Neural Trasplante de células madre en Experimental contuso Modelo de Lesión de la Médula Espinal

El objetivo general de este procedimiento es describir en detalle un modelo de contusión de lesión de la médula espinal en ratones, seguido de un trasplante de células madre neurales. Esto se logra marcando primero las células postmortem, precursoras neurales o NPC PM con el trazador vital PKH 26. A continuación, se realiza una incisión dorsal en el ratón y se expone la médula espinal.

A continuación, se utiliza un dispositivo de horizonte infinito o impactador IH para crear una lesión en la médula espinal. Finalmente, los PM y PC etiquetados como PKH 26 se inyectan en la vena de la cola del ratón. En última instancia, se sigue el destino de PKH 20 6:00 PM y PC injertados en el sitio de la lesión.

El modelo de lesión replica al hombre con lesión medular. A la lesión mecánica primaria le sigue una degeneración secundaria progresiva donde se estudia el tratamiento celular y farmacológico. Las aplicaciones descritas pueden proporcionar una base metodológica para obtener más información sobre la fe.

Inducción de células madre trasplantadas a una médula espinal mientras se producen eventos degenerativos e inflamatorios. La demostración de la lesión estará a cargo del Dr. Tony Laja Longo, estudiante de doctorado en el laboratorio. Si bien la inyección de la cola será realizada por el Dr. Ache, que es un becario postdoctoral en el laboratorio, comenzando con células madre neurales que cumplan con los criterios descritos en el protocolo de texto.

Resus suspende las células a una concentración de uno por 10 a las seis células por 150 microlitros. Prepare al menos 1,2 veces 10 a las seis celdas por ratón para tener suficientes celdas para cargar la pipeta. Con el medio de células madre neurales, lave las células tres veces en un vial cónico de 10 mililitros, girando a 500 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente para granular las células.

Después de cada lavado, antes del recuento final de centrifugado, las células después del centrifugado, aspiran el sobrenadante, dejando unos 25 microlitros de líquido para evitar que se aspire ninguna célula. A continuación, prepare una suspensión de dos X añadiendo un mililitro de diluyente C al paladar celular y utilice un pipeteo suave para resuspenderla inmediatamente. Antes de teñir, prepare una solución de dos veces colorante en el diluyente C agregando cuatro microlitros de la solución de etanol D PKH 26 a un mililitro de diluyente C en un tubo y mezcle bien.

Para dispersar rápidamente, agregue un mililitro de suspensión de dos x celdas a un mililitro de solución de dos XD y mezcle inmediatamente la muestra mediante pipeteo. Después de incubar la suspensión de matriz celular durante uno a cinco minutos, detenga la tinción agregando un volumen igual de solución de BSA al 1% en HBSS e incube durante un minuto. A continuación, centrifugar las células a 500 veces G durante 10 minutos y retirar con cuidado el sobrenadante.

Utilice 10 mililitros de medio completo para resuspender el pellet celular para evaluar la recuperación celular, la viabilidad celular y la intensidad de fluorescencia. Centrifugar las células, desechar el sobrenadante y añadir 10 mililitros de HBSS al pellet de la célula. Lavar dos veces con HBSS y resuspender las células en una solución fisiológica estéril.

Después de preparar el área quirúrgica y un ratón de acuerdo con el protocolo de texto, coloque el animal con el lado dorsal hacia arriba en un calentador de portaobjetos para evitar la hipotermia durante la cirugía con un bisturí, haga una incisión vertical sobre la región de interés de T 7 a T 12 con fórceps. Sostenga la piel y la almohadilla de grasa superficial que se encuentran entre el espacio entre el quinto y el sexto proceso torácico bajo un microscopio estereoscópico. Cuente el proceso debajo del vaso sanguíneo como T seis, luego pase a T siete.

Luego coloque un pequeño cojinete debajo del lado ventral del ratón para aumentar la curvatura de la columna vertebral y use pinzas grof para bloquear la columna e inmovilizarla. A continuación, utilice un bisturí para cortar el par de los músculos vertebrales bilateralmente desde T 7 hasta T 10 a nivel vertebral hasta que la superficie dorsal de la lámina entre en contacto con la punta del bisturí. A continuación, utilice un bisturí para marcar la unión de T siete a T 10 a nivel vertebral hasta que la superficie dorsal de la lámina haga contacto con la punta del bisturí y se detenga en el espacio entre las pequeñas protuberancias T ocho y T nueve.

Luego use micro tijeras para cortar el tejido entre T ocho y T nueve y T nueve y T 10. Ahora use el rongeur para eliminar el proceso T nine. Exponga la unión usando microtijeras para raspar cuidadosamente la capa muscular.

Continúe hasta que el hueso quede expuesto. Use fórceps para extraer los músculos de la lámina y abrir un pequeño espacio entre las vértebras. A continuación, inserte suavemente las micro tijeras debajo del hueso.

Corta la lámina por ambos lados y usa las pinzas para extraerla, exponiendo el cordón. Use el ron jour para eliminar cualquier fragmento de hueso libre o dentado que quede. A continuación, retire la mitad superior de la apófisis dorsal T nueve.

Después de seguir el protocolo del dispositivo impactador IH, de acuerdo con las pautas del texto, use cuatro suturas absorbibles para cerrar la incisión cubriendo primero la médula espinal expuesta en el sitio de la lámina extraída. Tenga cuidado de no pellizcar los músculos subyacentes. Use dos o tres pinzas de reflejos para cerrar la piel.

Inyecte dos mililitros de solución salina en la parte baja de la espalda por vía subcutánea y coloque al ratón en una jaula precalentada sobre una almohadilla térmica para que se recupere. Para llevar a cabo una inyección de células en la vena de la cola. Vuelva a suspender las células en el tubo de ensayo y cargue 75 microlitros en una jeringa de 0,3 mililitros, asegurándose de que no haya burbujas en la suspensión de las células.

Para evitar la sedimentación celular, mantenga la jeringa en posición horizontal. Coloque el ratón debajo de la lámpara de calor para dilatar las venas de la cola. A continuación, tire suavemente del ratón hacia el sujetador para visualizar la vena lateral de la cola, que aparece como una línea azul estrecha.

Use un hisopo con alcohol para limpiar la cola y, una vez que se visualice la vena, agarre la vena de la cola entre el dedo medio y el pulgar de la mano izquierda. La contusión T nine demostrada en este video causó la pérdida transitoria de la función de las extremidades traseras tres veces que se inyectaron 10 a la quinta célula o PBS en la vena de la cola en tres inyecciones realizadas 30 minutos, seis horas y 18 horas después de la lesión. Como se muestra aquí, dentro de dos a tres semanas, PBS tratados lesionados, los ratones mejoraron y la función de las extremidades traseras alcanzó tres puntos de escala basal de ratón o BMS ratones tratados con PM. NPCs, sin embargo, mostraron una mayor recuperación y alcanzaron 4.5 puntos de BMS como se ve aquí, la mayoría de los PM NPCs injertados marcados con PKH 26, se acumularon en los bordes de la lesión formando grupos.

Poco después de la administración, las células trasplantadas migraron a lo largo de los bordes de la lesión y de una manera más difusa, donde se diferenciaron en neuronas. A los 30 días después de la lesión y el trasplante, el cuerpo celular de las NPC pm aumentó de tamaño y en la mayoría de las células, los procesos de tipo dendrítico eran obvios y completamente inmunes por los anticuerpos específicos para mapear al obtener este procedimiento, es importante recordar que las fuerzas más altas pueden aumentar la mortalidad en el animal debido a lesiones más graves. Por lo tanto, sugerimos utilizar nuestro paradigma de lesión que es seguido por un proceso de recuperación más reproducible.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo obtener un modelo experimental reproducible de lesión traumática de la médula espinal en el ratón mediante el uso del impactador de horizonte infinito.