Trasplante de Schwann las células dentro de conductos de PVDF-TrFE a puente tocones de médula espinal de rata seccionado para promover la regeneración del axón a través de la brecha

El objetivo general de este procedimiento de intervención quirúrgica es utilizar un conducto lleno de células de Schwann y una matriz inyectable para establecer un puente entre los muñones de la médula espinal completamente seccionados para promover la regeneración de los axones a través del puente. Nuestro objetivo es puentear un sitio de lesión de la médula espinal en la rata para restaurar la función. La lesión que estamos utilizando es la creación de un espacio de transección completo.

Es solo mediante el uso de este tipo de lesión que podemos decir con seguridad que los axones se han regenerado cuando los encontramos en el sitio de la lesión. El puente que estamos utilizando es un canal de polímero que contiene células de Schwann, siendo las células de Schwann tan importantes para la regeneración de los axones. Mostramos en este vídeo cómo introducir un puente de este tipo en un espacio de transección completo.

Los investigadores nuevos en este método necesitarán práctica, ya que la transección completa de la médula espinal y la introducción del conducto pueden ser un desafío para los principiantes. Antes de comenzar el procedimiento, use una cuchilla número 10 para cortar el conducto a cinco milímetros. Esto también se puede realizar bajo un microscopio de disección si se prefiere.

Doble el conducto suavemente a lo largo del lado longitudinal y use unas tijeras Vannas de borde recto para cortar cuatro incisiones pequeñas de aproximadamente 0,4 milímetros de largo, al menos un milímetro de las aberturas y aproximadamente un milímetro de distancia. Luego, despliega el conducto y corta entre las dos incisiones a lo largo del mismo lado para crear dos ventanas una al lado de la otra, asegurándote de que las ventanas se puedan abrir y cerrar correctamente a lo largo del lado sin cortar. Para realizar la laminectomía T7-T9, después de confirmar una falta de respuesta al pinzamiento del dedo del pie en una rata Fischer hembra anestesiada de 180 a 200 gramos, localice el punto de referencia para las apófisis espinosas T9-T11.

Se sentirán como una pequeña protuberancia triangular a través de la piel. Con una cuchilla número 10, haga una incisión de cuatro a cinco centímetros en la línea media de la piel de T4 a T11, seguida de una pequeña incisión en la capa de grasa superficial con tijeras curvas de punta roma. Después de diseccionar la grasa, use la cuchilla número 10 para ubicar las apófisis espinosas T7-T9 y use pinzas romas para sostener el músculo aproximadamente T4. Hacer una incisión en el músculo a lo largo de cada lado de las vértebras desde T6 hasta T10 lo más cerca posible de las vértebras para hacer una abertura limpia y causar lesiones mínimas al animal.

Coloque el retractor alrededor de T7 a T9. Utilice la cuchilla número 10 para cortar los músculos y ligamentos entre el proceso individual de T6 a T10 y utilice un rongeur para eliminar cualquier músculo o ligamento de las láminas de T7 a T9 lo más lateralmente posible. Cuando los espacios entre las apófisis transversales de T7 a T9 sean visibles, use el rongeur para eliminar la apófisis espinosa T9, levantando suavemente la apófisis espinosa T8 con pinzas romas para elevar la lámina T9 en la pequeña abertura entre las apófisis T9 y T10. A continuación, utilice el rongeur para eliminar la lámina lo más lateralmente posible, empezando por la abertura y moviéndose rostralmente en T9. Cuando se hayan extirpado todas las láminas, confirme que los espacios entre las apófisis transversas son visibles, especialmente en T8, y examine los huesos a lo largo de ambos lados entre T7 y T9 para confirmar que no hay fragmentos óseos que sobresalgan hacia afuera y que las raíces dorsales deben volverse visibles.

Con unas tijeras de resorte en ángulo, corte las raíces dorsal y ventral por encima y por debajo de T8 y agregue solución salina a la médula espinal para ayudar a detener el sangrado. A continuación, coloque las tijeras de resorte en ángulo sobre la médula espinal en los espacios entre las apófisis transversas en T8 y haga un corte para cortar completamente el tejido nervioso. Coloque un pequeño trozo de espuma comprimida en el espacio resultante de dos a 2,5 milímetros e inmediatamente agregue solución salina al área.

Mientras espera que los muñones del cordón cortado alcancen la hemostasia, corte los triángulos de absorción en pedazos largos y delgados y retire un conducto del almacenamiento de PBS. Coloque algunos triángulos en el conducto para eliminar el exceso de PBS y confirme que las ventanas precortadas estén abiertas. A continuación, retire el medio de un pellet de células Schwann GFP y vuelva a suspender las células Schwann en 10 microlitros de DMEM/F-12 frío.

Agregue 10 microlitros de gel inyectable frío a la suspensión celular y mezcle bien con pipeteo repetido. Luego, coloque la suspensión de la celda sobre hielo. Cuando los muñones del cordón estén listos, retire la espuma comprimida y luego use piezas largas de los triángulos de absorción para eliminar la solución salina y la sangre del área de laminectomía.

Luego, use una micro espátula para levantar suavemente el tocón rostral y deslice el conducto sobre el tocón con las ventanas hacia arriba, teniendo cuidado de que todo el muñón esté insertado y que no haya un sangrado excesivo en el conducto. Levante suavemente el muñón caudal y deslice el otro extremo del conducto sobre él, teniendo cuidado de que todo el muñón esté insertado y que las ventanas estén en la superficie dorsal. A continuación, utilice una micropipeta equipada con una punta de carga de Western blot para inyectar 20 microlitros de la mezcla de matriz inyectable GFP Schwann Cell en el conducto a través de una de las ventanas precortadas y cierre las ventanas.

Una nota de advertencia. Es muy importante que los muñones del cordón se manipulen de la manera más rápida y cuidadosa posible. Un retraso puede causar hinchazón de los muñones, lo que dificulta el deslizamiento del conducto sobre la médula espinal, lo que crea más lesiones.

Tres semanas después del trasplante, las imágenes fluorescentes confocales de las secciones de tejido espinal sagital del criostato revelan una distribución uniforme de las células de Schwann a lo largo y dentro del conducto, así como de los vasos sanguíneos y los axones mielinizados dentro del centro del puente. La regeneración de axones también está estrechamente asociada con la presencia de células de Schwann, lo que confirma la eficacia del uso de un puente de células de Schwann dentro de un conducto estructurado para promover la regeneración de axones a lo largo del puente entre los muñones rostral y caudal. Una vez dominado, este procedimiento se puede completar en 45 minutos cuando se realiza correctamente.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el trazado EndoRay, para responder preguntas adicionales. Por ejemplo, ¿cuántos axones se regeneran en el puente y cuántos de ellos salen del puente para volver a entrar en la médula espinal? Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo seccionar la médula espinal, insertar un conducto e inyectar células dentro de una matriz para crear un puente confiable para la regeneración de axones y otras evaluaciones de resultados.