Medición cuantitativa de la respuesta inmune y del sueño en Drosophila

El objetivo general del siguiente experimento es evaluar el sueño y la función inmune en drosophila. Esto se logra primero mediante el registro de la actividad locomotora de las moscas infectadas para medir el sueño y la supervivencia como un segundo paso después de que las moscas infectadas se homogeneizan, diluyen y se propagan en placas de agar LB. El número de unidades formadoras de colonias que crecen indica la capacidad de las moscas para eliminar la infección.

A continuación, las moscas infectadas que expresan un transgén que contiene el reportero de luciferasa NF kappa b se añaden a una placa de 96 pocillos que contiene luciferina, el sustrato de la luciferasa. La medición en tiempo real de la luciferasa kappa b indica la activación de una vía de señalización NF kappa B durante la infección en general y el resultado de supervivencia del sueño. El aclaramiento bacteriano y la actividad reportera de NF KB son mediciones que proporcionan información mecanicista sobre el vínculo molecular entre la función inmunitaria y el comportamiento.

Por lo general, las personas nuevas en este método tienen dificultades porque se necesita tiempo y práctica para aprender a infectar moscas manualmente con consistencia. La principal ventaja de la técnica reportada por Lucifer sobre los métodos existentes, como QPCR, es que la actividad de NF Kappa B se puede medir continuamente en tiempo real en vivo. Comience incubando cultivos de Drosophila en etapa de pupila tardía durante tres o cuatro días, para que los adultos se adapten a las condiciones ambientales.

Aquí, las moscas se colocan bajo luz constante para eliminar la influencia del reloj circadiano en la respuesta inmune y el comportamiento. A continuación, cargue moscas de uno a cuatro días de edad en la actividad. Los monitores registran su actividad durante un mínimo de tres días antes de la infección, un día antes de la infección programada.

Elija una sola colonia de SIA con una punta de pipeta estéril y sumerja la punta en un tubo de cultivo que contenga cinco mililitros de medio LB para verificar la técnica estéril. No olvide hacer un simulacro de cultivo de control sin bacterias. Cultive bacterias durante la noche hasta que alcancen la fase de crecimiento exponencial al día siguiente.

Mida la absorbancia del cultivo a 600 nanómetros. Incluye un segundo Q vet como un espacio en blanco. Está listo cuando la concentración está entre 0,5 a una unidad de absorbancia en el subcultivo, o extiende el tiempo de cultivo según sea necesario.

Ahora prepare la solución bacteriana para infectar a las moscas. Diluya las bacterias con PBS hasta una absorbancia esperada de 0,1 a 600 nanómetros. A continuación, añada colorante alimentario para el control de la inyección.

Reemplace las bacterias con medio LB. Guarde ambas soluciones en hielo. A continuación, con un microextractor de pipetas, haga agujas de inyección con una punta fina bajo un microscopio de disección.

Use pinzas finas para romper la punta de cada aguja de modo que la abertura sea lo suficientemente grande como para llenarla con líquido de inyección mediante succión, pero también lo suficientemente pequeña como para minimizar el daño a la mosca. Conecte una aguja de vidrio a una jeringa de plástico de tres cc con un trozo de tubo usando la jeringa. El caudal del medio de inyección se controla manualmente.

Evite contaminar el tubo de goma con líquido de inyección, ya que el aparato de jeringa se utiliza tanto para la inyección infecciosa como para la de control. Verifique el flujo del medio de inyección con el uso de un pañuelo de papel Kim wipe. Dos detalles críticos para el éxito de las inyecciones son el uso del tamaño óptimo de la aguja y el sellado seguro entre la aguja y la jeringa.

Una vez que el sistema de inyección esté completamente preparado, anestesiar las moscas con un flujo mínimo de dióxido de carbono, proceda rápidamente para que ninguna mosca esté anestesiada durante más de cinco minutos. Ahora inyecte moscas pinchando la aguja de vidrio en la región por encima del tellum oblicuo del tórax dorsal. El paso del medio de inyección a la mosca se verifica mediante el colorante alimentario, que se puede ver a medida que la solución inyectada se esparce.

Antes de comenzar, asegúrese de que todos los materiales utilizados para este procedimiento también hayan sido esterilizados en autoclave con al menos un día de anticipación. Prepare placas de Petri de 10 centímetros con medio agar LV. El día del experimento, anestesia y coloca moscas en tubos de centrífuga de 1,5 mililitros.

Prepare un mínimo de dos grupos de 10 moscas cada uno por condición experimental. También prepare un grupo de control de moscas sin infección, especialmente cuando se usa una cepa bacteriana sin resistencia a los antibióticos. Guarde todos los tubos cargados en hielo.

A continuación, agregue 400 microlitros de medio LB a cada tubo cargado con mosca. Homogeneice las moscas con una pequeña cáscara y hágalo cerca de una llama para evitar la contaminación. Ahora, utilizando las puntas de pipeta cortadas, diluya en serie el homogeneizado por factores de 10 en volúmenes de 200 microlitros.

Si el homogeneizado se hace inmediatamente después de la infección con sia, diluir hasta uno a 1000, pero durante 24 horas, homogeneizar después de la infección, hacer hasta uno a 100, 000. La siguiente semilla, las dos más grandes se diluyen en placas de 10 centímetros usando bolas de vidrio para asegurar una distribución uniforme, incube las placas durante la noche. Al día siguiente, cuente el número de colonias en el plato mediante observación directa o mediante un software de conteo de colonias.

A continuación, calcule el número de unidades formadoras de colonias por mosca. En este ensayo se utilizan moscas transgénicas portadoras del indicador de luciferasa kappa b en el momento adecuado. El ensayo también requiere bacterias cultivadas, como la SCIA, preparadas para la inyección, como se describe en la sección anterior.

Ajuste las moscas a las condiciones de iluminación experimentales. En este ejemplo, las moscas luciferasas kappa b de uno a cuatro días de edad se alojan en viales que contienen 5% de sacarosa, 2% de agar y se colocan en luz constante durante dos días. Ahora prepare una microplaca de 96 pocillos para las moscas.

Llene cada pozo con dos capas de comida. Primero en el medio, agregue 300 microlitros de solución de sacarosa al 5% y agar al 2%. Cubra bien la placa con un paño de malla fina y deje que la placa se seque completamente hasta por una hora.

A continuación, agregue una capa superior de 50 microlitros a cada pocillo que contenga 5% de sacarosa, 1% de agar y dos milimolares de Lucifer. Debido a que Lucifer es sensible a la luz, permita que el plato se seque en la oscuridad y en el futuro. Minimice la exposición a la luz de la placa.

Una vez que el agar se haya enfriado, cubra la placa con una película adhesiva transparente. Luego, con una aguja fina, perfore la película dos veces sobre cada pocillo. Estos orificios permiten el intercambio de aire y la anestesia gaseosa.

A continuación, para facilitar la carga de la mosca, utilice una cuchilla afilada y un borde recto para introducir un corte entre cada columna. Anestesiar las moscas con dióxido de carbono y cargarlas una a una en cada pozo columna por columna. En caso de que una mosca se quede pegada a la película, dale la oportunidad de liberarse antes de intervenir.

Regrese la placa de micropocillos a la incubadora bajo luz constante durante ocho a 24 horas. Para anestesiar las moscas bien atadas, utilice una punta de micropipeta conectada a una línea de dióxido de carbono a baja presión. Asegúrese de que el gas esté a una presión inofensivamente baja y coloque la punta de la micropipeta directamente encima de los orificios de ventilación para anestesiar una mosca en grupos de ocho individualmente.

Transfiera cada mosca a una almohadilla de CO2 e infórmelas con bacterias como antes. Luego, regrese cada mosca a su pocillo original y vuelva a sellar la microplaca. Mida la luminiscencia en cada mosca utilizando un luminómetro alojado en una habitación con temperatura controlada bajo un horario de iluminación definido.

Cargue las placas en el casete de apilamiento, asegurándose de apilar las placas que contienen las moscas entre placas en blanco transparentes. Programe el luminómetro de acuerdo con las especificaciones del fabricante y recopile lecturas cada hora durante un mínimo de 24 horas. En este ejemplo, los detectores están programados para leer cada pozo durante 10 segundos.

Una vez completado, exporte los archivos de datos a una hoja de cálculo y realice un análisis estándar graficando los resultados. Los datos de ejemplo se pueden analizar. Los descuentos por segundo promediaron tres lecturas por pozo.

El tipo salvaje de Cantón S vuela y disfruta. Las moscas mutantes E 20 que carecían del gen NF kappa B se cargaron en dos monitores de actividad con luz constante y se infectaron con sia. En este ejemplo, la infección promovió el sueño.

Estaba claro que los mutantes E 20 experimentaban menos sueño que las moscas de control de Canton después de la infección. De acuerdo con los hallazgos anteriores, los mutantes E 20 también sucumbieron rápidamente a la infección en comparación con las moscas de tipo salvaje.

La mayoría de las moscas sobrevivieron a la inyección de control aséptico, lo que indica que las moscas sucumbieron a la infección y no a la lesión debida a la inyección. Debido a que los mutantes de Gustly murieron tan rápidamente, solo se utilizaron moscas de Canton para demostrar la carga bacteriana después de la infección. Sia continuó proliferando en la mosca 24 horas después de la infección.

La actividad reportera de Lucifer mostró una gran variación entre las moscas individuales y entre el éxito de los puntos de datos. Aunque la señal se deriva de todos los tejidos dentro de la mosca, no se espera que todos los tejidos emitan la misma cantidad de señal y la visibilidad del tejido para el detector variaría a medida que la mosca se mueve. En este ejemplo, las moscas se infectaron y se compararon con un grupo de control manipulado.

Las moscas que murieron se excluyeron del análisis en un grupo de moscas. La actividad reportera de la luciferasa Kappa b aumenta constantemente después de la infección. La actividad del reportero de Kappa b Luciferase también aumentó constantemente después de una lesión aséptica.

El pico de actividad fue de alrededor de 12 horas tanto después de la lesión como después de la infección. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cuantificar la función inmune y el sueño en SSO después de la infección. Podemos medir el sueño, la supervivencia, el tiempo, la eliminación bacteriana y la actividad en tiempo real de un reportero de transcripción de copia un.