Resolución súper correlativo y la microscopia electrónica para resolver la localización de la proteína en la Retina del pez cebra

Este protocolo describe los pasos necesarios para obtener resultados de localización subcelular de la proteína en la retina de pez cebra por microscopía de superresolución la correlación y análisis de imágenes de microscopia electrónica.

El objetivo general de este método de microscopía es localizar con precisión la expresión de proteínas en relación con diferentes orgánulos subcelulares en la retina de las larvas de pez cebra mediante la correlación de imágenes de microscopía electrónica de barrido y superresolución. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos del desarrollo de la retina y las vías celulares, como el estudio de la mala localización de proteínas en mutantes. La principal ventaja de esta técnica es que combina la superresolución con la microscopía electrónica de barrido para obtener datos de localización de proteínas de alta precisión dentro del contexto estructural de la muestra.

La colección de secciones de Tokuyasu en obleas de silicona facilita sustancialmente el manejo y el uso de sombras de platino para el contraste proporciona una buena topografía de la muestra. Por lo tanto, este método puede proporcionar información sobre los estudios de retina de larvas de pez cebra. Una de sus principales ventajas es que también se puede aplicar a muchos otros sistemas biológicos, como la identificación de la expresión de proteínas en el tejido de ratón.

Después de diseccionar los ojos de las larvas fijas de pez cebra de acuerdo con el protocolo de texto, caliente 15 mililitros de gelatina de marca de alimentos local al 12% en PBS a 40 grados centígrados. A continuación, aspire el PBS de los tubos de los ojos y añada la solución de gelatina. Golpee suavemente el tubo para asegurarse de que la gelatina se infiltre en la muestra e incube durante 10 a 30 minutos a 40 grados centígrados en un termobloque con agitación suave o en un baño de agua.

En un baño de agua a 40 grados centígrados, llene moldes de inclusión planos de silicona o polietileno de 12 por cinco por tres milímetros con gelatina tibia. Luego, usando una pipeta, agregue dos ojos por molde y debajo de un binocular use una aguja de disección para alinearlos correctamente. Después de dejar que la gelatina se enfríe a temperatura ambiente durante un minuto, colóquela a cuatro grados centígrados durante 20 minutos para que se endurezca.

Debajo de los binoculares, use una cuchilla de afeitar para volver a recortar el bloque de gelatina para que quepa en un ojo por bloque. Transfiera los ojos incrustados en gelatina a sacarosa 2.3 molar en PBS en hielo. Incubar las muestras a cuatro grados centígrados durante la noche.

A continuación, cambie las muestras por una solución fresca de sacarosa 2,3 molar. Y almacene el tejido a cuatro grados Celsius, o menos 20 grados Celsius para almacenarlo hasta varios meses. Vuelva a recortar el bloque de gelatina hasta casi el tamaño del ojo antes de transferirlo a un crio-pin.

A continuación, congele el bloque en nitrógeno líquido y transfiéralo a un crio-ultramicrótomo. Usando un cuchillo de diamante en el crio-ultramicrótomo, corte secciones de 110 nanómetros de grosor a menos 120 grados Celsius. Elija las secciones con un bucle alambrado que contenga una gota de 2% de metilcelulosa y 2,3 molar de solución de sacarosa.

Luego transfiera las secciones a una oblea de silicona de siete por siete milímetros. Para lavar las obleas, pipetee cuatro gotas y coloque las obleas boca abajo sobre las gotas. Incubar las obleas en las gotas a cero grados centígrados durante 20 minutos.

Luego lave las obleas dos veces en PBS a temperatura ambiente durante dos minutos cada una. Incubar las muestras tres veces en glicina al 0,15% en PBS durante un minuto cada una. A continuación, utilice PBS para lavar las muestras tres veces durante un minuto por lavado.

Preincubar el tejido con PBG durante cinco minutos. A continuación, agregue conejo anti-Tom20 en PBG a las secciones. E incubar las obleas a temperatura ambiente durante 30 minutos.

Con PBG, lave el pañuelo seis veces durante un minuto por lavado. A continuación, preincube las muestras con PBG a temperatura ambiente durante cinco minutos. Reemplace el PBG con fragmentos de Fab divalentes anti-conejo Alexa 647 en PBG e incube durante 30 minutos.

Lave las muestras en PBG seis veces durante un minuto por lavado. Luego use PBS para lavar las obleas tres veces durante dos minutos. Agregue DAPI y PBS a las obleas e incube durante 10 segundos.

A continuación, utilice PBS para lavar las muestras dos veces durante dos minutos cada una. Coloque la oblea en una gota de una solución uno a uno de glicerol al 80% y tampón de imagen que contenga un sistema de eliminación de oxígeno e incube brevemente. Transfiera las obleas, con el pañuelo hacia abajo, a una gota fresca de la mezcla uno a uno de 80% de glicerol y tampón de imagen en una placa de Petri con fondo de vidrio.

Use una pipeta desde todos los lados para eliminar la mayor parte del líquido debajo de la oblea. Luego use tiras de silicona para fijar la oblea al fondo de la placa de Petri. Coloque las secciones montadas en un microscopio invertido con un objetivo de inmersión en aceite de alta apertura numérica.

Antes de la toma de imágenes, deje que la muestra se equilibre a la temperatura del microscopio para minimizar o reducir la deriva lateral y axial. Centre el área de interés y adquiera imágenes de referencia de epifluorescencia de campo amplio. Cambie al modo de operación de superresolución.

Ajuste el tiempo de exposición de la cámara a 15 milisegundos y ajuste la ganancia de multiplicación de electrones al máximo de 300. A continuación, ilumine la muestra en modo de epifluorescencia con el láser de 642 nanómetros a la máxima potencia láser. Tan pronto como la molécula individual parpadea está bien separada en cada fotograma, de modo que la probabilidad de que las señales individuales se superpongan es baja, reduzca la potencia del láser a casi 1/3.

Grabe la imagen en bruto en epifluorescencia adquiriendo un mínimo de 30.000 fotogramas. A partir de los datos sin procesar, en Herramientas, el análisis de la serie t utiliza un umbral de detección de 30 fotones. Haga clic en Evaluar para generar una lista de eventos de localización.

En Herramientas, en el panel Procesamiento de la lista de eventos, haga clic en Crear imagen para visualizar la imagen de superresolución mediante el ajuste gaussiano, aplicando un tamaño de píxel de representación de cuatro nanómetros. Retire las tiras de silicona y agregue una gota de PBS cerca de los bordes de la oblea para levantarla de la placa de Petri. Después de usar PBS para lavar la oblea dos veces durante dos minutos cada una, use 0.1% de glutaraldehído en PBS para fijarla posteriormente durante cinco minutos.

A continuación, vuelva a lavar la muestra dos veces durante dos minutos por lavado en PBS. Incubar la oblea en una gota de metilcelulosa al 2% en agua sobre hielo dos veces durante cinco minutos por incubación. Luego inserte la oblea en un tubo de centrífuga y centrifugue a 14, 100 veces g durante 90 segundos.

Después del centrifugado, use cemento de carbono conductor para montar la oblea en un trozo de aluminio SEM. Usando un dispositivo de evaporación por haz de electrones, agregue una capa de dos a 10 nanómetros de carbono de platino en la muestra mediante sombreado giratorio con los siguientes ajustes. Secciones de imágenes con un microscopio electrónico de barrido a 1,5 kilovoltios, a una distancia de trabajo de dos milímetros, y con un detector de electrones secundarios en la lente.

Utilice Fiji para abrir imágenes de microscopía óptica y electrónica haciendo clic en Archivo, Abrir. Ajuste el tamaño del lienzo haciendo clic en Imagen, Ajustar, Tamaño del lienzo. A continuación, lleve ambas imágenes a una pila haciendo clic en Imagen, Pilas, Imágenes para apilar.

En Fiji, abra una nueva interfaz de pista EM2 haciendo clic en Archivo, Nuevo, Pista EM2 nuevo. Importe la pila con ambas imágenes haciendo clic con el botón derecho en la ventana negra y seleccionando Importar pila. Alinee la imagen de microscopía óptica con la imagen de microscopía electrónica manualmente con puntos de referencia haciendo clic con el botón derecho del ratón en la imagen y seleccionando Alinear, Alinear capa manualmente con puntos de referencia.

Elija la herramienta Seleccionar para agregar puntos de referencia. Utilice la forma de los núcleos como referencia para seleccionar los mismos bordes en ambas imágenes y para añadir varios puntos. Aplique la alineación con un modelo afín haciendo clic con el botón derecho y seleccione Aplicar transformación, Modelo afín.

Por último, cambie la transparencia de la capa para evaluar la calidad de la alineación. Este panel muestra una imagen de campo amplio de baja ampliación de una sección de retina de pez cebra de cinco días después de la fertilización. La misma área se muestra aquí mediante microscopía electrónica de barrido.

Estas imágenes de mayor aumento muestran Tom20 teñido en rojo con grupos en las mitocondrias. Aquí se muestra la expresión de Tom20 detectada por microscopía GSDIM. En esta imagen, la misma sección combina la superresolución correlativa y la microscopía electrónica de barrido.

La tinción de Tom20 aparece dentro del grupo mitocondrial en las membranas externas de las mitocondrias. La señal de fluorescencia DAPI en los núcleos se corresponde con la topografía de la imagen SEM. Esta imagen SEM proporciona contexto a la tinción Tom20 en la imagen GSDIM.

Las crestas mitocondriales son claramente visibles y la tinción de Tom20 se localiza en las membranas externas de las mitocondrias. Las membranas del segmento externo de los fotorreceptores están claramente resueltas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar optimizar lo mejor posible los parámetros de etiquetado e imagen.

Solo las muestras etiquetadas de forma óptima son adecuadas para la superresolución. Las muestras nunca deben secarse en ningún momento durante el procedimiento de etiquetado. Este procedimiento podría extenderse a la inmunofluorescencia de doble marcaje y, por lo tanto, permitir la localización de dos proteínas diferentes dentro de una estructura específica.

En el caso de muestras más complejas, se recomienda el uso de marcadores de referencia para obtener una alineación precisa de las imágenes. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar estudios correlativos para localizar proteínas en relación con los diferentes orgánulos de la célula en una muestra de tejido compleja con una precisión de súper resolución.