo salvaje medido en un ciclo de 12 horas de luz, 12 horas de oscuridad, el ciclo de luz-oscuridad se muestra con una barra amarilla-negra en la parte superior.

Un registro típico de moscas muestra un patrón complejo y biomodal con dos picos de actividad, un pico matutino que ocurre alrededor del amanecer y un pico vespertino que ocurre alrededor del anochecer. Estos dos picos juntos forman una forma de onda que es muy diferente de las oscilaciones sinusoidales observadas en los genes del reloj, lo que sugiere que los mecanismos, además del reloj, tienen un efecto profundo en la producción del patrón observado en los datos de comportamiento. Aquí presentamos el primer método que describe matemáticamente los patrones temporales en la actividad de las moscas.

Ajustamos los datos de actividad con una forma de onda modelo que imita la locomoción de las moscas. Nuestro modelo consta de cuatro términos exponenciales, dos términos desde el pico de la mañana y dos términos desde el pico de la tarde. Junto con el período circadiano, nuestro modelo tiene nueve parámetros independientes.

Los parámetros B definen la tasa de aumento matutino, decaimiento matutino, aumento vespertino y decaimiento vespertino. TM y TE definen las anchuras de los picos matutinos y vespertinos, y HM y HE definen las alturas de los picos. En conjunto, estos parámetros describen completamente el tamaño y la forma de los picos matutinos y vespertinos en el patrón de actividad.

Nuestro método se puede aplicar para dilucidar los mecanismos y el sustrato que subyacen al patrón de actividad bimodal comúnmente observado en las lecturas locomotoras de la mosca. Para el experimento de locomoción, prepare tubos individuales con comida en un extremo y algodón en el otro. Para eso, primero, ponga de cinco a seis gramos de comida para moscas en un vaso de precipitados de 50 mililitros.

Corta los alimentos en trozos pequeños, para que sea más fácil derretirlos en el microondas. El monitor de actividad individual se adapta a 32 tubos individuales. Por lo tanto, tome 32 tubos y conéctelos con una banda elástica.

Derrite la comida en el vaso de precipitados en un microondas. Caliente la comida durante aproximadamente 10 a 15 segundos. Detenga el microondas cada cinco segundos y agite un poco el vaso de precipitados con alimentos para garantizar que los alimentos se derritan por igual.

Asegúrese de que todos los alimentos estén derretidos y que no queden trozos sólidos de alimentos en el vaso de precipitados. Mientras los alimentos aún están líquidos, inserte tubos en el vaso de precipitados con alimentos. Mueva los tubos hacia arriba y hacia abajo un poco, para que se llenen por igual.

Deje que la comida se enfríe y solidifique durante aproximadamente una hora. Después de que los alimentos estén sólidos, retire los tubos del vaso de precipitados con un movimiento de rotación para que los alimentos no se peguen al fondo del vaso de precipitados. A continuación, retire la banda elástica.

Selle el extremo con comida usando cera. Para eso, primero, limpie cuidadosamente el tubo con una toalla de papel. A continuación, presione el tubo contra la cera.

Compruebe visualmente la calidad del precinto y, si es necesario, repita el precinto de nuevo. Con esta técnica, selle todos los tubos para el experimento. El otro extremo de los tubos se cierra con el algodón.

El algodón dejará pasar el aire mientras mantiene a las moscas encerradas dentro de los tubos. También es fácil de quitar y volver a colocar, lo que será útil cuando carguemos los tubos con las moscas para el experimento. Ahora, después de que los tubos estén listos, cárguelos con moscas para el experimento.

Para eso, descargue las moscas en la plataforma con CO2. Luego, con un cepillo, coloque con cuidado una mosca en cada tubo individual. Coloque el tubo con la mosca en el monitor.

En el mismo orden que en el monitor, el sistema de monitores registrará la locomoción de la mosca en el archivo de salida. Conecte el monitor a la computadora y colóquelo en una incubadora que mantenga la temperatura y la humedad constantes. Basándose en el experimento, establezca las condiciones de luz/oscuridad adecuadas.

Para el experimento de luz/oscuridad, mantenga las moscas en un ciclo de luz-oscuridad durante todo el experimento. No utilice el primer día de mediciones en el análisis. Para el experimento de oscuridad constante, primero, mantenga las moscas durante dos días en condiciones de luz / oscuridad para el arrastre y la sincronización de los relojes, y luego cambie a oscuridad constante.

No utilice mediciones del primer día de oscuridad constante en el análisis. Antes de pasar a la siguiente sección, recomendamos leer el protocolo. El sistema de monitor generará un único archivo que contiene la actividad de todas las moscas en el monitor.

Las últimas 32 columnas del archivo de salida contienen la actividad de las moscas individuales. Nuestro programa trabaja con actividades de una sola mosca. Por lo tanto, divida el archivo de salida en varios archivos de actividad de mosca única.

Cada archivo debe ser un archivo TXT de una sola columna. Ahora, después de preparar los archivos de actividad, podemos ejecutar nuestro análisis. Ejecute la función ModelFitPS3 en la ventana de comandos de MATLAB con los siguientes parámetros de entrada.

Frecuencia de muestreo, coloque el intervalo de tiempo de muestra de datos en segundos. Por ejemplo, nuestros datos se tomaron con una frecuencia de muestreo de 20 segundos. Por lo tanto, ponemos 20 aquí.

Como intervalo de bin, coloque el intervalo de tiempo en minutos, al que se agruparán los datos para una mejor visualización. Recomendamos agrupar a 20 o 30 minutos, pero, por ahora, pondré 10 aquí, solo para mostrarles más adelante cómo se puede cambiar fácilmente. Para la tendencia, coloque uno si los datos muestran la tendencia de referencia y cero en caso contrario.

Nuestros datos no tienen ninguna tendencia de referencia. Por lo tanto, pongo cero aquí. Pulse Intro para ejecutar la función.

En la ventana emergente, seleccione el archivo de actividad de una sola mosca y presione Abrir. El programa calculará y trazará el espectro de potencia de datos. En esta ventana, determine el período principal de los datos.

Para ello, haga clic con el botón izquierdo del ratón en el pico del período circadiano o con el botón derecho del ratón en el pico del segundo armónico, replicado aproximadamente en el período circadiano dividido por dos. En nuestro caso, el pico en el segundo armónico es mucho más grande y agudo que el pico en el período circadiano. Por lo tanto, utilizamos la segunda opción.

A continuación, el programa trazará los datos agrupados en el intervalo de agrupación seleccionado. Como puede ver, en un intervalo de 10 minutos, los picos de la mañana y la tarde no se visualizan muy bien. Por lo tanto, queremos cambiar este valor.

Para ello, basta con hacer clic con el botón derecho del ratón en cualquier parte del gráfico. En el nuevo cuadro de diálogo, escriba el nuevo valor para el intervalo de ubicación. Se recomienda agrupar en bins a un intervalo de tiempo de 20 minutos.

Por lo tanto, ponemos 20 aquí. Presione Aceptar. El programa vuelve a dibujar inmediatamente los datos con el nuevo valor del intervalo de ubicación. Para aceptar este valor, simplemente haga clic con el botón izquierdo en cualquier parte del gráfico.

El programa ahora volverá a dibujar los datos y mostrará solo cinco días de medición. En esta ventana, seleccione el primer pico de la mañana que se utilizará en el análisis. A veces es necesario saltarse primero uno o dos días, lo que tarda la mosca en adaptarse al ciclo de luz-oscuridad.

Para seleccionar el pico de la mañana, simplemente haga clic en el pico preferido. El programa volverá a dibujar los datos y ahora mostrará solo tres días de mediciones a partir del pico matutino seleccionado. Las líneas verticales azules y rojas muestran el primer pico de la tarde y el segundo pico de la mañana en función del período seleccionado en la primera ventana.

En esta ventana, seleccione el punto utilizado por el tubo para el ajuste preliminar de los datos con la función de modelo. Para eso, haga clic en los siguientes puntos en este orden en particular. Primero, haga clic en la parte superior del primer pico de la mañana.

El clic se indica con la estrella roja en la parte inferior, que muestra la ubicación del clic. Luego haga clic en el final del pico de la mañana, luego en el inicio del pico de la tarde, luego en la parte superior del pico de la tarde, luego en el final del pico de la tarde y finalmente en la parte superior del pico de la mañana del día siguiente. El programa volverá a trazar el espectro de potencia, ya que los parámetros finales se obtienen a partir del ajuste espectral.

El espectro ahora se traza como frecuencia en el eje x, y el pico circadiano se encuentra en el lado izquierdo de la gráfica. El período determinado en el primer paso se muestra con una línea vertical roja. Para seleccionar los puntos de ajuste, primero determine aproximadamente el período primario.

Para eso, haga clic con el botón izquierdo en el pico en el período circadiano o haga clic con el botón derecho en el pico en el segundo armónico. Volveremos a utilizar la segunda opción. Después de eso, aparecerá un control deslizante en la parte inferior para seleccionar los puntos para el ajuste espectral.

Los puntos se mostrarán con círculos rojos y aparecerán después de mover el control deslizante. Mueva el control deslizante hacia la izquierda y hacia la derecha, y coloque los puntos lo más cerca posible de la parte superior de los picos espectrales. Una vez obtenida la mejor imagen, pulse el botón Aceptar y el programa ajustará los puntos seleccionados con la expresión analítica para el espectro de potencia del modelo.

Después del ajuste, el programa generará dos gráficos más. Primero hay un espectro de potencia del modelo construido con los parámetros extraídos. En segundo lugar, están los datos ajustados con el modelo.

Los datos se muestran con una línea negra y el modelo se muestra con una línea roja. Se puede ver que la función se parece mucho a los datos, especialmente los últimos tres días de actividad. Los parámetros extraídos se guardan en el archivo TXT de parámetros de ajuste del modelo.

Después del nombre del archivo, los parámetros se guardan en el siguiente orden, primero b de decaimiento matutino, luego b de ascenso matutino, b de aumento vespertino, b de decaimiento vespertino, período circadiano, luego ancho del pico matutino dividido por el período circadiano, ancho del pico vespertino dividido por el período circadiano, altura del pico matutino, altura del pico vespertino, y el error de ajuste del ajuste espectral. Además del archivo de parámetros de ajuste del modelo, el programa también generará dos archivos más. En primer lugar, está el ajuste de los datos con la función del modelo y, en segundo lugar, está el ajuste espectral.

Realice este análisis con otros archivos de actividad. Todos los parámetros extraídos se guardan en el archivo TXT de parámetros de ajuste del modelo y se pueden utilizar para conectar la salida del comportamiento a los mecanismos subyacentes que regulan el comportamiento diario de la mosca controlado por el patrón de actividad del modelo.