Name: Medición cuantitativa de la respuesta inmune y del sueño en Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 16 s
Description: Aprende a medir la respuesta inmune y el sueño en Drosophila mediante registro de actividad locomotora, ensayos de supervivencia y detección de NFκB con luciferasa. Este método permite estudiar la conexión molecular entre inmunidad y comportamiento.

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Este trabajo fue financiado por la National Science Foundation bajo la subvención # IOS-1025627 y por los Institutos Nacionales de Salud, bajo la concesión # 1R21NS078582-01 a MORDAZA

Este protocolo utiliza dos configuraciones (Figura 1) para adquirir cuatro lecturas de datos distintas de las moscas recogidas sometidos a una infección bacteriana. Estos productos incluyen: 1) sueño / vigilia comportamiento, 2) los resultados de supervivencia, y 3) la carga bacteriana en la mosca, y 4) medición en tiempo real de la actividad de reportero NFkB en vivo. En combinación con las herramientas genéticas que están disponibles en Drosophila, estas mediciones proporcionan información mecanicista en el enlace molecular entre la función inmune y el comportamiento. 1. Medida de la actividad locomotora y del sueño en moscas <ol><li> La configuración utilizada para medir la actividad locomotora y dormir en moscas, que incluye la actividad de Drosophila sistema de supervisión (DAM2, Trikinetics), incubadoras, oscuro, y la preparación de los animales experimentales y los tubos de la actividad, se ha descrito previamente 6. El mismo enfoque se usa aquí, con algunas modificaciones menores. <ol class="lalpha"><li&gt; La iluminación de la incubadora está controlado por la propia incubadora. Por lo tanto, es importante sincronizar el ajuste de tiempo entre ordenador y las incubadoras. </li><li> Actividad tubos se limpian para su reutilización por ebullición en una placa caliente en agua desionizada. Una pequeña cantidad de detergente es añadido para la ebullición primero, los tubos se enjuagan bien y se hirvió dos veces más. Si el hilo se utiliza para conectar el tubo, los tubos utilizados actividad (que contiene los alimentos, de cera, y los hilados de mosca) se puede limpiar sin eliminación previa del hilo. </li></ol></li><li> Antes de iniciar un experimento, culturas lugar que contengan tarde pupal etapas moscas en incubadoras durante tres a cuatro días para adaptarse a la iluminación experimental y otras condiciones ambientales. Luz: condiciones de oscuridad constante o se han usado comúnmente para medir el comportamiento del sueño. En este ejemplo, las moscas se aclimataron a la luz constante para eliminar la influencia del reloj circadiano en la respuesta inmune y el comportamiento 2,7,8. Como se describe en la Figura 1A </strong&gt;, moscas de carga 1-4 días de edad en la actividad Trikinetics DAM2 monitores como se describió 6, y registro para un mínimo de tres días antes de la infección. </li></ol> 2. Infect moscas con una cepa patógena de las bacterias <ol><li> El protocolo aquí descrito es específico para S. marcescens, que son fáciles de cultivar y mantener. Protocolos para el almacenamiento a largo plazo y condiciones de cultivo para otras especies bacterianas pueden variar. S. marcescens se almacenan en 15-50% de glicerol a -80 ° C. Para prepararse para almacenamiento a largo plazo, mezclar 2 volúmenes de cultivo bacteriano durante la noche (OD 600 = 0,5 - 1,0) a 1 volumen de glicerol esterilizado en autoclave 50% en tubos de 1,5 ml de microcentrífuga. Esto dará lugar a una concentración final de glicerol de 17%. Almacene los tubos a -80 ° C. Para preparar un corto plazo en el uso de código de bacterias, raspar el stock congelado con una punta de pipeta estéril 200 l y realizar una serie de tres vías en una placa de agar LB. Incubar la placa durante la noche a 37 &amp; dpor ejemplo, C para obtener colonias aisladas. Guarde la placa a 4 ° C. Un día antes de la infección programada, recoger una única colonia de la placa de agar LB con una punta de pipeta estéril 200 l y sumergir la punta en un tubo de cultivo que contiene 5 ml de medio LB. Crecer las bacterias durante la noche, o hasta 16 horas en el interior de un agitador incubador a 37 ° C y 250 rpm hasta que se alcanza la fase de crecimiento exponencial. Medir la concentración con un espectrofotómetro a OD 600. La concentración de esta fase varía de 0,5 a 1. Si la concentración es demasiado alta, subcultivar las bacterias y crecer durante otras varias horas para conseguir una concentración óptima. Lleve a cabo el procedimiento cerca de una fuente de llama. Algunas cepas bacterianas están diseñados para resistencia a los antibióticos y se cultivan y se seleccionan para antibiótico apropiado añadir al medio. S. marcescens (ATCC # 8100) no son resistentes a los antibióticos y por lo tanto se desarrollaron en medio estéril sin antibiótico. Para verificar una técnica estéril, hacer un simulacro de culsin volver a bacterias como un control. La solución para infectar las moscas contiene bacterias (diluido a OD 600 = 0,1) y 1% de colorantes de alimentos (Azul Brillante FCF) en PBS. Preparar una solución de control de la inyección mediante la adición de una cantidad equivalente de medio LB utiliza en solución infección y 1% colorante azul en PBS. Store Solutions en hielo. </li><li> Preparar agujas de vidrio para la inyección de las moscas. Tire capilares de vidrio (OD = 1 mm, id = 0,58 mm, WPI) a una punta fina usando un extractor de micropipeta (Narishige). Bajo un microscopio de disección, utilizar unas pinzas finas para romper la punta de la aguja para que la abertura sea suficientemente grande para llenar con fluido de inyección a una aspiración mediante una jeringa, pero lo suficientemente pequeño para minimizar el daño a la marcha durante el proceso de inyección. Después de romper la punta, el tamaño de la punta debe estar alrededor de 40-50 micras. La aguja de vidrio está unido a una jeringa de plástico de 3 cc con una longitud de tubería. El flujo de medio de inyección se controla manualmente aplicando presión positiva o succión con la jeringa. Evitar la contaminación del tubo de goma con inyección de fluido, como el aparato de jeringuilla se utiliza tanto para la infección y las inyecciones de control. </li><li> Anestesie moscas poniéndolos en una plataforma de CO 2. CO 2 se pasa a través de un recipiente sellado de agua para humidificar la almohadilla y para reducir la electricidad estática, lo que puede complicar la manipulación de las moscas en la almohadilla. Inyectar moscas por meter la aguja de vidrio en la región por encima del escutelo del tórax dorsal. El paso del medio de inyección en la marcha se verifica por el colorante de alimentos - las moscas se vuelven azules como los spreads de alimentos para colorear través del sistema. La dosis de bacterias que reciben las moscas se pueden cuantificar como se describe en la Sección 3, a continuación. Algunos diseños experimentales incluyen un grupo de control que recibe lesión aséptico mediante la inyección de moscas con el colorante PBS y comida, pero sin bacterias. </li></ol> 3. Determinar la carga bacteriana Un enfoque para evaluating de la respuesta inmune contra la infección bacteriana es determinar la infección después de la carga bacteriana. D. melanogaster es un gran modelo para determinar este parámetro porque la marcha todo se puede homogeneizar para estimar el número total de bacterias en un individuo. La lógica detrás de este protocolo es que cuando se cultivan en un medio sólido tal como caldo de Luria (LB) agar en una placa de Petri (placa de LB), una sola bacteria forma una colonia visible distinguible. Por lo tanto, por homogeneización de las moscas infectadas en medio LB líquido, generando diluciones en serie del homogeneizado, y la difusión del homogeneizado diluido en placas LB, el número de células bacterianas que infectan una mosca se puede determinar. Un grupo de control de moscas inyectadas con PBS y colorante de alimentos, pero sin las bacterias deben ser utilizados para verificar que la infección no estaba contaminado con otras especies bacterianas. No debe haber colonias en la placa de agar LB en esta condición. <ol><li> Autoclave todos los materiales que se utilizarán para esteprocedimiento antes de realizar la etapa de homogeneización real. Esto incluye 200 puntas de pipeta mu l cortar con tijeras, medio LB, y morteros usados ​​para la homogeneización. Preparar placas por vertido autoclave LB / agar en platos de 10 cm de Petri estériles al menos 1 día antes de homogeneizar las moscas. </li><li> Anestesiar y colectar las moscas en tubos de microcentrífuga 1,5 ml y tubos Almacenar en hielo. </li><li> Lleve a cabo la homogeneización cerca de una llama para evitar la contaminación. Una homogeneización de control que contiene las moscas sin infección se recomienda especialmente cuando se utiliza una cepa bacteriana, tal como S. marcescens, que no son resistentes a los antibióticos. Homogeneizar un mínimo de 2 grupos de 10 moscas por cada condición experimental. El número de moscas utilizadas por homogeneizado se determina por el experimentador. Algunos grupos han utilizado una mosca por homogeneizado, que es útil para la evaluación de la variación en la carga bacteriana entre las moscas individuales 8, mientras que otros han usado 3 a 10 moscas por homogeneizadohacer comparaciones entre genotipo o condición experimental 9-12. <ol class="lalpha"><li> Añadir 400 l de medio LB a cada tubo de microcentrífuga que contiene moscas y homogeneizar utilizando un motor pequeño y mano de mortero (Kontes). </li><li> Utilizando puntas de pipeta esterilizadas cortadas, serial diluir la 1:10 homogeneizado mediante la adición de 20 l LB homogeneizada / medio bacteriano a 1,5 tubo de microcentrífuga que contiene 180 l de medio LB l. Cortar las puntas de pipeta evita el bloqueo de los desechos volantes y asegura que un volumen apropiado está siendo transferido. </li><li> Factor de dilución se determina empíricamente y depende del genotipo de la mosca, la cepa bacteriana utilizada, y las condiciones experimentales. Para el tipo salvaje moscas infectadas con S. marcescens, utilizar diluciones de 1:10 2 o 1:10 3 para moscas homogeneizadas inmediatamente después de la infección, y las diluciones de 1:10 o 1:10 4 5 para moscas de la homogeneizaron 24 horas después de la infección. </li><li> Añadir 100 l de LB / media bacteriana del micrófonorocentrifuge tubos que contienen la dilución final y se extendió el medio en una placa de LB con bolas de vidrio (VWR) para asegurar una distribución uniforme. </li><li> Deseche las bolas de vidrio en 100% de solución de EtOH. Colocar las placas de LB en una incubadora a 37 ° C durante la noche. </li><li> Como un paso opcional, utilizar un sistema de formación de imágenes con luz visual para obtener una imagen de las placas LB (FluorChem 8900; Alpha Innotech). Contar el número de colonias ya sea en la propia placa o de la imagen de la placa utilizando la herramienta de recuento en el software Photoshop (Adobe Photoshop CS3). </li><li> Calcular el número de unidades formadoras de colonias por mosca usando la fórmula: [N / (N * D * v)] * V, donde n = número de colonias crecidas en la placa de LB, N = el número de las moscas agrupado en uno tubo de microcentrífuga, D = factor de dilución, y v = volumen de la solución se extendió sobre cada placa; V = volumen inicial del homogeneizado. </li></ol></li></ol> 4. Evaluar sueño y duración de la supervivencia después de la infección <ol><li> Paramoscas que no se cosechan para medir la carga bacteriana, continuar el monitoreo del comportamiento durante otros 7-10 días. Duración de la supervivencia se ve influida por el genotipo de las condiciones ambientales de ventanas, y las especies bacterianas utilizado para la infección. </li><li> Después de ~ 10 días, dar por terminado el experimento, descargar y procesar los datos de comportamiento como se describió previamente 6. Insomniac2 software a medida, que se basa en Matlab, se utiliza para analizar los parámetros del sueño. Es importante eliminar las moscas muertas del análisis de comportamiento. Normalmente, esto restringe el análisis a dentro del primer día después de la infección, dependiendo del tipo de infección y el genotipo mosca. Muerte en el ensayo se indica por el tiempo todos los recuentos de actividad han llegado a cero. Para facilitar el análisis de la supervivencia, Drosonex, software personalizado escrito en Microsoft Visual C + + 6.0, se utiliza para procesar archivos de datos brutos del sistema DAM Trikinetics. Los informes de software como archivos de Excel, la duración de supervivencia de cada vuelo (en horas), recoge la actividad de datuna desde todos los monitores en una sola hoja de cálculo, y notifica el porcentaje de moscas supervivientes con el tiempo establecido por el usuario. Los archivos de Excel están diseñadas para integrarse en otros paquetes de software estadístico para su posterior análisis. </li></ol> 5. Medir la actividad de NF-kB durante la infección utilizando un ensayo luciferase reportero Transgenic kappa B-luc moscas utilizadas en este ensayo se generaron como se describe anteriormente en Kuo et al., 2010 2. Brevemente, el reportero kappa B-luc contiene 8 repeticiones de una secuencia de unión a NF-kB que se insertaron en un promotor aguas arriba de un marco de lectura abierto de luciferasa. <ol><li> Ajuste las moscas a las condiciones de luz experimentales que se describen en la sección 1.2. En este ejemplo, 1-4 días de edad * B-luc moscas están alojadas en viales que contienen una solución de sacarosa al 5%, el 2% a medio agar alimento y se coloca en luz constante (LL) durante 2 días para llegar a la misma edad de otras moscas durante la infección. </li><li> Preparar una microplaca de 96 pocillos para las moscas. Cada pocillo contiene 2 capas de medio de alimentación (Figura 2), la capa superior contiene luciferina, el sustrato de la luciferasa. Añadir 300 l de un 5% de sacarosa, 2% de solución de agar a cada pocillo y dejar que se solidifique. A continuación, añadir una capa superior 50 l a cada pocillo que contenía sacarosa al 5%, 1% de agar, y 2 mM de luciferina (Gold Biotechnology, Inc.). Concentraciones luciferina utilizadas para la actividad del indicador de medida en Drosophila han variado en la literatura, y han sido tan baja como 100 mM 13. La concentración necesaria puede ser determinada empíricamente. Entre las capas de distribución de alimentos, cubrir la placa con un paño de malla fina para facilitar el secado, mientras que se mantiene la esterilidad. La placa deberá dejarse secar por completo, hasta una hora, con el fin de evitar que las moscas se queda pegada en gotas de condensación. Porque luciferina es sensible a la luz, evite exponer las placas a la luz más de lo necesario. </li><li> Aplique una capa adhesiva transparente (Top-Seal-A; Perkin Elmer) a una placa de 96 pocillos de microplaca y perforar con una aguja fina en una cantidad de 2 agujeros por pocillo. Estos orificios no sólo permite el intercambio de aire a cada pocillo, sino que también proporcionan una forma para anestesiar moscas sobre una base individual. Uso de una hoja afilada y el borde recto, introducir un corte entre cada columna. Esto proporcionará una forma fácil de cargar / descargar las moscas en grupos de 8 a la vez. Para cargar las moscas a la microplaca, retirar los viales del incubador y moscas anestesiar a un CO 2 pad. Carga vuela uno por uno a cada pocillo columna por columna. Si una mosca sin darse cuenta se bloquea al sello adhesivo, deje volar solo, ya que a menudo son capaces de liberarse sin intervención. Devuelva la microplaca a la incubadora en LL durante 8-24 horas para adaptarse al nuevo entorno y para consumir el sustrato luciferina. </li><li> Bacterias Cultura, S. marcescens, y preparar una solución para la infección como se describió anteriormente. </li><li> Anestesiar tvuela con una punta de micropipeta unido a una baja presión de CO 2 líneas. Colocar la punta de la micropipeta directamente encima de los agujeros de ventilación realizados para cada pocillo. Tenga cuidado para asegurar que el CO 2 la presión es lo suficientemente alta para anestesiar a la mosca, pero suficientemente baja para evitar daños a la mosca. En grupos de ocho, individualmente transferir cada mosca a un CO 2 pad, e infectar a como se ha descrito anteriormente. Después de la infección, volveos cada una mosca a su estado original y ciérrelo bien la microplaca. </li><li> Luminiscencia medida (TopCount NXT-luminiscencia y contador de centelleo; Perkin-Elmer). El contador de luminiscencia TopCount contiene un casete de apilamiento de las placas, lo que permite lecturas programadas y automatizado continuamente en incrementos deseados para cualquier periodo de tiempo (normalmente de hasta cinco días). Esta característica no está disponible en todos los instrumentos, y la recogida de datos para los experimentos realizados con otros instrumentos por lo tanto puede ser menos frecuente. El contador de luminiscencia se encuentra en un room con una temperatura controlada y programa de iluminación. Coloque los platos en la bandeja de apilamiento, apilar las placas que contienen las moscas claras entre las placas en blanco para que las moscas de recibir la luz. Programa del luminómetro de acuerdo con las especificaciones del fabricante para recoger lecturas cada hora durante un mínimo de 24 horas. En este ejemplo, los detectores están programados para leer cada pocillo durante 10 seg y se expresa el resultado como recuentos (unidades arbitrarias) por segundo. Este valor es un promedio entre 3 lecturas por pocillo. Exportar los archivos de datos a una hoja de cálculo y realizar un análisis estándar, graficando los resultados de luminiscencia. </li></ol>

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<li>Zimmerman, J. E., Raizen, D. M., Maycock, M. H., Maislin, G., Pack, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+video+method+to+study+Drosophila+sleep%5BTitle%5D)+AND+%22Sleep%22%5BJournal%5D)">A video method to study Drosophila sleep.</a> Sleep. 31, 1587-1598 (2008).</li>
<li>Toth, L. A., Rehg, J. E., Webster, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain+differences+in+sleep+and+other+pathophysiological+sequelae+of+influenza+virus+infection+in+naive+and+immunized+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Strain differences in sleep and other pathophysiological sequelae of influenza virus infection in naive and immunized mice.</a> J. Neuroimmunol. 58, 89-99 (1995).</li>
<li>Hendricks, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rest+in+Drosophila+is+a+sleep-like+state%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Rest in Drosophila is a sleep-like state.</a> Neuron. 25, 129-138 (2000).</li>
<li>Wu, M. N., Koh, K., Yue, Z., Joiner, W. J., Sehgal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screen+for+sleep+and+circadian+mutants+reveals+mechanisms+underlying+regulation+of+sleep+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Sleep%22%5BJournal%5D)">A genetic screen for sleep and circadian mutants reveals mechanisms underlying regulation of sleep in Drosophila.</a> Sleep. 31, 465-472 (2008).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Este protocolo describe un enfoque para investigar cómo el comportamiento, particularmente dormir, está vinculado a los parámetros de la respuesta inmune. Estos parámetros incluyen la carga bacteriana, los resultados de supervivencia, y la actividad de NF-kB, medido por un indicador de luciferasa in vivo. En conjunto, estos parámetros proporcionan información sobre la capacidad de una mosca puede luchar contra una infección. La carga bacteriana y los resultados de supervivencia son parámetros de la respuesta in...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del Material </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Equipo </td></tr><tr><td> Incubadoras </td><td> Percival Scientific, Inc. </td><td> I30BLLC8 I36VLC8 </td><td> Cualquier incubadora capaz de ejecutar luz programada / horarios de la temperatura es la adecuada. </td></tr><tr><td> Drosophila Activitiy Monitores </td><td> Trikinetics Inc., Waltham, MA </td><td> DAM2 </td><td> Como se describe en otra parte 6, este sistema requiere una interfaz de computadora, software, y otros accesorios. </td></tr><tr><td> Pyrex de vidrio Tubos </td><td> Trikinetics Inc., Waltham, MA </td><td> PGT-5x65 </td><td></td></tr><tr><td> Microplacas de centelleo y contador de luminiscencia </td><td>Perkin Elmer </td><td> TopCount NXT 12 detector </td><td> Cualquier lector de microplacas capaz de detectar la luminiscencia puede usarse para este tipo de ensayo reportero. TopCount contiene múltiples detectores y una apiladora automática, sino que es capaz de ser programado para leer continuamente de placas múltiples. </td></tr><tr><td> FluorChem 8900 </td><td> Alpha INNOTECH </td><td></td><td> Imágenes de cultivos bacterianos es opcional, cualquier sistema de imagen digital con capacidad de luz visual es suficiente. </td></tr><tr><td> Micropipetas Puller </td><td> Tritech Research, Inc. </td><td> Narishige PC-10 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Suministros </td></tr><tr><td> Vidrio borosilicato capilares </td><td> World Precision Instrument Inc. </td><td> 1B100F-4 </td><td></td></tr><tr><td> 3 ml Jeringa </td><td> Fisher Scientific </td><td> BD 305482 </td><td></td></tr><tr><td> Las agujas de jeringa </td><td> Fisher Scientific </td><td> BD 305196 </td><td> 18 G - cortar la punta de la aguja para evitar daños a la tubería. </td></tr><tr><td> Tubo de silicona, id (0,030 &quot;) de diámetro externo (0,065&quot;) Espesor de la pared (0,018 &quot;) </td><td> VWR </td><td> 60985-706 </td><td> Usa para conectar las agujas capilares de vidrio a una jeringa </td></tr><tr><td> Llave de paso de 3 vías </td><td> Sociedad Americana Pharmaseal </td><td> K75 </td><td></td></tr><tr><td> Kontes Pellet Pestle Motor inalámbrico </td><td> Fisher Scientific </td><td> K749540-0000 </td><td></td></tr><tr><td> Kontes Pellet Pestle </td><td> Fisher Scientific </td><td> K749521-1590 </td><td></td></tr><tr><td> Bolas de cristal de 3 mm </td><td> VWR </td><td> 26396-630 </td><td></td></tr><tr><td> Microplacas Microlite 1 + </td><td> Thermo Scientific </td><td> 7571 </td><td> Select 96-y placas que son apropiados para la luminiscencia - que deben ser opacas. </td></tr><tr><td> TopSeal-A Microplacas :96-así </td><td> PerkinElmer </td><td> 6005185 </td><td> Microplaca Press-On Film adhesivo de sellado </td></tr><tr><td> D-luciferina, sal de potasio </td><td> BioTechnology Gold, Inc. </td><td> Lucna </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Software </td></tr><tr><td> Insomniac2 </td><td> Disponible a petición de los autores </td><td> costumbre, escrito por Lesley Ashmore, Ph.D. (Westminster College) </td><td> Matlab basado en software que se ha utilizado rutinariamente para el análisis de sueño 2,6,11 </td></tr><tr><td> Drosonex </td><td> Disponible a petición de los autores </td><td> costumbre, escrito por Thomas Coradetti (Software acera) </td><td> Un PC MSVC6 programa utilizado para el análisis de supervivencia de los archivos de datos brutos recogidos con elTrikinetics sistema </td></tr><tr><td> Photoshop CS3 </td><td> Adobe </td><td></td><td> Útil para obtener el número de ufc / placa a partir de imágenes digitales (opcional) </td></tr></tbody></table>

medición cuantitativa de la respuesta inmune y del sueño en<em&gt; drosophila</em

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

Una compleja interacción entre la respuesta inmunitaria y el comportamiento del sistema se ha descrito en una amplia gama de especies. Exceso de sueño, en particular, se sabe que ocurre como respuesta a la infección en mamíferos 1 y también ha sido descrito recientemente en Drosophila melanogaster 2. En general se acepta que el sueño es beneficiosa para el huésped durante una infección y que es importante para el mantenimiento de un sistema inmune robusto 3,4. Sin embargo, la evidencia experimental que apoya esta hipótesis es limitada 4, y la función de exceso de sueño durante una respuesta inmune sigue siendo poco clara. Hemos utilizado un enfoque multidisciplinario para abordar este complejo problema, y se han llevado a cabo estudios en el sistema modelo genético simple, la mosca de la fruta Drosophila melanogaster. Nosotros utilizamos un ensayo estándar para medir el comportamiento locomotor y el sueño en las moscas, y demostrar cómo este ensayo se utiliza para medir el comportamiento en las moscas infected con una cepa patógena de las bacterias. Este ensayo también es útil para controlar la duración de la supervivencia de las moscas individuales durante una infección. Medidas adicionales de la función inmune incluyen la habilidad de las moscas para eliminar una infección y la activación de NF-kB, un factor de transcripción clave que es central en la respuesta inmune innata en Drosophila. Tanto los resultados de supervivencia y el aclaramiento de bacterias durante la infección juntos son indicadores de la resistencia y la tolerancia a la infección. Resistencia se refiere a la habilidad de las moscas para eliminar una infección, mientras que la tolerancia se define como la capacidad del huésped para limitar los daños de una infección y por lo tanto sobrevivir a pesar de los altos niveles de patógenos en el sistema 5. Monitoreo en tiempo real de la actividad de NF-kB durante la infección da una idea de un mecanismo molecular de la supervivencia durante la infección. El uso de Drosophila en estos ensayos sencillos facilita los análisis genéticos y moleculares de sueñoy la respuesta inmune y cómo estos dos sistemas complejos están recíprocamente influenciados.

<ol><li> La infección favorece el sueño. En este ejemplo, Canton-S (CS) moscas de tipo salvaje y las moscas mutantes que carecen de un gen NF-kB, Relish (Rel E20) 14, se cargaron en dos DAM2 monitores de actividad (n = 32 para cada genotipo) y se infectaron como se describió anteriormente. Las moscas se mantuvieron en luz constante para eliminar la influencia del reloj circadiano en el comportamiento y la infección 2,7,8. Los mutantes E20 Rel se isogenized a CS como se ha descrito prev...

Para comprender un enlace entre la respuesta inmunitaria y el comportamiento, se describe un método para medir el comportamiento locomotor en<em&gt; Drosophila</em&gt; Durante la infección bacteriana, así como la habilidad de las moscas para montar una respuesta inmune por la supervivencia de seguimiento, la carga bacteriana, y en tiempo real de la actividad de un regulador clave de la inmunidad innata, NFkB.

Medición cuantitativa de la respuesta inmune y del sueño en<em&gt; Drosophila</em

Se ha descrito una interacción compleja entre la respuesta inmunitaria y el comportamiento del huésped en una amplia gama de especies. Se sabe que el sueño excesivo, en particular...

El objetivo general del siguiente experimento es evaluar el sueño y la función inmunitaria en drosófila. Primero, esto se logra registrando la actividad locomotora de moscas infectadas para medir el sueño y la supervivencia; en un segundo paso, tras la infección, las moscas se homogenizan, diluyen y siembran en placas de agar LB. El número de unidades formadoras de colonias que crecen indica la capacidad de las moscas para eliminar la infección.A continuación, se añaden moscas infectadas que expresan un transgén que contiene el reportero de luciferasa NF kappa b a una placa de 96 pocillos que contiene luciferina, el sustrato de la luciferasa. La medición en tiempo real de la luciferasa kappa b indica la activación de una vía de señalización NF kappa B durante la infección, junto con el resultado de supervivencia y sueño. La eliminación bacteriana y la actividad del reportero NF KB son mediciones que proporcionan una perspectiva mecanicista sobre el vínculo molecular entre la función inmunitaria y el comportamiento. Generalmente, las personas nuevas en este método tienen dificultades porque se requiere tiempo y práctica para aprender a infectar manualmente las moscas de forma consis

quantitative-measurement-immune-response-sleep

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Se describen los procedimientos para el registro diario de los ritmos de actividad...

Ensayo Actividad locomotora para el Estudio de los ritmos circadianos y del sueño en los parámetros Drosophila</em

En este video, demostramos una técnica para medir la carga bacteriana de E. coli después de inyectar E. coli en el tórax de Drosophila melanogaster.

Medición de la carga bacteriana de E. coli en Drosophila melanogaster después de una infección por E. coli

Aquí se describe un método para la medición rápida y exacta de funcionamiento de vuelo en Drosophila, lo que permite detección de alto rendimiento.

Un método mejorado para la rápida y precisa medición de rendimiento en vuelo<em&gt; Drosophila</em

Aquí, presentamos un protocolo para cuantificar la evitación de individuos estresados. Este paradigma es potente y fácil de usar y puede utilizarse para evaluar la influencia de los genes y el medio ambiente en un tipo de interacción social en Drosophila melanogaster.

Ensayo sencillo para cuantificación de Prevención Social en Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster es un organismo modelo excepcional para estudiar el sistema inmune innato y las consecuencias fisiológicas de la infección y la enfermedad. Este protocolo describe cómo administrar infecciones bacterianas robustas y cuantitativamente repetibles a D. melanogaster, y cómo medir posteriormente la gravedad de la infección y cuantificar la respuesta inmunitaria del huésped.

La infección bacteriana sistémica y Defensa Inmune fenotipos en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Este informe describe un método para medir la actividad de las larvas de Drosophila utilizando el Monitor de Actividad de Drosophila TriKinetics. El dispositivo emplea rayos infrarrojos para detectar los movimientos de hasta 16 animales individuales. Los datos se pueden analizar para representar los parámetros de movimiento, incluidas las tasas y las posiciones de los animales dentro de las cámaras de ensayo.

La medición de las larvas La actividad en el<em&gt; Drosophila</em&gt; Monitor de Actividad

Este protocolo describe métodos para exponer oralmente e infectar a la mosca de la fruta Drosophila melanogaster con bacterias patógenas y para medir el número de bacterias infecciosas caseta después de la infección intestinal. Además, describimos el efecto de mutantes inmunes mosca supervivencia después de la infección bacteriana oral.

Oral infección bacteriana y vertimiento en Drosophila melanogaster

Este protocolo describe un ensayo de fagocitosis in vivo en adultos de Drosophila melanogaster para cuantificar fagocito reconocimiento y liquidación de las infecciones microbianas.

Evaluar el Cellular la respuesta inmune de la mosca de la fruta, Drosophila melanogasterutilizando un ensayo de fagocitosis en Vivo

La privación del sueño es una herramienta poderosa para investigar la función y regulación del sueño. Describimos un protocolo para privar del sueño a Drosophila utilizando el Aparato Anulador del Sueño, y para determinar el alcance del sueño de rebote inducido por la privación.

El aparato anulador del sueño: un método altamente eficiente de privación del sueño a Drosophila

Se presenta un protocolo para el cribado de fármacos de alto rendimiento para mejorar el sueño mediante el seguimiento del comportamiento del sueño de las moscas de la fruta en un modelo de Drosophila de edad avanzada.

Detección de fármacos de moléculas pequeñas de alto rendimiento para trastornos del sueño relacionados con la edad con Drosophila melanogaster

Este protocolo proporciona un marco para evaluar los cambios conductuales inducidos por el estrés en Drosophila melanogaster. Combinar ensayos complementarios permite cuantificar la actividad, la exploración y la toma de decisiones para moscas individuales. El enfoque es flexible y puede adaptarse a una amplia gama de estudios que investiguen la biología del estrés, el metabolismo y la función neuroconductual.

Fenotipado conductual multimodal de estados depresivos inducidos por el estrés en Drosophila melanogaster

Aprende a medir la respuesta inmune y el sueño en Drosophila mediante registro de actividad locomotora, ensayos de supervivencia y detección de NFκB con luciferasa. Este método permite estudiar la conexión molecular entre inmunidad y comportamiento.

Medición cuantitativa de la respuesta inmune y del sueño en

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